Reconocimiento de objetos nuevos y ubicación del objeto conductual en ratones en un presupuesto
20 de noviembre de 2018
Aquí proporcionamos un protocolo que incluye instrucciones completa para el establecimiento económico de murino objeto ubicación y objeto novedoso reconocimiento pruebas de comportamiento, incluyendo el diseño, costo y construcción de equipo necesario así como ejecución de pruebas de comportamiento, recolección de datos y análisis.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la regulación de la memoria. Por ejemplo, determinamos el papel de proteínas específicas en la memoria probando ratones noqueadores transgénicos en estas tareas. La principal ventaja de esta técnica es que es una forma rápida y rentable de realizar pruebas de memoria en cualquier laboratorio.
La demostración de la construcción de la arena es crítica, ya que la soldadura con disolvente sólo producirá resultados fuertes si se realiza con cuidado. Comience por adquirir cinco láminas de acrílico, cemento acrílico y un aplicador hipoativo calibre 16. Retire el recubrimiento protector del papel de las láminas de acrílico.
A continuación, se ajuste en seco a todos los materiales para confirmar que los tamaños son correctos. A continuación, ensamble y cargue la jeringa con cemento acrílico. Alinee el borde largo de un muro exterior con el borde superior de la base y asegúrese de que son perpendiculares entre sí utilizando una combinación o un cuadrado maquinista.
A continuación, utilice la jeringa para aplicar un cordón pequeño y constante de cemento directamente en la esquina de las dos piezas que se unen. Mantenga las dos piezas en su lugar durante cinco minutos hasta que se establezcan inicialmente. Repita los mismos pasos para fijar la otra pared exterior a la base.
A continuación, unir dos paredes interiores, una a la vez, la base con cemento acrílico. Por último, utilice la jeringa para aplicar un cordón pequeño y constante de cemento directamente a la esquina que ahora está formado por la pared exterior y la pared interior. Comience la sesión de habituación dividiendo los ratones en grupos de cuatro, y albergándolos en jaulas individuales de retención limpia.
A continuación, lleve un grupo de ratones a la sala de pruebas y déle que se aclimaten durante al menos 30 minutos. Después de la aclimatación, comience a grabar el video. Coloca cada ratón en la arena frente a las paredes de la esquina de liberación, y deja que los ratones exploren las arenas libremente durante seis minutos.
A continuación, deje de grabar el vídeo y devuelva los ratones a sus jaulas de sujeción limpias durante el intervalo entre pruebas. Limpie todas las arenas con métodos de limpieza recomendados por las instalaciones de animales, como limpiar con 70% de etanol para minimizar las señales olfativas. Finalmente, después de completar un total de tres sesiones de habituación, devolver todos los ratones a sus jaulas de origen.
Después de 24 horas, lleve el mismo grupo de ratones a la sala de pruebas y déles que se aclimaten a la sala de pruebas durante al menos 30 minutos, como se hizo antes de las sesiones de habituación del día anterior. Lleva a cabo la prueba de entrenamiento utilizando dos objetos colocados en la arena. Fije objetos con cinta adhesiva de doble cara de seis por seis centímetros de distancia de dos esquinas que no sean de liberación, de modo que se contrarresten en la arena.
Permita que los ratones investiguen la arena y los objetos libremente durante 10 minutos. A continuación, detenga la grabación de vídeo. Coloque los ratones de nuevo en sus jaulas limpias durante 20 minutos y limpie las áreas con etanol.
A continuación, para realizar la tarea de ubicación de objetos OLT, mueva uno de los objetos utilizados en la versión de prueba de entrenamiento a una nueva esquina sin liberación y coloque el objeto a seis centímetros de cada muro de esa esquina con cinta adhesiva de doble cara. Repita la misma grabación de vídeo de los ratones en el área durante 10 minutos, como se describió anteriormente. Por último, para realizar la novedosa tarea de reconocimiento de objetos NORT, reemplace el objeto que no se movió durante el OLT por un objeto novedoso y coloque el objeto novedoso a seis centímetros de las dos paredes de la esquina con cinta adhesiva de doble cara.
Repita la misma grabación de vídeo de los ratones en el área durante 10 minutos, como se describió anteriormente. Durante el OLT, la memoria para la ubicación del objeto se refleja en un grupo de ratones que pasan, en promedio, significativamente más tiempo con un objeto después de que se ha movido. Esto también se puede representar como un aumento en el índice de discriminación.
En el NORT, la memoria para la ubicación del objeto se refleja en un grupo de ratones que pasan, en promedio, significativamente más del 50% del tiempo de investigación con el objeto novedoso o muestran un índice de discriminación significativamente mayor que cero. La selección de objetos para los que los ratones no tienen preferencia inherente es clave. Por ejemplo, en una prueba piloto con un tamaño de muestra de cuatro, los ratones mostraron una tendencia hacia el gasto de menos del 50% del tiempo de investigación con el objeto A cuando se emparenó con el objeto B.Cuando el objeto A se utilizó entonces como el objeto novedoso en un NORT, con un tamaño de muestra mayor de 16, los ratones pasaron significativamente menos del 50% del tiempo de investigación con el objeto A.Estos datos sugieren aversión inherente al objeto A.Durante este procedimiento, Durante este procedimiento, , es importante recordar limpiar a fondo todos los objetos y arenas entre el uso.
En este método, la investigación de objetos puede ser puntuada manualmente por los investigadores o utilizando software comercial. El software tiene costos iniciales más altos, pero, una vez calibrado, puede ahorrar tiempo y recursos financieros a largo plazo.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para realizar pruebas conductuales de reconocimiento de ubicación de objetos y de objeto novedoso en ratones. Incluye el diseño, la construcción y la ejecución del equipo y los procedimientos necesarios para la recolección y el análisis efectivo de datos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Pruebas Conductuales
- Investigación de la Memoria
Antecedentes
- Comprender la regulación de la memoria es fundamental en neurociencia.
- Se utilizan ratones transgénicos con genes eliminados para estudiar el papel de proteínas específicas en la memoria.
- Los métodos rentables son esenciales para su uso generalizado en laboratorios.
- La construcción adecuada de los recintos de prueba es vital para obtener resultados confiables.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo para la evaluación de la memoria en ratones.
- Evaluar la eficacia de las tareas conductuales para analizar la memoria.
- Proporcionar pautas para la construcción de equipos de prueba.
Métodos Utilizados
- Construcción de arenas de prueba utilizando láminas de acrílico y cemento.
- Sesiones de habituación para aclimatizar a los ratones al entorno de prueba.
- Tarea de ubicación de objetos (OLT) y tarea de reconocimiento de objetos novedosos (NORT) para la evaluación de la memoria.
- Recolección de datos mediante grabación de video del comportamiento de los ratones durante las pruebas.
Resultados principales
- Los ratones muestran un mayor tiempo de investigación para los objetos movidos en la prueba de reconocimiento de objetos (OLT).
- En la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NORT), los ratones pasan más tiempo con objetos novedosos en comparación con los familiares.
- La limpieza adecuada de los objetos y las arenas es crucial para obtener resultados válidos.
- Se puede utilizar software para puntuar la investigación de objetos, lo que ahorra tiempo en el análisis.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para evaluar la memoria en ratones.
- La construcción cuidadosa y la limpieza del equipo de prueba mejoran la validez de los resultados.
- Este método es accesible y rentable para diversos laboratorios de investigación.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los ensayos conductuales rentables permiten la fenotipificación escalable de la memoria en modelos de ratón, apoyando la validación temprana de dianas para terapéuticas del sistema nervioso central. Al reducir las barreras económicas para realizar pruebas cognitivas rigurosas, este método mejora la confianza predictiva en las estrategias preclínicas de reducción de riesgos. Facilita la continuidad traslacional desde el acoplamiento a la diana hasta los resultados funcionales en las líneas de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas relacionadas con la función de proteínas asociadas a la memoria en modelos transgénicos.
- Valor operativo: Permite una evaluación rápida y de bajo costo de fenotipos cognitivos en diversos fondos genéticos.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos del blanco al vincular perturbaciones moleculares con déficits de memoria medibles.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Proporciona arenas estandarizadas y reproducibles para métricas consistentes de exploración de objetos.
- Salida cuantitativa: Genera índices de discriminación y ratios de tiempo de investigación para el análisis objetivo de datos.
- Escalabilidad: Compatible con software de seguimiento por video para puntuación conductual de alto rendimiento.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Evalúa el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y los sistemas de memoria no espaciales prefrontales/corticales.
- Continuidad traslacional: Conecta la validación del blanco con la evaluación fenotípica en modelos preclínicos.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Proporciona información para criterios de avance o interrupción basados en el rendimiento de la memoria en modelos genéticos o farmacológicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento como una lectura funcional tras la modulación del blanco, lo que permite un cribado guiado por hipótesis antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis relacionadas con la memoria mediante la evaluación de la memoria de reconocimiento espacial y de objetos tras una intervención genética o farmacológica.
- Selección: Proporciona resultados conductuales estandarizados y cuantificables adecuados para la validación de ensayos y la preparación para la selección de compuestos.
- Análisis: Genera índices de discriminación y métricas basadas en el tiempo que permiten el análisis comparativo entre condiciones y la determinación del tamaño del efecto.
- Investigación Traducional: Se alinea con estrategias de biomarcadores al vincular los resultados conductuales con la función de circuitos neuronales en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y rentable para la evaluación longitudinal de la memoria en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas relacionadas con la memoria mediante la fenotipificación conductual etológicamente relevante.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización, reproducibilidad y bajo costo por ensayo mediante materiales accesibles y una construcción sencilla.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance/no avance al proporcionar puntos finales cognitivos confiables en las primeras etapas del proceso de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en fenotipos de memoria validados en modelos murinos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neurociencia del comportamiento y un manejo adecuado de los ratones para minimizar el estrés y los sesgos.
- Depende de habilidades en la fabricación de acrílico, equipo de grabación de video y protocolos de limpieza para controlar las señales olfativas.
- Necesita una estandarización entre equipos en la selección de objetos, configuración del área experimental y métodos de puntuación para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar protocolos entre diferentes cepas de ratones o condiciones ambientales.
- Está limitado por la variabilidad del puntaje manual, a menos que se combine con software de seguimiento calibrado para un análisis objetivo y a largo plazo.
