Name: Expresión independiente de metanol por Pichia Pastoris empleando tecnologías de la represión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprende a producir proteínas recombinantes sin metanol en Pichia pastoris mediante cultivos en matraces con monitoreo online de oxígeno y densidad celular. Este método optimiza la expresión proteica con discos de alimentación de glicerol.

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ROBOX ha recibido financiación del proyecto de la Unión Europea (UE) ROBOX (beca Convenio n ° 635734) horizonte 2020 programa investigación e innovación de la UE acciones H2020 LEIT BIO-2014-1. Las visiones y opiniones aquí expresadas son sólo las de los autores y no reflejan necesariamente las de la Agencia de investigación de la Unión Europea. La Unión Europea no es responsable por cualquier uso que pueda hacerse de la información contenida en este documento.
La tesis doctoral de J. Fischer es cofinanciada por una beca "Tesis Industrienahe" de la Agencia de financiación austríaco FFG.
Agradecemos a Gernot John (PreSens GmbH) para las discusiones útiles y valiosas contribuciones para la redacción del manuscrito.

1. preparación de medios de comunicación
<ol><li>Preparación del tampón media mínima (BMG con glicerol, DMO con dextrosa como fuente de carbono) (1 L)<ol>
<li>650 mL de agua destilada en una botella de cristal 1 L tapa del autoclave. Después de enfriar, completar el medio añadiendo 100 mL esterilizado 10 x YNB (base 134 g/L de nitrógeno la levadura sin aminoácidos), 200 mL de tampón de fosfato de potasio (1 M, pH 6), 30-100 mL de 10% w/v glucosa o glicerol (dependiendo de la cantidad de biomasa generada deseada durante la hornada), agua destilada 2 mL estéril 500 x solución de biotina (10 mg/mL) y rellenar hasta 1 L con estéril. Nota: Todos los ingredientes tienen que esterilizar en frascos separados. Biotina es destruida cuando el autoclave y por lo tanto tiene que ser de filtro esterilizado con filtros de membrana de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Búfer de multimedia (BYPG) (1 L)<ol>
<li>Autoclave de 700 mL de agua destilada con 1% w/v levadura extracto y 2% w/v peptona en una botella de tapón de rosca de 1 L. Después de enfriar, agregar 30-100 mL del autoclave por separado glicerol 10% w/v, 200 mL de tampón de fosfato de potasio (1 M, pH 6) y rellenar hasta 1 L con agua destilada estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Agitar la preparación de frascos
<ol><li>Añadir 5 mL de agua destilada en el mL 250 desconcertado agitar frascos, cubrir con dos capas de tela de algodón y fijar en su lugar con bandas de goma. Cubra la tela con un trozo de papel de aluminio.</li>
	<li>Autoclave de los matraces a 121 ° C por 20 min para la esterilización completa.</li>
	<li>Sacar agua residual del matraz y alícuota 50 mL del medio preparado en cada matraz.</li>
</ol>3. la inoculación de la cultura
<ol><li>Iniciar una cultura de la noche a la mañana (ONC) con una sola Colonia fresca de la cepa de expresión deseada en 5 mL de YPD (Extracto de levadura 1% w/v, peptona 2% w/v, glucosa 2% w/v) en un tubo de centrífuga de 50 mL dejando la tapa ligeramente abierta para permitir la aireación adecuada.</li>
	<li>Dejarlo crecer durante la noche a 28 ° C, humedad de 80%, en un agitador a 100-130 rpm (sacudida de 2,5 cm de diámetro).</li>
</ol>4. la medida instalación y cultivo principal de la cultura
<ol><li>Para configurar el sistema de monitoreo en línea, siga las instrucciones del fabricante para la calibración apropiada de los dispositivos.</li>
	<li>Coloque un equipo donde está instalado el software correspondiente para el control de gama de una conexión Bluetooth con las estaciones de medición. Inicie el software para conectar los dispositivos vía Bluetooth.<ol>
<li>Activar la conexión Bluetooth en el dispositivo de medición de biomasa pulsando el botón plateado en la parte delantera.</li>
		<li>En el software, haga clic en dispositivos y luego Buscar dispositivos. Nota: Los dispositivos deberían aparecer como una lista en la ventana debajo de la línea de la tarea. Si no es así, es conveniente revisar si las baterías están cargadas y el equipo está al alcance de una conexión Bluetooth.</li>
		<li>Arrastrar y soltar los dispositivos encontrados a las plazas a la derecha de la pantalla de Bandeja de medición.</li>
		<li>Haga clic en conectar. Nota: Cuando la conexión fue exitosa, aparecerá una pantalla de control.</li>
		<li>Para iniciar una prueba de funcionamiento para la conexión de Bluetooth, haga clic en medida.</li>
		<li>Establecer el experimento.<ol>
<li>Haga clic en Inicio de medición, nombre del experimento y activar todos los parámetros necesarios para controlar. Nota: Se necesitan licencias para cada uno de los posibles parámetros medidos.</li>
			<li>Intervalo de 3 minutos. Nota: El intervalo determina cuánto se toman los puntos de medición y cada punto de medida da un valor luego. Cada minuto de medición es muy exacta, pero un montón de datos que hace más laborioso evaluar que se genera.</li>
			<li>Establecer Puntos de medida de media a 11. Nota: Esta configuración determina cuántos puntos de medición se toman realmente cada 3 minutos. Por lo tanto, la salida es el valor promedio de 11 puntos de medición sobre 11 s.</li>
			<li>Escriba los nombres de las muestras.</li>
			<li>Saltar a la siguiente pantalla, como el ángulo fue calibrado antes (paso 4.1). Nota: Se recomienda una prueba de funcionamiento para la conexión de Bluetooth antes de inocular los cultivos principales para garantizar conexiones estables y ubicación adecuada de la computadora conectada. Además, las pilas deben cargarse.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir la densidad celular de la ONC (paso 3.1) diluido en medios de cultivo (1:20) en un espectrofotómetro a longitud de onda de 600 nm. 50 mL del medio de inocular (recomienda concentración de fuente de carbono 0.3-1%, posible de diversos medios como se describe en el paso 1.) con la ONC un OD600 de 0.05 utilizando el siguiente cálculo. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq1.jpg">
</li>
	<li>Colocar los matraces en los detectores y agitar a 28 ° C, 130 rpm y 80% de humedad. Nota: Es muy importante darle la cultura 5 min de agitación antes de que a partir de la medición para evitar que células se adhiera a la parte inferior del matraz y obtención de valores incorrectos.</li>
	<li>Haga clic en Inicio de medición en el software.</li>
	<li>Tomar muestras de 0.2 mL para medida de la densidad celular 4 h después de la inoculación y cuando la fuente de carbono agota (determinación se describe en el paso 4.7) en triplicado. Diluir las muestras adecuadamente en medios de cultivo (primera medición 1:5, segunda medición 1:20) y medir la absorción en la longitud de onda de 600 nm en un espectrofotómetro. Antes de retirar los frascos y aún antes de parar el vibrador, siempre hacer una pausa en la medición en el software. Nota: Los detectores están calibrados para la grabación de los parámetros bajo condiciones definidas de agitación y producen las mediciones de absurdo cuando grabe las culturas todavía. También, asegúrese de esperar a 5 min de agitación antes de comenzar la medición otra vez. Las mediciones de densidad celular son esenciales ya que el detector está entregando sólo valores de biomasa y densidad celular no real. Una función de calibración entre los valores de OD600 (x valores) y los valores obtenidos por el sistema de medición en línea (y valores) pueden ser alcanzados midiendo espectrofotométricamente varios puntos de tiempo. Los valores son no en forma lineal sino en una relación logarítmica según la siguiente función de calibración: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58589/58589eq2.jpg"> y: OD600 obtenidas por espectrofotómetro x: valores obtenidos por el sistema de medición en línea k: pendiente d: la intercepción del eje La pendiente y el intercepto del eje pueden utilizarse entonces para convertir cualquier valor en el valor correspondiente a600 OD. En Excel uno puede representar los valores de600 OD espectrofotométricamente obtenidos contra los valores del sistema en línea desde el mismo punto. La adición de una línea de tendencia logarítmica y la ecuación correspondiente dará la función de calibración que se muestra arriba.</li>
	<li>Cultivar hasta la fuente de carbono es casi agotados (aprox. 12-20 h). Para ello, dejar que las culturas crecen hasta que puede verse en los diagramas de software, que la concentración de oxígeno se aproxima a cero y las células están en fase de crecimiento exponencial. Nota: Este es el caso de concentraciones de la fuente de carbono utilizado en este protocolo. El punto de agotamiento de la fuente de carbono se puede determinar con el sistema de monitoreo en línea como se muestra exemplarily en figura 1 en la sección de resultados de representante, cuando el nivel de oxígeno acerca a cero y las células en crecimiento exponencial fase.</li>
</ol>5. proteína expresión por la represión
<ol><li>Cuando se alcanza el punto que se describe en el paso 4.6, iniciar la alimentación de las culturas por la adición de cuatro discos de alimentación cada frasco en condiciones estériles. Nota: En las condiciones descritas, cuatro discos de alimentación glicerol liberan glicerol 2 mg/h según el fabricante.</li>
	<li>Continuar el cultivo durante 60-90 h mientras esté tomando muestras cada 24 h para controlar la expresión de la proteína por un ensayo de elección (por ej., Bradford ensayo15, SDS PAGE16 o actividad ensayos) y medidas de la densidad de la célula.</li>
</ol>6. cultura de recolección
<ol><li>Después de lo 60-90 h de cultivo, llenar los cultivos en tubos de centrífuga de 50 mL para cosechar por centrifugación a 4.000 x g, 4 º C durante 10 minutos. Nota: El sobrenadante (para proteínas secretadas) o las células (para la expresión de la proteína intracelular) pueden ser cosechadas por centrifugación a 4.000 x g, 4 º C durante 10 minutos y además se pueden hacer análisis.</li>
	<li>Exportar los datos de medición en línea como un archivo de hoja de cálculo del software para su posterior análisis.</li>
	<li>Llenar 5-10 mL de agua destilada a todos los frascos y autoclave para inactivar las células restantes.</li>
</ol>

<ol><li>Bill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Playing+catch-up+with+escherichia+coli%3A+Using+yeast+to+increase+success+rates+in+recombinant+protein+production+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments.</a> Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1385/MB:16:1:23">Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris).</a> Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , 20150011407 (2005).</li>
<li>Vogl, T., Glieder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Pichia+pastoris+promoters+and+its+consequences+for+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production.</a> New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).</li>
<li>Rußmayer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-level+organization+of+yeast+methylotrophic+lifestyle%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle.</a> BMC Biology. 13 (1), 80(2015).</li>
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<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
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<li>Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+slow+glucose+feed+cultivation+of+Pichia+pastoris+without+repression+of+AOX1+promoter%3A+towards+high+throughput+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).</li>
</ol>

Aunque el protocolo presentado es generalmente aplicable para el cultivo e inducción en condiciones ha, e.U. bisy declara que tienen un interés en la comercialización de los nuevos promotores derepressed utilizado en este estudio.

Este método presenta un protocolo confiable de expresión inducible independiente eficiente del metanol por p. pastoris como alternativa a la expresión de la proteína del metanol clásica inducida por PAOX112. Promotores de repressible, como el PDC, PDF o descrito anteriormente transformado PAOX1 variantes17, construyen las bases moleculares de este nuevo concepto de producción de proteína. Los resultados se muestra representativos subrayan la utilidad y factibilidad de la expresión de proteínas recombinantes en p. pastoris por promotores de reprimido y proyección en pequeña escala con monitoreo en línea simple. Por una parte, el metanol dañino y tóxico que se utiliza generalmente para la inducción del promotor de AOX1 puede ser eliminado del cultivo. Por otro lado, el crecimiento y la fase de producción de la proteína están desacoplados9 en contraste con la expresión de la proteína constitutiva, por ejemplo., el comúnmente usado Pbrecha. Esto es especialmente beneficioso cuando las células deben expresar proteínas tóxicas o dañinas que muestran una carga para ellos.
La posibilidad de empezar los cultivos con concentraciones de carbono diferentes fuente permite la decisión de Cuánta biomasa uno quisiera ganar antes de la fase de producción de proteínas se inicia. Al elegir una menor concentración de fuente de carbono en el lote, limitaciones de transferencia de oxígeno debido a las densidades celulares demasiado alto pueden reducirse mientras que por otro lado mayores densidades de células también pueden resultar en títulos más altos de proteína. Supervisando el desarrollo de la cultura en términos de generación de biomasa y concentración de oxígeno, el momento óptimo para la iniciación de la fed-batch se puede determinar fácilmente como se muestra en la figura 1.
Para el monitoreo en línea de estos parámetros de cultivo, se debe aplicar un sistema de medición apropiado. La biomasa (e.g., Vario SFR) dispositivo de medición es un simple y sistema de medición en línea económica para cultivo monitoreo de en agitar matraces. El lector optoelectrónicos determina el crecimiento de la célula en el frasco a través de la detección de luz dispersada y lee la señal del sensor de oxígeno integrado en el frasco. La óptica para la medición de biomasa consisten en un LED que emite una señal de luz que es dispersada por las partículas (células) en el caldo de cultivo y detectar con un fotodiodo. Los sensores ópticos emiten fluorescencia cuando se excita con luz de cierta longitud de onda. Dependiendo de la cantidad de moléculas de analito presente, cambia esta señal de fluorescencia, que es detectado por la óptica del lector y traducido a valores de concentración. Sin embargo, una calibración de medición de densidad de células debe establecerse de antemano, ya que el sistema de medición no mide valores de600 reales de OD. La tasa de absorción de oxígeno se puede calcular de la pendiente de la curva de oxígeno con el software del lector, y la temperatura así como la rpm se registran continuamente junto con los otros parámetros. Para habilitar el control con este sistema, los frascos de la sacudida deben previamente estar equipado con los sensores apropiados para los parámetros deseados.
Por la adición de polímeros de liberación lenta de cuatro discos proporcionando una cantidad constante de glicerol para el caldo de cultivo, casi se detiene la acumulación de biomasa y producción de proteínas recombinantes se continúa. La determinación del punto de tiempo además de disco de alimentación no es un paso crítico en este experimento, pero debe considerarse que un inicio precoz antes de la fase de crecimiento exponencial podría inhibir la activación del promotor como la expresión comienza a agotamiento de la fuente de carbono. Además, el total de tiempo debido a las limitaciones de capacidad de polímero de alimentación puede reducirse, mientras que retrasar la alimentación después de que las células han alcanzado la fase estacionaria podría conducir al hambre y la degradación de proteína producido. La cantidad de alimentación discos utilizado en este protocolo se determinó experimentalmente para que el lanzamiento de la fuente de carbono óptima mantener el promotor-reprimido mientras mantiene la generación de biomasa baja (datos no mostrados). De esta manera, el cultivo puede ser realizado fácilmente más de 160-180 h sin ninguna intervención.
Principales aplicaciones de este nuevo protocolo será clon de expresión proyección, evolución de enzima el descubrimiento, caracterización y Ingeniería de los nuevos promotores que emplea un protocolo de cultivo libre de metanol en condiciones bien vigilados. En principio, el protocolo mismo debería ser aplicable para piensos estrategias empleando metanol y feeds de fuente de carbono fermentativa limitada como descritos por Panula Perälä et al. en el 201418.

Mejora en el rendimiento y las condiciones de cultivo confiable en gran escala para la producción de proteína recombinante por microorganismos tales como bacterias o levaduras es una de las principales necesidades de la biotecnología1 actual y el éxito comercial de industrial aplicaciones. Procedimientos de cultivo simple dueto y los medios de comunicación, altos rendimientos y herramientas bien caracterizado2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) es una levadura no convencional ampliamente utilizada para la producción de proteínas recombinantes. Constantemente se desarrollan herramientas innovadoras adicionales para esta especie, como nuevos vectores de expresión como nuevos promotores de alternativas a las utilizadas PAOX1, la región del promotor de la alcohol oxidasa 1 gen3, 4,5. Una 500 bp larga secuencia de ADN aguas arriba del gen CAT1 (CTA1) fue identificada como la región del promotor, que permite una nueva estrategia de metanol libre y versátil expresión en p. pastoris. El gen CAT1 es el único gene de la catalasa de p. pastoris y la proteína se encuentra en los peroxisomas. La catalasa desempeña un papel importante en la detoxificación de especies reactivas de oxígeno, que están surgiendo, por ejemplo., de la oxidación del metanol en la vía peroxisomal de MUT o durante la beta oxidación de ácidos grasos6,7. La expresión del gen CAT1 es reprimida en la presencia de glucosa o glicerol en el medio de cultivo y ha sobre el agotamiento de estas fuentes de carbono8. Por otra parte, la expresión del gene de la catalasa puede ser inducida con metanol y remarkebly también con ácido oleico, siendo aparentemente el único gene de la vía de p. pastoris MUT que puede ser inducida con ácido oleico, incluso llegando a niveles similares de expresión como con inducción de metanol9.
El fragmento de 500 PB de este promotor de p. pastoris CAT1 , que se llama PDC (a veces también abreviado PCAT1-500), ya ha sido probado para la producción de proteínas intracelular expresadas y secretadas y resultó para ser un alternativa atractiva a los dos clásicos p. pastoris promotores – la fuerte constitutiva PGAP y el metanol inducible PAOX1, que fueron desarrollados hace más de 20 años. El PDC fue capaz de llegar a 21% (CalB) y 35% (HRP) de las actividades volumétricos comparados con Pboquete en medio rico de azúcar. Sobre inducción de metanol, la PDC no sólo respondió más rápido que el de PAOX1, pero claramente podría superar por un título final mayor de 2,8 veces de CalB9.
Además la PDC, han identificado un promotor orthologous (PDF) exhibe un perfil similar de regulación. Sin embargo, es significativamente más fuerte que la PDC bajo ha como en metanol-inducida condiciones (manuscrito en preparación)3.
En casos donde la fuerte constitutiva PGAP falló debido a las proteínas fisiológicamente problemático o citotóxicos10,11, el PDC y PDF representan una alternativa ideal. En experimentos de escala micro, la expresión por estos promotores comienza después del agotamiento de la fuente de carbono inicial (por ej., glucosa o glicerol), que facilita la producción de biomasa sin sobrecargar las células con sobreexpresión de la proteína recombinante desde el principio. Mientras que ambos de estos promotores son todavía inducibles por el metanol, la activación de derepression hace uso adicional de la fase de preinducción comparado con las expresiones que emplean PAOX1. Por otra parte, el PDC y PDF pueden utilizarse para la producción de proteína libre de metanol, que es un objetivo deseable para grandes procesos industriales12.
Para el desarrollo de las cepas de producción aplicable y expresión construcciones, varios pasos en el desarrollo tienen que pasar para reducir de gran número de transformantes para el candidato preferido para escala-para arriba. Exámenes generalmente se realizan en alto rendimiento en placas de varios pocillos (micro escala: menos de 0,5 mL) con el fin de capturar una gama de clones tan grandes como sea posible. Volver a proyección posterior y re-re-screening son el siguiente paso, seguido por agitar frasco (a pequeña escala: 50-250 mL) o (micro-) biorreactor proyecciones12. Sin embargo, es deseable tener un método, que es más similar entre las diferentes escalas de cientos de μL en placas de pozos profundos hasta varios milímetros en agitar matraces hasta más tarde escala-para arriba de la producción libre de metanol en bien controlados Biorreactores. Aunque agitar matraces pueden proporcionar volúmenes ya similares como Biorreactores pequeños, existen varias limitaciones, que son altamente relevantes para la producción de proteínas a gran escala como constante alimentación, aireación y monitoreo en línea13 de crecimiento y suministro de oxígeno. Empleo monitoreo óptico adaptado agitar matraces y sacudiendo los dispositivos proporcionan una alternativa rentable al equipo más sofisticado para cultivo paralelo mientras que todavía proporciona constante información en línea acerca de los parámetros principales de la cultura como biomasa y la concentración de oxígeno disuelto. Liberación lenta de la fuente de carbono de los portadores de polímero puede ser aplicado para asegurar una alimentación constante y controlada sin depender de soluciones técnicas complejas y dispositivos, simulando condiciones similares de biorreactores que previamente aplicado completo simple agotamiento de la fuente de carbono9,10, donde se convierte en energía para la expresión de proteína continua limitando.
El siguiente método describe una pequeña expresión de la proteína libre de metanol controlable de mediana escala sistema en p. pastoris basado en los nuevos promotores PDC y PDF. Inducción por derepression consiste en dos fases. Una primera fase corta de la acumulación de biomasa sin la producción de la proteína de interés, utilizando una fuente de carbono que reprime los promotores y una segunda fase de la producción de la proteína objetivo, donde se suministra una fuente de carbono en concentraciones pequeñas pero constantes mantener el promotor ha. Monitoreo en línea de los parámetros más críticos del cultivo se aplica durante el período de cultivo entero. El objetivo era proporcionar una libre de metanol, sistema de cultivo confiable y escalable para p. pastoris.

<table><tbody><tr><td>Bacto Extracto</td><td>de Levadura BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Matraz Deflector 250 mL</td><td>DWK Life Science</td><td>212833655</td><td></td></tr><tr><td>BBL Phytone Peptona</td><td>BD Biosciences</td><td>298147</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf AG</td><td>5500-200-10</td><td></td></tr><tr><td>Certoclav-EL</td><td>CertoClav GmbH</td><td>9.842 014</td><td></td></tr><tr><td>Difco Base de nitrógeno de levadura con base o aminoácidos</td><td>BD Biosciences</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Discos de alimentación glicerol</td><td>Adolf Kühner AG</td><td>315060</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa monohidrato</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6887</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol &ge; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6875</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Standard&nbsp;</td><td>Infors AG</td><td>444-4226</td><td></td></tr><tr><td>SFR Vario v2</td><td>PreSens GmbH</td><td>200001689</td><td></td></tr></tbody></table>

expresión independiente de metanol por pichia pastoris empleando tecnologías de la represión

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

El metanol es una fuente de carbono bien establecida y un inductor para la producción de proteína eficiente empleo de Pichia pastoris (p. pastoris) como un host en escala micro, laboratorio e industrial. Sin embargo, debido a su toxicidad e inflamabilidad, es un deseo de evitar el metanol manteniendo la alta productividad de p. pastoris. Cultivos de pequeña escala del biorreactor (0.5-5 volumen de trabajo de L) se utilizan comúnmente para evaluar una cepa y sus características de producción de proteína ya que cultivo de microescala en placas de pozos profundos puede controlarse apenas o se basa en equipos costosos. Además, protocolos tradicionales para el cultivo y la inducción de p. pastoris se establecieron para la inducción de expresión o metanol constitutiva y hasta ahora, no hay protocolos confiables fueron descritos a la expresión de p. pastoris de pantalla cepas con derepressible promotores de cultivos paralelos (controladas y supervisadas). Para simplificar tales cultivos iniciales para caracterizar y comparar nuevas cepas de producción de la proteína, establecimos un sistema de cultivo simple agitar frasco para la libre expresión de metanol que simula condiciones de biorreactor incluyendo un glicerol lento constante alimentación y monitoreo en línea, lo más cercano a las condiciones reales en biorreactores comparados sobre todo cultivos de lote aplicado a pequeña escala. La fuente de carbono para expresión de proteínas recombinantes en p. pastoris, reprimido promotores se aplicaron PDC y PDF . Discos de polímero con fuente de carbono integrado, liberando una cantidad constante de glicerol, asegurada una tasa de alimentación entrega la energía necesaria para mantener los promotores activos, manteniendo baja la generación de biomasa.

Como se describe en la sección de protocolo, el software registra los parámetros de cultivo importantes sobre el cultivo entero. La figura 1 muestra la visualización del desarrollo de la biomasa y la concentración de oxígeno durante un cultivo comenzado con 0.5% (figura 1A) o fuente de carbono 0,3% (figura 1B) en el lote, seguido por la adición de glicerol en alimentación de discos. El sistema de monitoreo en línea es especialmente útil para los cultivos de reprimidos como el punto de agotamiento de la fuente de carbono después de que el lote puede ser determinado exactamente. Como puede verse en la figura 1, la concentración de oxígeno en el medio está disminuyendo rápidamente y acercarse a cero, especialmente para el 0.5% de glicerol en el lote (figura 1A) mientras que la biomasa está aumentando exponencialmente en este punto. Aquí, las células están en fase de crecimiento exponencial y con el fin de hacer un uso óptimo de la liberación de la fuente de carbono, poco antes de que el cultivo alcanza la fase estacionaria, se deben agregar los discos de alimentación como se describe en el protocolo. La adición de los discos de alimentación antes de la concentración de oxígeno llega a cero es importante para la expresión de la proteína de reprimidas evitar que las células de limitación de oxígeno. Menores concentraciones de glicerol reducen el efecto de limitaciones de oxígeno a corto plazo ya que puede verse en la figura 1B y por lo tanto se recomiendan para la expresión de la proteína de reprimido.
A continuación, los resultados de dos cultivos diferentes experimentos, empleando el protocolo descrito y el sistema de seguimiento se muestra en la figura 1 , se describen. En el primer experimento, una cepa de p. pastoris produciendo glucosa oxidasa de Aspergillus niger (a. niger) bajo el control de la PDC y en el segundo una cepa de p. pastoris produciendo la hormona de crecimiento humano bajo control de la PDF es mostrado.
En este experimento, se investigó la producción de oxidasa de glucosa bajo el control de PDC . Por lo tanto, se compararon estrategias de cultivo diferentes: glicerol pulsante, constante glicerol alimentar por la adición de discos de alimentación y cultivo sin ningún alimento o pulsación. El cultivo se realizó en tampón media mínima 50 mL con 0.5% de glucosa como única fuente de carbono en matraces de 250 mL shake (tabla 1).
Sobre cultivo de 160 h, obtuvieron las más altas concentraciones de biomasa, cuando una estrategia de alimentación con un lote de glucosa para la producción de biomasa (38 h) y pulsación de glicerina (glicerol de 0.25% w/v después de 38 h, 61 h y 86 h cultivo) fue empleado (secretora total 0,21 g/L proteína, 8.4 U/mL). Aunque se obtuvieron una reducción de 2 veces de la concentración de biomasa y la cantidad total de proteína secretada, cuando los discos de alimentación fueron agregados después de la hornada de glucosa 38 h, la actividad volumétrica fue hasta 1 U/mL mayor comparado con el cultivo utilizando glicerol pulsando . Esto indica que una cantidad sustancial de proteína secretada no contribuye a la actividad volumétrica en el sobrenadante puede ser secretada en forma inactiva. Por lo tanto, altas concentraciones de glicerol de pulsos glicerol aparentemente favorecen la formación de biomasa en lugar de destino proteína producción y liberación de glicerol baja constante conducido a una mayor productividad específica más de dos veces.
Otro experimento empleando el método de expresión de reprimido fue realizada por expresar la hormona de crecimiento humano (hGH) bajo el control de PDF. La construcción estable fue integrada en el genoma de la cepa de p. pastoris BSYBG11. Aquí, protegido de 50 mL de BYPG, medio rico, en 250 mL desconcertado agitar frascos fue utilizado con 0.3% (p/v) de glicerol como fuente de carbono en el lote. Sobre el agotamiento de glicerol, la expresión de la proteína con glicerol constante alimentación fue asegurada por la adición de 4 discos de alimentación cada frasco y en comparación con no glicerol (figura 2) la alimentación.
La figura 2 muestra la comparación entre la expresión de hGH y el desarrollo de la biomasa de la misma cepa cultivada con y sin glicerina constante de la alimentación. Como sándwich de ensayo ELISA se utilizó con el anticuerpo secundario fundido a la HRP y detección se realizó con ′ 3, 3, 5, 5-tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. Especialmente para esta proteína, que parecía ser el caso que sin ninguna alimentación, las células comienzan a degradar la proteína producida después de aproximadamente 30 h (casillas azules claras), mientras que por la alimentación, esta degradación podría ser prevenido (triángulos azul oscuros) y hasta los concentración de la proteína por biomasa aumentó aún después de 150 h de cultivo. Como ya observado de Hansenula polymorpha14, este resultado muestra cómo cambiar de lote, como se utiliza generalmente en la escala de agitar frasco, en modo fed-batch puede optimizar el cultivo de p. pastoris .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig1.jpg"> Figura 1: visualización de en línea registró parámetros durante dos cultivos con concentraciones de glicerol diferentes en el lote. Los cultivos se iniciaron con 0.5% w/v (A) y 0.3% w/v (B) glicerol en el lote, seguido de la fase de represión donde las células fueron alimentadas aplicando 4 discos alimentación por frasco (liberación de 0.5 mg/h/disco según el fabricante). Las líneas discontinuas muestran la concentración de oxígeno en el medio, mientras que las líneas continuas muestran la densidad celular (OD600). Barras de error indican que la desviación estándar de seis repeticiones (2 biológico, técnico tres cada uno). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58589/58589fig2.jpg"> Figura 2: comparación de la expresión de hormona de crecimiento humano (hGH) en modo batch y fed-batch. contenido de hGH se indica por los valores de absorción a 405 nm mediante un ELISA donde el anticuerpo 2nd era una fusión de HRP y TMB fue utilizado como sustrato para la detección. Se muestran los resultados de dos culturas diferentes: luz azul pantalla línea y cuadrados la densidad celular y la concentración de hGH normalizado por la densidad celular de una cultura sin ningún alimento después de la hornada, en comparación con una cultura, donde el glicerol alimenta discos fueron aplicada (líneas azul oscuras y triángulos). Barras de error indican que la desviación estándar de seis repeticiones (2 biológico, técnico tres cada uno). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58589/58589fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">PCC- GOX al tiempo de cultivo de 160 h</td>
			<td colspan="2">OD600</td>
			<td colspan="2">actividad Vol. [U/mL]</td>
			<td colspan="2">cantidad total de proteína secretada [mg/mL]</td>
			<td>actividad volumétrica por la densidad celular</td>
		</tr>
<tr>
<td>Significa</td>
			<td>SD</td>
			<td>Significa</td>
			<td>SD</td>
			<td>Significa</td>
			<td>SD</td>
			<td>Significa</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% lote + glicerol pulsando</td>
			<td>74.6</td>
			<td>2</td>
			<td>8.4</td>
			<td>2.4</td>
			<td>0.21</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% lote + glicerol constante de la alimentación</td>
			<td>32.5</td>
			<td>0.3</td>
			<td>9.4</td>
			<td>0,7</td>
			<td>0.09</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.29</td>
		</tr>
<tr>
<td>BMD1% lote</td>
			<td>18.8</td>
			<td>0.6</td>
			<td>3.7</td>
			<td>0,7</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: resultados de metanol independiente GOX expresión bajo el control del promotor de reprimido PDC .

Este método por primera vez describe procedimientos experimentales confiables para la eficiente producción de proteína recombinante libre de metanol inducible en Pichia pastoris (Komagataella phaffii), con los promotores de fuente regulada de carbono P DCy PDF en experimentos de pequeña escala al cultivo parámetros pueden ser monitoreados en línea, y se aplica una alimentación constante de glicerol.

Expresión independiente de metanol por Pichia Pastoris empleando tecnologías de la represión

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Este método puede ayudar en la preselección de clones de cromosomas por cepas Pichia pastoris que expresan proteínas recombinantes en condiciones de desprimida por un simple cultivo de matraz de batido antes de la escala. La principal ventaja de esta técnica es que la expresión de proteína libre de metanol de alto nivel se puede lograr utilizando Pichia pastoris, que se apoya en el monitoreo en línea exacto de parámetros de cultivo importantes. Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas porque el punto de tiempo para iniciar el alimento de crecimiento de vidrio tiene que adaptarse a las características de crecimiento de la cepa de producción específica.Antes de establecer el cultivo principal, sembrar una sola colonia fresca de la cepa de expresión de interés en 5 ml de pepto de levadura y caldo de dextrosa en un tubo cónico de 50 ml. Deje la tapa ligeramente abierta para permitir una aireación adecuada. Que, colocar el cultivo en una coctelera a 28 grados centígrados, 80% de humedad y 100 a 130 RPM durante la noche.A la mañana siguiente, inicie el software para conectar los dispositivos a través de Bluetooth. A continuación, pulse el botón plata en la parte frontal del dispositivo de medición de biomasa para activar la conexión Bluetooth al dispositivo y haga clic en Buscar dispositivos en el software de monitoreo de computadora. Arrastre y suelte los dispositivos encontrados a los cuadrados de la bandeja de medición y haga clic en Conectar.Cuando se realiza una conexión correcta, aparecerá una pantalla de control. Para configurar un experimento, haga clic en Iniciar medición. Asigne un nombre al experimento y compruebe si están habilitados todos los parámetros necesarios para la supervisión.Establezca el intervalo en tres minutos y los puntos de medición promedio en 11. Introduzca los nombres de las muestras y omita la calibración del ángulo. Mida la densidad celular del cultivo nocturno diluido en una proporción de uno a veinte en el medio de cultivo en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros.Inocular 50 ml del medio con el cultivo nocturno a una D.O. 600 de 05. Que, coloque los matraces en los detectores a 28 grados celsius, 130 RPM y 80% de humedad durante cinco minutos. Haga clic en Iniciar medición en el software.Cuatro horas después de la inoculación, utilice una muestra de 2 ml para la medición de la densidad celular como acaba de demostrar. Cuando la concentración de oxígeno se acerca a cero y las células están en la fase de crecimiento exponencial añadir cuatro discos de alimentación de glicerol a cada matraz en condiciones estériles. Que, devolver los frascos a la incubadora de agitación durante 60 a 90 horas adicionales.Tome muestras cada 24 horas para monitorear la densidad celular y la expresión de proteínas mediante el ensayo de elección. Al final del cultivo, transferir los cultivos a 50 ml tubos cónicos para la centrifugación. Exporte los datos de medición en línea como un archivo de hoja de cálculo desde el software para su posterior análisis.En este cultivo representativo, la concentración inicial de glicerol fue del 5%Aunque los discos de alimentación se añadieron cuando la biomasa estaba aumentando exponencialmente, el oxígeno disminuyó a casi cero. Las concentraciones más bajas de glicerol redujeron el efecto de las limitaciones de oxígeno a corto plazo y, por lo tanto, se recomiendan para la expresión de proteínas descoprimidas. En este experimento representativo en el que la hormona de crecimiento humano se expresó bajo el control de una fuente de carbono reprimida promotor sobre el agotamiento del glicerol la expresión de proteína por la de-represión se aseguró mediante la adición de cuatro discos de alimentación por matraz.Como se esperaba, la expresión de la hormona de crecimiento humano y el desarrollo de la biomasa aumentaron con el tiempo en presencia de los discos de alimentación de glicerol, mientras que la expresión de la proteína disminuyó con el tiempo y la biomasa se mantuvo constante en ausencia del suplemento de glicerol. Al intentar este procedimiento, es importante recordar observar cuidadosamente los parámetros de cultivo para determinar una hora de inicio óptima de la expresión. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como el análisis de manchas occidentales de determinación de proteínas o ensayos de actividad para la evaluación del rendimiento proteico, así como experimentos de biorreactor a pequeña escala para responder preguntas adicionales sobre el rendimiento de la cepa individual a mayor escala.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la expresión de proteína recombinante libre de metanol exploraran una alternativa prometedora al promotor AOX1 dependiente del metanol de uso común en Pichia pastoris.

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