Un método basado en el Micro-CT para caracterizar las lesiones y la localización de electrodos en cerebros de animales pequeños
November 8th, 2018
Este artículo describe un método sencillo para preparar pequeños cerebros animales micro-CT en la proyección de imagen, en que las lesiones se pueden cuantificar y electrodos con alta precisión en el contexto de todo el cerebro.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia proporcionando un método más simple, menos propenso a errores y más cuantitativo para verificar lesiones y localizar ubicaciones de electrodos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la verificación de lesiones y sitios de electrodos en todo el cerebro sin necesidad de seccionamiento. El producto final es un volumen 3D digital del cerebro y múltiples cerebros pueden ser procesados en paralelo.
Aunque este método se demostrará en la rata, también se puede aplicar a otros organismos, como ratones y pinzones de cebra. Generalmente, las personas nuevas en este método tendrán problemas porque algunos pasos requieren un cuidado particular para asegurar los mejores resultados. Para comenzar, coloque un cerebro extraído en solución de profusión en un tubo cónico de 50 mililitros.
Almacene la muestra durante dos o tres días con un suave temblor a cuatro grados centígrados. Asegúrese de que el osmio se diluye en agua y no en un tampón. Esto se debe a que el agua actuará como un detergente suave, permitiendo que el osmio penetre profundamente en el tejido.
Preparar 50 mililitros de 2%tetróxido de osmio en agua doble destilada. A continuación, coloque el cerebro en un nuevo tubo cónico de 50 mililitro y agregue la solución de tetróxido de osmio. Cierre el tubo y ciérrelo con película de parafina para evitar fugas.
Almacene el tubo sellado a cuatro grados centígrados con un suave temblor durante dos semanas. Asegúrese de que el tubo esté colocado horizontalmente. El cerebro es muy grueso y una larga manera de viajar por difusión.
Colocar el tubo horizontalmente permitirá que el osmio se desdriga más profundamente en el tejido. Después de la incubación de la muestra durante dos semanas, lávela con agua doble destilada cinco veces para eliminar todo el tetróxido de osmio no consolidado de la muestra. A continuación, lave la muestra con agua de doble destilación durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Sustituya el agua de doble destilación por cuatro diluciones de etanol para deshidratar la muestra. Para comenzar el proceso de infiltración de resina, mueva la muestra a través de tres diluciones de resina de acetona y tres de acetona, luego sumerja la muestra en 100% de resina a temperatura ambiente para continuar el proceso de infiltración. Después de esto, transfiera la muestra a un molde desechable.
Infunde la muestra con resina fresca 100% durante cuatro horas a temperatura ambiente. Desgasar la muestra en un horno al vacío durante 15 minutos a 45 grados centígrados. Luego cure la muestra en un horno durante 48 horas a 60 grados centígrados.
Finalmente, cuando la muestra haya terminado de curar, despegue el molde desechable y escanee con la máquina Micro-CT. En la sección tradicional, la orientación del cerebro debe ser predeterminada. Usando este método Micro-CT, el volumen digital del cerebro de muestra puede ser manipulado en tres dimensiones y prácticamente cortado en cualquier dirección.
La microscopía electrónica de barrido del cerebro de rata preparado confirma que el tejido no se dañó significativamente a los efectos de las imágenes Micro-CT. Un cerebro de pinzón cebra también fue preparado y escaneado de acuerdo con este protocolo para probar la utilidad de este método en otros cerebros animales pequeños. Esta técnica se puede utilizar para encontrar lesiones superficiales en el cerebro, así como lesiones profundas dentro del cerebro.
Esta técnica también se puede aplicar a la ubicación de tetrodos individuales in situ, lesiones electrolíticas, pistas de electrodos, matrices de tetrodos in situ y sondas de silicio in situ. Al intentar este procedimiento, es importante recordar permitir que el cerebro incite durante el tiempo suficiente y con suficiente agitación. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la optogenética y las imágenes de dos fotones con el fin de responder preguntas adicionales sobre el papel que desempeñan las diferentes áreas cerebrales en diferentes comportamientos.
Esta técnica podría permitir a los investigadores en el campo de la neurociencia explorar mejor las relaciones estructura-función entre el cerebro y el comportamiento en ratas, ratones, pájaros cantores y otros animales pequeños. No olvide que trabajar con osmio puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como usar guantes y trabajar en una campana de vacío siempre debe tomarse mientras se realiza este procedimiento.
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Visión general
Este artículo describe un método para preparar cerebros de animales pequeños, específicamente cerebros de ratas, para imágenes de micro-CT. La técnica tiene como objetivo cuantificar lesiones y localizar con precisión electrodos sin necesidad de sección, produciendo un volumen digital 3D completo del cerebro.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de imagen
- Análisis de lesiones
Antecedentes
- Las imágenes de micro-CT permiten un análisis no destructivo de las estructuras cerebrales.
- Los métodos de sección tradicionales pueden ser propensos a errores y limitan la flexibilidad de orientación.
- Este método mejora la capacidad de analizar lesiones y la colocación de electrodos.
- Aplicable a diferentes animales pequeños como ratones y pinzones de zebra.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método de preparación simplificado y menos propenso a errores para imágenes de micro-CT.
- Proporcionar una localización precisa de lesiones y electrodos.
- Facilitar la manipulación 3D de muestras de cerebro para un análisis mejorado.
Métodos utilizados
- La plataforma principal utilizada es la imagen de micro-CT de muestras de cerebro preparadas.
- El modelo biológico clave es el cerebro de rata, pero el método es adaptable a otros animales pequeños.
- El método implica períodos de incubación específicos y el uso de tetróxido de osmio para la preparación del tejido.
- Los pasos críticos incluyen la colocación horizontal del tubo y múltiples pasos de lavado para asegurar la penetración del osmio.
- La preparación final incluye el curado de la resina y el escaneo con una máquina de Micro-CT.
Resultados principales
- Este método permite la visualización de lesiones tanto superficiales como profundas del cerebro.
- Permite la identificación precisa de las pistas de electrodos y lesiones mientras se mantiene la integridad del tejido.
- Las muestras escaneadas muestran que el daño al tejido es mínimo, confirmando la aplicabilidad de la técnica.
- El procedimiento puede apoyar experimentos adicionales como la optogenética y la imagen de dos fotones.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método efectivo para preparar cerebros de animales para un análisis detallado utilizando micro-CT.
- La técnica permite a los investigadores explorar el comportamiento de las neuronas y las relaciones estructurales sin dañar las muestras.
- En general, mejora las capacidades de la investigación en neurociencia para entender la mecánica cerebral.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
