Name: Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis y sus subcompartimentos (envoltura, estroma y tilacoides) mediante centrifugación diferencial y gradientes de Percoll y sacarosa. Este método permite localizar proteínas específicas en cada fracción para estudios de bioquímica vegetal.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de doctorado conjunta a IB del INRA planta biología y cría de división y de la GRAL Labex (ANR-10-LABX-49-01). También quisiéramos reconocer el proyecto ANR ANR-15-IDEX-02, el Dr. Olivier Vallon (IBPC París) para anticuerpos contra LHCP y Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) para anticuerpos contra KARI.

1. preparación de Buffers y soluciones Stock gradientes
<ol><li>Preparar las siguientes soluciones stock que pueden ser almacenadas 6 meses a 4 ° C.<ol>
<li>Preparar 1 L de tampón tricino (1 M, pH 8,4) y tampón tricino (1 M, pH 7.6). Ajustar el pH mediante la adición de KOH pellets.</li>
		<li>Preparar 1 L de ácido de etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,5 M, pH 8) y 3-(N-morpholino) propano ácido sulfónico (MOPS) tampón (1 M, pH 7.8). Ajustar el pH mediante la adición de NaOH pellets.</li>
		<li>Preparar 50 mL de MgCl2 (1 M).</li>
		<li>Preparar 50 mL de proteasa inhibidores soluciones: phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF en isopropanol, 100 mM), benzamidine hidrato del clorhidrato (100 mM) y el ε-amino caproico ácido (50 mM). Nota: Mientras PMSF y ácido amino caproico son estables en solución durante meses a 4 ° C, benzamidine solución debe almacenarse a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar las siguientes soluciones el día antes del experimento y almacenar todas las soluciones a 4 º C.<ol>
<li>Preparar 4 L de pulido medio pH 8,4 con Tricina-KOH (20 mM, pH 8,4), sorbitol (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) y NaHCO3 (10 mM). Ajustar el pH mediante la adición de NaOH pellets. Añadir albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1% (p/v) justo antes de usar y mezclar bien.</li>
		<li>Preparar 500 mL de lavado pH medio (2 x) 7.6 con Tricina-KOH (20 mM, pH 7.6), sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) y EDTA (2,5 mM). Ajustar el pH mediante la adición de NaOH pellets. Diluir esta solución después de la preparación de la solución gradiente de Percoll para obtener el medio de lavado (1 x).</li>
		<li>Preparar 200 mL de solución gradiente de Percoll para la purificación del cloroplasto mediante la mezcla de Percoll con medio de lavado (2 x) en un volumen igual a una solución final al 50% (v/v) de Percoll / 0,4 M sorbitol.</li>
		<li>Preparar 50 mL de soluciones de sacarosa para el fraccionamiento de cloroplasto mezclando MOPS (10 mM, pH 7.8), MgCl2 (4 mM) y diferentes concentraciones de sacarosa (0,3 M, 0,6 M y 0,93 M).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar los siguientes gradientes y búferes antes de comenzar el experimento.<ol>
<li>Preparar seis tubos de gradientes de Percoll (cada una conteniendo 30 mL de un 50% Percoll / sorbitol de 0,4 M) por centrifugación a 38.700 x g durante 55 minutos a 4 ° C. Mantenga el freno lejos para evitar la mezcla de los gradientes. Después de la centrifugación, almacenar los tubos que contienen los gradientes preformados en un cuarto frío hasta su uso.</li>
		<li>Preparar cuatro tubos de gradientes de sacarosa, con cada gradiente formado por tres capas de sacarosa siguientes: 3 mL de 0,93 M, 2,5 mL de 0,6 M y 2 mL de sacarosa de 0,3 M. Cuidadosamente el recubrimiento cada capa, utilizando una bomba peristáltica a partir de 0,93 M en la parte inferior y finalizando con 0,3 M en la parte superior.</li>
		<li>Preparar 50 mL de medio hipotónico para lisis de cloroplasto que contiene MOPS (10 mM, pH 7.8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, en isopropanol), benzamidine hidrato del clorhidrato (1 mM) y ε-amino caproico ácido (0.5 mM). Almacenar el buffer en hielo hasta su uso.</li>
		<li>Preparar 50 mL de tampón que contiene MOPS (10 mM, pH 7.8), PMSF (1 mM), benzamidine hidrato del clorhidrato (1 mM) y ε-amino caproico ácido (0.5 mM) se lava la membrana. Almacenar el buffer en hielo hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. crecimiento y recolección de hojas de Arabidopsis
<ol><li>Para el crecimiento de las plantas de Arabidopsis , preparar 4 bandejas de plástico grandes (para una superficie total de 0,5 a 1 m2) de las plantas Arabidopsis siembra 30 mg de semillas en cada recipiente. Crecen plantas de Arabidopsis por 5 semanas en el ciclo de luz de 12 h a 23 ° C (día) / 18 ° C (noche) con una intensidad de luz de 150 μM m-2 s-1.</li>
	<li>Incubar las plantas en una habitación oscura y fría (4 ° C) durante la noche antes del experimento (para reducir la cantidad de gránulos de almidón en los cloroplastos).</li>
	<li>La pesa un vaso de precipitados de 1 L y luego la coloque en hielo antes de comenzar la cosecha de la hoja.</li>
	<li>Cosecha de hojas de Arabidopsis evitando suelo (compost). Volver a pesar el vaso de precipitados y registrar el peso del tejido. Nota: se espera que 400 a 500 g de la hoja de cuatro de la cazuelas.</li>
	<li>Homogeneizar las hojas en una cámara fría con 2 L de tampón de pulir (Añadir BSA antes de usar) tres veces / 2 s cada vez, en una licuadora a alta velocidad.</li>
	<li>Filtrar el homogeneizado en una cámara fría con 4 capas de muselina y una capa de nylon blutex. Apriete suavemente las hojas de homogeneizado dentro de la muselina nylon blutex para extraer todo el líquido.</li>
	<li>Recuperar el tejido restante en el vaso de la licuadora para una segunda extracción. Repita los pasos del 2.5 y 2.6 en 2 L de molienda media y nueva 4-5 capas de muselina (cuarto frío).</li>
</ol>3. purificación del crudo cloroplastos mediante centrifugación diferencial
<ol><li>Igualmente distribuimos el extracto crudo de la célula en seis botellas de 500 mL y coloque las botellas en el hielo antes de la centrifugación. Centrifugar durante 2 min en cuanto se alcanza la velocidad máxima (2.070 x g) (máxima aceleración y freno en 4 ° C).</li>
	<li>Descartar cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante restante utilizando una bomba de agua y mantener los gránulos que contienen cloroplastos crudos concentrados en el hielo.</li>
	<li>Resuspender suavemente pellets mediante la adición de un volumen mínimo de medio de lavado (1 x) (volumen final de las suspensiones de cloroplasto combinado = 36 mL) con un pincel o una espátula de plástico curva. Utilice una pipeta de 10 mL para agregar 3 mL de medio en cada botella de lavado. Nota: No utilice pipeta con punta muy fina para evitar rotura de cloroplastos. Por otra parte, cortar la punta azul de una pipeta con una cuchilla de afeitar para generar un agujero más grande.</li>
	<li>Recopilar los cloroplastos resuspendidos en un tubo con una pipeta de 10 mL. Mezclar suavemente por inversión del tubo para obtener una suspensión homogénea antes de cargar en gradientes de Percoll.</li>
</ol>4. purificación de cloroplastos intactos en continuo gradiente de Percoll
<ol><li>Lentamente la carga 6 mL de la suspensión de cloroplasto en la cima de cada uno de los seis gradientes de Percoll utilizando una pipeta de 10 mL para evitar la rotura de cloroplastos.</li>
	<li>Los gradientes por 10 min a 13.300 x g, 4 ° C utilizando un balde de balanceo de rotor de centrífuga. Nota: La aceleración debe ser lenta, y se debe desconectar el freno (freno off o desaceleración lenta) para evitar la mezcla de los gradientes de Percoll.</li>
	<li>Aspirar la fase superior que contiene rotos cloroplastos y las mitocondrias intactas con una bomba de agua y luego recuperar intactos cloroplastos presentes en la parte baja de la fase (la banda ancha de color verde oscuro) con una pipeta de 10 mL. Tenga cuidado de no aspirar los núcleos y restos de células (que se encuentra en la parte inferior del tubo) con los cloroplastos intactos (figura 2A).</li>
	<li>Diluir 3-4-veces la suspensión del cloroplasto intacto con tampón de lavado (1 x). Centrifugar durante 2 min en cuanto se alcanza la velocidad máxima (2.070 x g, 4 ° C) (máxima aceleración y freno).</li>
	<li>Descartar cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Totalmente aspirar el sobrenadante restante con una bomba de agua y mantener el pellet de cloroplastos intactos concentradas en el hielo.</li>
	<li>Antes de lisis de cloroplasto, mantener una alícuota de la fracción de cloroplasto intacto en aproximadamente 1 mL de medio (1 x) para el posteriores análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y western blot de lavado. Mantenga una pequeña alícuota de estos cloroplastos intactos para la determinación de la concentración de proteína. Almacenar la fracción cloroplasto intacto en nitrógeno líquido para experimentos adicionales.</li>
</ol>5. lisis de cloroplastos intactos usando un tampón hipotónico y purificación de los compartimientos del cloroplasto en gradientes de sacarosa discontinuas
<ol><li>Lyse los cloroplastos intactos purificados por Resuspender el sedimento en medio hipotónico que contiene inhibidores de la proteasa (el volumen final no debe exceder 12 mL). Nota: De este paso, el uso de la pipeta con finas puntas (puntas azul) es posible puesto que la integridad de los cloroplastos es no más esencial (pipeteo cloroplastos hacia arriba y hacia abajo como pellets no es enteramente suspendidas). Cloroplastos de Arabidopsis son muy frágiles (en comparación con cloroplastos de guisante, por ejemplo) y su lisis es casi inmediato después de la incubación en medio hipotónico.</li>
	<li>Carga lentamente 3 mL de los cloroplastos sometidas a lisis en la parte superior de cada gradientes de sacarosa preformado usando una bomba peristáltica.</li>
	<li>Ultracentrífuga los gradientes de h 1 (x 70.000 g, 4 º C). Equilibrio de pares de tubos utilizando tampón hipotónico medio antes de centrifugar.</li>
	<li>Recuperar con cuidado las proteínas solubles del estromales transfiriendo la fase superior del gradiente (3 mL de cada gradiente) (figura 2B). Tomar una alícuota para la determinación de proteína concentración7. Guarde el tejido conectador en nitrógeno líquido para experimentos adicionales.</li>
	<li>Aspirar la fase superior restante de cada gradiente hasta la franja amarilla utilizando una bomba de agua.</li>
	<li>Recuperar la franja amarilla (la envoltura) con una pipeta (aproximadamente 1 mL de cada gradiente). Los sobres en un tubo de la piscina.</li>
	<li>Quitar la fase restante de cada gradiente hasta el perdigón de tilacoides usando una bomba de agua.</li>
</ol>6. lavado y concentración de tilacoides y sistemas de membrana envolvente
<ol><li>Resuspender los tilacoides pellets (bolitas verdes) en un volumen mínimo (2 mL) de tampón (1 x) (con inhibidores de la proteasa) se lava la membrana.</li>
	<li>Diluir las suspensiones sobre y tilacoides 3-4-fold en medio de lavado de membrana (ajustar el volumen a 10 mL) y ultracentrífuga para 1 h (110.000 x g, 4 º C). Balance de pares de tubos utilizando membrana lavado tampón antes de centrifugar.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el sobrenadante usando una bomba de agua.</li>
	<li>Agregar aproximadamente 100 μl de tampón (con inhibidores de la proteasa) para el sedimento de la envolvente se lava la membrana. Tomar una alícuota para la determinación de proteína concentración7. Guardar la preparación de la membrana de envoltura purificada en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de tilacoides en 3 mL de tampón (con inhibidores de la proteasa) se lava la membrana. Tomar una alícuota para la determinación de proteína concentración7. Guarde la fracción de la membrana del thylakoid en nitrógeno líquido.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente artículo tiene como objetivo detallar el protocolo paso a paso utilizado para purificar los cloroplastos (y sus sub-compartimentos) de Arabidopsis thaliana. Desde la disponibilidad de su secuencia de genoma completa hace casi dos décadas y de grandes colecciones de mutantes de inserción a la comunidad, Arabidopsis ahora se acepta extensamente como una planta modelo. Sin embargo, aunque esta planta se ha adaptado perfectamente para enfoques genéticos, los científicos de planta necesitan para adaptar herramientas bioquímicas y fisiológicas a este modelo emergente. Protocolos que permiten purificar fotosintéticamente activas cloroplastos de hojas de modelos bioquímicos bien establecidos como espinaca12 o guisante13 así tuvieron que ser adaptado. El primer método que describe la purificación de cloroplastos de Arabidopsis fue publicado en 199814, justo antes del lanzamiento de la secuencia del genoma de Arabidopsis . Varios años más tarde, simples métodos para aislar cloroplastos de Arabidopsis compatibles con estudios, con el objetivo de analizar en vitro la importación de proteínas en los organelos purificados fueron hechos disponibles15,16. Sin embargo, estos métodos no permiten para combinar el alto nivel de pureza y conservación de la actividad fotosintética de los cloroplastos purificados. Más recientemente se estableció17, un método rápido, que se basa en el uso de gradientes de Percoll y permite mantener casi el 90% de la tasa de fotosíntesis en las hojas a partir de Arabidopsis.
El protocolo aquí descrito permite para purificar Arabidopsis cloroplastos en un excelente nivel de pureza. De hecho, la detección inmunológica de contaminantes de otros compartimentos celulares demostró que los organelos purificados están desprovistas de mitocondrial y marcadores de membrana plasmática9,10. Este protocolo también fue eficaz para purificar cloroplastos de varios Arabidopsis ecotipos18, como Colombia (Col) o Wassilewskija (WS), es decir, la secuencia de los ecotipos que se utiliza para el genoma o expresados tags (ESTs) secuenciación proyectos sino también a generar a mutantes de inserción de T-DNA en Arabidopsis. En otras palabras, cuando se realiza estudios de proteómica, el presente Protocolo es compatible con estos dos ecotipos de referencia de Arabidopsis. Por último, el rendimiento de cloroplastos mediante el presente Protocolo es similar a la obtenida cuando a partir de hojas de espinacas o guisantes (es decir, 3%, medida por el contenido de clorofila en el cloroplasto de Percoll purificada en comparación con el total cantidad de clorofila presente en el inicio de las hojas). En cuanto a proteínas, la producción es cerca de 50 mg de proteínas del cloroplasto, cuando organelos son purificados de 500 g de hojas de Arabidopsis de 5 semanas de edad.
Para alcanzar tal buen rendimiento (e integridad de cloroplasto), sin embargo uno debe prestar atención especial a varios pasos cuando se utiliza el presente Protocolo. El cloroplasto en Arabidopsis es una estructura muy frágil (este no es el caso de cloroplastos de guisante, por ejemplo). Atención específica por lo tanto es necesaria para evitar la ruptura en gran escala de los orgánulos durante la purificación. El número y tamaño de los gránulos de almidón presentes en los cloroplastos son esenciales para la preparación de cloroplastos intactos. De hecho, cloroplastos que contienen granos de almidón grandes generalmente se rompe durante los pasos de centrifugados diferencial inicial con el objetivo de concentrar el cloroplasto crudo fracciones12. Por lo tanto, las plantas se deben mantener durante la noche en una habitación oscura y fría (4 ° C) antes del experimento, para reducir la cantidad de almidón.
Nuevos usuarios del presente Protocolo podrían sentir la tentación de partir de grandes cantidades de la hoja (los enormes rosetones de viejas plantas de Arabidopsis con hojas más grandes) tratando de mejorar la recuperación de cloroplastos purificados. Sin embargo, en nuestras manos, a partir de hojas jóvenes (de 5 semanas de edad) es el mejor compromiso para combinar el rendimiento, la pureza y la integridad de los organelos purificados. De hecho, hojas muy viejas se enriquecen altamente en compuestos fenólicos que fueron demostrados para tener un impacto negativo en el cloroplasto integridad19.
Por último, el paso inicial de la extracción (molienda del tejido) es un paso crítico. El proceso de licuado debe limitarse a pocos segundos. Como se indicó anteriormente, nuevos usuarios podrían verse tentados a utilice la fusión más larga, esperando así mejorar fuertemente el rendimiento de los organelos purificados. Sin embargo, si mezcla más efectivamente lanza más material de las hojas, parece que la proporción de cloroplastos rotos aumenta rápidamente en el extracto crudo de la célula. Debido a esta alta relación de roto a cloroplastos intactos en el medio, más pasos de purificación (separación en gradientes de Percoll) son afectadas fuertemente y el rendimiento de la purificación es inesperadamente bajo.
Disponibilidad de protocolos específicos para purificar orgánulos han permitido una serie de alto rendimiento basada en proteómica experimentos sobre muestras de cloroplasto. Estos datos se presentaron en varias bases de datos públicas6, permitiendo a los biólogos en el campo una precisa localización subcelular (y subplastidial) para muchas proteínas del cloroplasto. Esto era especialmente verdad para las proteínas de la envoltura cuya identidad y ubicación seguía siendo sobre todo desconocida antes de estos análisis, puesto que las membranas de la envoltura representan un componente menor del cloroplasto (1-2% de las proteínas del cloroplasto) jugando un papel clave en el cloroplasto metabolismo y biogénesis de5,20. Utilizando el protocolo descrito aquí, hemos analizado recientemente la composición de los tres compartimientos principales de cloroplasto de Arabidopsis (es decir, el estroma, los tilacoides y el sistema de membrana envolvente)9. Basado en un enfoque semi-cuantitativo de Proteómica (contando espectral), pudimos evaluar el repartir de cientos de proteínas en estos tres compartimientos del cloroplasto.
Mientras que el presente Protocolo permite para purificar los tres compartimientos principales del cloroplasto de Arabidopsis, también es posible distinguir adicional los compartimientos en el cloroplasto. El sistema de membranas de la envoltura es de hecho, el interior y las membranas de la envoltura externa (figura 1). Sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento, un método para purificar las membranas interna y externa de la envoltura de Arabidopsis cloroplastos queda por establecerse. Membranas interna y externa de la envolvente pueden ser purificadas de cloroplastos de espinaca21 o guisante22 . La principal limitación de Arabidopsis resulta sobre todo de las cantidades limitantes de material de partida. A partir de 500 g de hojas de Arabidopsis (que ya requiere 1 m2 superficie en una cámara de crecimiento) permite sólo 100 μg de proteínas de la envoltura de la purificación. Por otra parte, es fácil comenzar con 5-10 kg de espinaca hojas del mercado, para purificar gran cantidad de cloroplastos8 y para terminar con un rendimiento de 3 a 10 mg de proteínas de la envoltura de este material.
Lo mismo vale para los compartimientos de tilacoides. Tilacoides son de hecho, de la luz vesículas de membrana (laminillas) y estructuras densas (grana) (figura 1). Existen protocolos específicos distinguir estos dos compartimientos en Arabidopsis23,24. Otra vez, basado en un análisis de proteómica cuantitativa, recientemente inventariado las proteínas presentes en estos dos sub-compartimientos24. Estos enfoques, junto con una investigación en profundidad de la literatura, permiten validar, o proponer hipótesis para la ubicación de subplastidial de cientos de proteínas de tilacoides. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los microdominios de membrana adicional están presentes en los márgenes curvos de tilacoides. Estos sub-compartimientos lipoproteína, o plastoglobules, permanentemente están acoplados a la membranas tilacoides y contienen un conjunto específico de proteínas25. Mediante el presente Protocolo, por lo tanto no es posible distinguir estas proteínas específicas de otros componentes de tilacoides.
Algunos componentes (bien conocidos) originales de la envoltura, estroma y tilacoides carecen aún de las listas de proteínas detectadas. Junto con los análisis bioquímicos e inmunológicos específicos, la mejora continua de la sensibilidad de MS será de gran ayuda para revisar el contenido del cloroplasto hacia un repertorio completo de la composición de sus diversos compartimentos sub.

Cloroplastos son componentes principales de las células vegetales. Derivan de un antepasado de cianobacterias que ha experimentado una Endosimbiosis y eventualmente evolucionó como un orgánulo durante evolución1,2. Estos organelos contienen tres principales compartimentos (figura 1). El sistema sobre se hace de un interior y un exterior membranas que rodean El organelo. Este sistema de doble membrana contiene diversos enzimas que intervienen en el metabolismo de lípidos y pigmentos y en su mayoría se dedica al control de la comunicación entre los plastidios y el citosol. Contiene varios sistemas de transporte que permiten la importación de proteínas nucleares codificados y el intercambio de iones y metabolitos entre el citosol y el cloroplasto así regular las funciones metabólicas esenciales de la planta de la célula3,4 . El estroma, la fase soluble del cloroplasto, contiene las enzimas del ciclo de Calvin (asimilación de CO2 ), la síntesis de varios metabolitos incluyendo aminoácidos y vitaminas y los mecanismos de transcripción y traducción del Plastidio. La membrana del thylakoid es una red de membrana interna ampliamente organizado donde realiza la fase de la luz de la fotosíntesis. Por lo tanto, los cloroplastos son el lugar donde las vías metabólicas esenciales ocurren5.
Para descifrar nuevos mecanismos reguladores que controlan la dinámica del cloroplasto y la fisiología, definiendo la localización sub-plastidial de proteínas del cloroplasto es así fundamental para estudios específicos con el objetivo de comprender mejor las funciones de las proteínas en el modelo de los organismos6. Para acceder a la localización de subplastidial genuino de estas proteínas, por lo tanto es esencial a partir de fracciones de alta pureza subplastidial (membranas de envoltura, estroma y tilacoides). En este contexto, el objetivo del presente Protocolo es purificar cloroplastos intactos de hojas de Arabidopsis usando diferencial centrifugados y continuados gradientes de Percoll y fraccionarlos mediante gradientes de sacarosa discontinuas, en tres los compartimientos (es decir, envoltura, estroma y tilacoides). El método descrito aquí también proporciona instrucciones para determinar la pureza de las fracciones purificadas de organellar sub utilizando marcadores asociados a los diferentes compartimentos el cloroplasto. Este protocolo es útil para la localización de la subplastidial de proteínas mediante immunoblotting y para su posterior análisis de fracciones purificadas mediante espectrometría de masas (MS)-basado en estudios de proteómica.

<table><tbody><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Roth</td><td>6977.2</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Promega</td><td>H5032</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>8551.1</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Roth</td><td>8076.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr><tr><td>&épsilon;-ácido aminocaproico</td><td>Fluka</td><td>21530</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfónico de propano (MOPS) 3-(N-morfolino)</td><td>Roth</td><td>6979.3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Roth</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>Stock de acrilamida: 30% (p/v) de acrilamida, 0,8% (p/v) de bisacrilamida</td><td>Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T-8133</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Roth</td><td>9592.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>USB</td><td>US12370</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>Medio de tinción en gel</td><td>Clini-sciences</td><td>GEN-QC-STAIN</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>CARLO ERBA</td><td>528151</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada en polvo</td><td>R&eacute; gilait</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>H/1150/PB15</td><td></td></tr><tr><td>KOH pellets</td><td>Sigma</td><td>1.05012</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de NaOH</td><td>CARLO ERBA</td><td>480507</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo</td><td></td> anti-HMA1 <td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td><td>Utilizado en una dilución 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo</td><td></td> anti-KARI <td>Ferro et al, 2010</td><td>Se utiliza en una dilución de 1:1000</td></tr><tr>Anticuerpo <td></td><td>anti-LHCP</td><td>Vallon et al, 1991</td><td>Utilizado en una dilución de 1:25.000</td></tr><tr><td>Ácido P-cumárico</td><td>Sigma</td><td>C-9008</td><td></td></tr><tr><td>Luminol (3-aminophalhidracina)</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO).</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Cajas de plástico grandes (30 cm y veces; 45 cm)</td><td>Semillas</td><td></td> de Puteaux 162135<td></td></tr><tr><td>A. thaliana</td><td>Alrededor de 30 mg de semillas para una caja entera</td>Compost "Floragard"Puteaux 16311770 Salas de crecimiento <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Ciclo de luz de 12 horas, ajustado a 23 grados; C (día) / 18&deg; C (noche) con una intensidad de luz de 150 &mu; mol/m2/s.</td></tr><tr><td>Muselina o gasa</td><td>Raffin</td><td>70116</td><td>80 cm de largo</td></tr><tr><td>Blutex de nailon 50 &mu; m apertura</td><td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td><td></td><td>50 &mu; Apertura m</td></tr><tr><td>Mezclador accionado por motor, tres velocidades, capacidad de 1 galón (4 L)</td><td>Batidora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waring Rotores de ángulo fijo JLA-10.500 (6 veces; botellas de plástico de 500 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor Beckman JA-20</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA-20 (6 veces; tubos de polipropileno de 50 mL)</td><td>Instrumentos</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SorvallRotor de cubeta oscilante JS-13.1 (6 y veces; tubos de policarbonato de 50 mL)</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti (6 veces; tubos ultratransparentes de 13,2 mL)</td>Tubos de rotor <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti (tubos ultratransparentes de 13,2 mL)</td>Ultracentrífuga <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Beckman L7)</td>Centrífuga <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Beckman JSE-06D18)</td><td>Microcentrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf 5415D o equivalente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de agua conectada a una pipeta Pasteur a través de un tubo de plástico.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranas de nitrocelulosa</td><td>BA85, Schleicher y Schuell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>3MM, Whatman, Maidstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Aparato de electroforesis con los diversos accesorios necesarios para la separación de proteínas por electroforesis (peines, placas y aparato de fundición).</td><td>Bio-Rad Protean 3 o equivalente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema para la transferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa</td><td>Bio-Rad Protean 3 o equivalente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de compartimientos los cloroplasto de arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por immunoblotting o proteómica

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Cloroplastos son componentes principales de las células vegetales. Estos plástidos cumplan muchas funciones cruciales, como la asimilación de carbono, azufre y nitrógeno, así como síntesis de metabolitos esenciales. Estos orgánulos constan de los siguientes tres compartimentos claves sub. La envolvente, caracterizada por dos membranas, rodea El organelo y controla la comunicación de plastid con otros compartimentos de la célula. El estroma constituye la fase soluble de cloroplasto y el sitio principal donde se convierte dióxido de carbono en hidratos de carbono. La membrana del thylakoid es la membrana interna de grana (planos comprimidos sacos) y laminillas (menos densas estructuras), donde oxygenic fotosíntesis ocurre. El presente Protocolo describe paso a paso los procedimientos necesarios para la purificación, utilizando gradientes de Percoll, de cloroplastos intactos de Arabidopsisy su fraccionamiento y centrifugados diferencial, utilizando gradientes de sacarosa, en tres los compartimientos (es decir, envoltura, estroma y tilacoides). Este protocolo también proporciona instrucciones sobre cómo evaluar la pureza de estas fracciones utilizando marcadores asociados a los diferentes compartimentos el cloroplasto. El método descrito aquí es valioso para la localización de la subplastidial de proteínas mediante immunoblotting, sino también para subcelular y subplastidial proteómica y otros estudios.

Pasos sucesivos del procedimiento resultando en cloroplasto purificada y sus secundario-compartimentos se reanudan en la figura 2. El gradiente de Percoll (figura 2A) permite distinguir cloroplastos intactos de roto cloroplasto y mitocondria (parte superior del gradiente) o núcleos y restos celulares (abajo del gradiente). Después de la ruptura de los organelos purificados de Percoll gracias a un choque osmótico, las fracciones resultantes se separan en un gradiente de sacarosa (figura 2B). El estroma (parte soluble del cloroplasto) está flotando en la superficie de la gradiente de sacarosa. Las vesículas de membrana envolvente luz se recuperan como una discreta franja amarilla en la interfaz de sacarosa de 0.6/0.93 M. Las vesículas de membranas tilacoides más pesadas se concentran en la parte inferior del tubo. Después de la recuperación, lavado y concentración de las fracciones de dos membranas, las proteínas se cuantifican y se analiza la composición de los cuatro fracciones en un SDS-PAGE (figura 2). Los carriles se cargan en una base de proteína igual (20 μg de cada fracción purificada). Sabiendo que los cloroplastos contienen sólo 1% de las proteínas de la envoltura y el 50% de las proteínas del estroma o de los tilacoides, esto tiende a sobrestimar la contaminación cruzada de las preparaciones de envoltura purificada con otros compartimientos de los cloroplasto. Sin embargo, este método permite para detectar diminutas cantidades de proteínas contaminantes entre la fracción de la envolvente. Marcadores de cada compartimiento (es decir, abundantes proteínas) son muy útiles en la evaluación de la contaminación cruzada de las fracciones. De hecho, se espera que las fracciones de membrana tilacoides y sobres contienen cantidades muy bajas de la subunidad grande de la RuBisCO (RBCL), la proteína más abundante de la estroma (50 kDa). Cloroplastos rotos pueden distinguirse fácilmente de cloroplasto intacto debido a la pérdida de esta proteína stromal8. La luz cosecha proteínas complejas (LHCP) son componentes de tilacoides abundante de 25 kDa que apenas contaminar (menos del 3%) de las membranas de envoltura9. Finalmente, el translocador de fosfato de Triosa (TPT) es una proteína de 30 kDa que sólo es visible en la fracción purificada envolvente debido a su enriquecimiento fuerte (es decir, 50 a 100 x) en la fracción de envolvente comparado con cloroplasto todo extractos. Utilizando el método descrito aquí, cloroplasto los compartimientos son generalmente mal Cruz-contaminado confirmado mediante análisis de western-blot (Figura 2D) depende de los anticuerpos dirigidos contra conocidos marcadores de todos los compartimientos de los tres: la soluble ketol-acid reductoisomerase (KARI) desde el estroma, la envoltura del cloroplasto cobre ATPasa (HMA1) y la luz cosecha proteínas complejas (LHCP) desde los tilacoides. La contaminación cruzada de los tres compartimentos secundario puede cuantificarse mediante immunoblotting y masa espectrometría análisis9. Mientras que el estroma generalmente no está contaminado por sobre o tilacoides fracciones, las fracciones purificadas envoltura contienen 3% de proteínas de tilacoides y hasta el 10% de las proteínas del estroma. Proteínas del estroma poco contaminan los tilacoides (menos del 1%) pero tilacoides contienen hasta un 3% de las proteínas de membrana envolvente. Más que tener un papel crucial en la identificación de la ubicación de subplastidial genuino de proteínas del cloroplasto, el presente método así también limita conclusiones erróneas acerca de subplastidial localización de las proteínas resultantes de cruzan contaminaciones.
<img alt="Diagrama de estructura del cloroplasto; membranas de la envoltura, membranas tilacoides, grana, detalles del estroma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: esquema representativo de cloroplasto sub compartimientos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Experimento de aislamiento de cloroplastos; Resultados de SDS-PAGE y Western blot analizando fracciones de cloroplasto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: purificación de cloroplastos intactos y sus tres principales compartimentos el uso de gradientes de Percoll y sacarosa. A. Percoll gradiente que permite la separación de cloroplastos intactos y rotos. B. gradiente de sacarosa permite la separación de fracciones envolvente y estroma y tilacoides. C. representante de SDS-PAGE de las proteínas de los cloroplastos intactos y sus tres compartimentos sub principal permitiendo visualizar marcadores abundante de cada compartimiento secundario. Cada compartimento contiene 10 μg de proteínas. Marcadores de peso molecular: RBCL, subunidad grande de la RuBisCO (marcador del estroma); TPT, translocador de Triosa-fosfato (marcador de la envoltura); LHCP, luz cosecha proteínas complejas (marcador de los tilacoides). D. experimentos de Western-blot permite para detectar marcadores específicos (utilizando anticuerpos específicos) de cada compartimiento secundario: el cloroplasto envolvente cobre ATPasa HMA110, la luz cosecha proteínas complejas LHCP de los tilacoides las membranas11y reductoisomerase ketol-ácido KARI del estroma9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, describimos un método para purificar cloroplastos intactos de hojas de Arabidopsis y de sus tres principales compartimentos sub (envoltura, estroma y tilacoides), usando una combinación de diferencial centrifugados, gradientes de Percoll continuados, y gradientes de sacarosa discontinuas. El método es útil para subplastidial y localización subcelular de las proteínas por immunoblotting y proteómica.

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

La principal ventaja de esta técnica es que permite distinguir proteínas de actividades similares que tienen diferentes roles, dependiendo de la localización en sobre, estroma, o membranas tilakoide. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque utilizarán plantas que son demasiado viejas, mezclarán la hoja durante demasiado tiempo, o no tendrán cuidado al volver a suspender los pellets de cloroplasto intacto, pero frágil. La demostración visual de este método es crítica, ya que la carga o recuperación de fracción de percoll o en los pasos de gradiente de sacarosa son difíciles de aprender.Debido al riesgo de mezcla de los gradientes y por lo tanto de contaminación cruzada de las diversas subcá fracciones de cloroplasto. Demostrando el procedimiento será por Imen Bouchnak, un estudiante de doctorado de nuestro laboratorio y Lucas Moyet, un ingeniero de interior. Para empezar, cultivar plantas de arabidopsis durante cinco semanas con un ciclo de luz de 12 horas a 23 grados centígrados en el día y 18 grados centígrados en la noche, con una intensidad de luz de 150 micromoler por metro cuadrado por segundo.Al día siguiente, pre-pesar un vaso de precipitados de cinco litros y luego colocarlo en hielo. Cosecha las hojas de arabidopsis, asegurándote de evitar recoger cualquier suelo. Vuelva a pesar el vaso de precipitados y registre el peso tisular.Transfiera las hojas cosechadas a una sala fría. Colocar las hojas en una licuadora que contenga dos litros de tampón de molienda y homogeneizarlas mezclando a alta velocidad tres veces durante una duración de dos segundos cada vez. Coloque cuatro capas de muselina y una capa de tex azul de nylon en un colador y esto para filtrar el homogeneizar.Apriete suavemente las hojas mezcladas dentro de la muselina y el tex azul para extraer todo el líquido. Recuperar el tejido restante en la taza de la licuadora y repetir el proceso de homogeneización utilizando un tampón de molienda fresca. Utilice de cuatro a cinco capas de muselina nueva para filtrar este nuevo homogeneizado en un nuevo vaso de precipitados como se describió anteriormente.Distribuya el extracto de célula bruta por igual en seis botellas de 500 mililitros. Coloque las botellas sobre hielo. Centrifugar las botellas refrigeradas a 2070 G y cuatro grados centígrados durante dos minutos.Después de esto, deseche suavemente el sobrenadante. Utilice una bomba de agua para aspirar cualquier sobrenadante restante y mantener los pellets, que contienen cloroplasto crudo concentrado, sobre hielo. Con una pipeta de 10 mililitros, agregue tres mililitros de medio de lavado a cada botella, asegurándose de no utilizar puntas de pipeta finas para evitar romper los cloroplastos.Luego, usa un pincel de pintura o una espátula de plástico curva para reabrir suavemente los pellets. Con una pipeta de 10 mililitros, recoja los cloroplastos re-suspendidos en un solo tubo. Invierta suavemente el tubo para obtener una suspensión homogénea de cloroplasto.Para comenzar, utilice una pipeta de 10 mililitros para cargar lentamente seis mililitros de la suspensión de cloroplasto encima de cada uno de los seis gradientes de percoll preparados. Usando un rotor de cubo oscilante, centrifugar los gradientes a 13, 300 G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Utilice una bomba de agua para aspirar la fase superior, que contiene cloroplastos rotos y mitocondrias intactas.Luego, utilice una pipeta de 10 mililitros para recuperar los cloroplastos intactos presentes en la fase inferior, teniendo cuidado de no aspirar los núcleos y los desechos celulares encontrados en la parte inferior del tubo junto con los cloroplastos intactos. Diluir la suspensión de cloroplasto intacta de tres a cuatro veces con medio de lavado. Conservar aproximadamente 10 mililitros de una alícuota de fracción de cloroplasto intacta para su posterior análisis por SDS-Page e hinchazón occidental.Centrífuga a 2070 G y cuatro grados centígrados durante dos minutos. Después de esto, deseche suavemente el sobrenadante. Utilice una bomba de agua para aspirar cualquier sobrenadante restante y mantener el pellet, que contiene cloroplastos crudos concentrados, sobre hielo.Para anide los cloroplastos intactos purificados, vuelva a suspender el pellet en un medio hipotónico que contenga inhibidores de la proteasa. Transfiera los cloroplastos re-suspendidos a un tubo de halcón de 10 mililitros. Prepare el degradado de sacarosa como se describe en el protocolo de texto.Usando una bomba peristáltica, cargue lentamente tres mililitros de los cloroplastos de lesed en la parte superior de cada uno de los gradientes de sacarosa preformados. Utilice el tampón medio hipotónico para equilibrar pares de tubos, y luego ultra-centrifugar el gradiente a 70.000 G y cuatro grados Celsius durante una hora. Tomar una alícuota de las proteínas estromales solubles que se utilizarán en la determinación de la concentración de proteínas.A continuación, utilice una bomba de agua para aspirar la fase superior restante del gradiente hasta la banda amarilla. Usando una pipeta, recupere la banda amarilla, que es el sobre. Tire de los sobres en un tubo.A continuación, retire la fase restante del degradado hasta el pellet tilakoide. Re-suspender los pellets tilakoid en tampón de lavado de membrana con inhibidores de la proteasa. Diluir la suspensión tilakoide y sobre tres a cuatro veces con medio de lavado, ajustando el volumen final a 10 mililitros.Equilibre los pares de tubos con tampón de lavado de membrana y los centrifuga a 110.000 G y cuatro grados Centígrados durante una hora. Después de esto, utilice una bomba de agua para aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Añadir aproximadamente 100 microlitros de tampón de lavado de membrana al pellet de sobre.Entonces, aspira el sobrenadante del tubo tilakoide. Vuelva a suspender los pellets tilakoide en tres mililitros de tampón de lavado por membrana. Almacene los tres subconte compartimentos purificados en nitrógeno líquido para su uso en experimentos posteriores.Después de que las fracciones de membrana se recuperan, se lavan y se concentran, SDS-Page se utiliza para cuantificar las proteínas y analizar la composición de las cuatro fracciones. La proteína más abundante del estroma es RBCL, y los resultados representativos muestran el resultado esperado, que muy poco de la gran subunidad de esta proteína está contenida en las fracciones de tilakoide y membrana de sobre. Las proteínas complejas de recolección ligera son abundantes componentes tilakoide que apenas deben contaminar las membranas envolventes.Por último, el translocador de fosfato de trío de fosfato sólo es visible en la fracción de envolvente purificada, debido a su fuerte enriquecimiento en la fracción del sobre en comparación con todos los extractos de cloroplasto. La contaminación cruzada de los tres subcompartimentos, la reductoisomerasa soluble de ketol-ácido del estroma, la envolvente de cloroplasto ATPase y la ligera cosecha de proteínas complejas de las membranas tilakoide se pueden cuantificar mediante el uso de análisis de inmunoblotting y espectrometría de masas. Mientras que el estroma no suele estar contaminado por fracciones de sobre o tilakoide, las fracciones de envolvente purificadas contienen 3%proteínas tilakoide y hasta un 10% de proteínas del estroma.Los tilakoids están mal contaminados por proteínas del estroma, pero contienen hasta el 3% de las proteínas de la membrana del sobre. Los cloroplastos realizan muchas funciones cruciales como la asimilación de carbono, azufre y nitrógeno, así como la síntesis de metabolitos esenciales. Con el fin de descifrar nuevos mecanismos reguladores que controlan la fisiología del cloroplasto, definir la localización de la surplastia de las proteínas de cloroplasto es fundamental para los estudios super-dirigidos.Los cloroplastos contienen varios subconterinos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del cloroplasto, como donde se encuentra una proteína de cloroplasto específica dentro del orgánulo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar conducir todos los pasos de aislamiento de cloroplasto a cuatro grados para remitir la resistencia protea en fracciones purificadas.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como los enfoques proteómicos de lascare para responder a preguntas adicionales como la composición y la dinámica del proteomo de los valores subcontenedores de plastid. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología vegetal exploraran muchos aspectos diferentes de la biogénesis del cloroplasto y funcionaran utilizando el análisis específico de las proteínas candidatas identificadas dentro de los subcontenedores de plastid. No olvides que trabajar con licuadora de volumen, nitrógeno líquido, en compuestos específicos como inhibidores de la proteasa, requiere un cuidado especial.Precauciones como usar guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad siempre deben tomarse durante el procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Presentamos aquí protocolos de aislamiento de alto rendimiento de tilacoides fisiológicamente activos y análisis de transporte de proteínas para el cloroplasto doble arginina desplazamiento (cpTat), secretoras (cpSec1) y vías de partícula (cpSRP) de reconocimiento de señal.

Aislamiento de tilacoides fisiológicamente activos y su uso en ensayos de transporte dependiente de energía

Aquí se describe un protocolo para expresar proteínas en protoplastos mediante método de transformación mediada por PEG. El método proporciona fácil expresión de proteínas de interés y eficiente investigación de localización de la proteína y el proceso de importación para las varias condiciones experimentales en vivo.

Estudiando la importación de la proteína en cloroplastos con protoplastos

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Este protocolo describe la preparación de muestras intactas de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis thaliana . El método solo requiere equipo de laboratorio común, como una aguja de inyección y pinzas de precisión, y permite obtener imágenes fluorescentes de células vivas de alta resolución de células endospermas tanto en semillas en desarrollo como maduras.

Preparación de tejido intacto para el análisis microscópico de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis en desarrollo y maduras

Aprende a purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis y sus subcompartimentos (envoltura, estroma y tilacoides) mediante centrifugación diferencial y gradientes de Percoll y sacarosa. Este método permite localizar proteínas específicas en cada fracción para estudios de bioquímica vegetal.

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica (Video) | JoVE Journal

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

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