Solución de la estructura de la proteína fluorescente Cerulean con MeshAndCollect

El protocolo automatizado MeshAndCollect fue desarrollado para combinar la cristalografía serial con la recopilación de datos de rotación estándar para medir pequeños cristales a partir de muestras de disco. El método identifica primero la posición de los cristales montados en el mismo soporte de muestra para luego dirigir la recopilación de conjunto de datos parciales que posteriormente se fusionará y utilizará para la solución de la estructura. MeshAndCollect es convincente, ya que le permite hacer experimentos rápidamente y con la misma configuración, solución de estructura, cribado de ligandos, y todo eso con cristales diminutos.

El método es compatible con VMX de sincrotrón beamline idealmente equipado con alta flexión de fotones, un diámetro de haz pequeño y un detector de recarga rápida. En primer lugar, conéctese al sistema de información ampliado para la base de datos de la línea de efectos de cristalografía de proteínas y elija MX.Log con el número de experimento y la contraseña del formulario A. A continuación, seleccione Agregar envío nuevo y rellene la información solicitada.

Seleccione Añadir parcial y rellene los datos relevantes. Seleccione Agregar contenedor, elija un disco SC3 y rellene la información necesaria, incluidas las posiciones de los portamuestras en el disco. En la cabaña experimental, cargue el disco en el hacedor del cambiador de muestras y observe su posición.

A continuación, inicie sesión en el sistema de información para la base de datos de la línea de mar de cristalografía de proteínas. Seleccione Preparar experimento, busque el envío, seleccione Siguiente e indique la línea de viga y la posición del disco en el cambiador de muestras. Inicie sesión en el software de control de la línea de haz con el número experimental y la contraseña proporcionados en el formulario A.

Pulse Sync para sincronizar el software de control de la línea de haz con el sistema de información para la base de datos de la línea de mar de cristalografía de proteínas. Utilice el software de control de la línea de haz para montar el portacuchillas en el goniómetro. A continuación, haga clic con el botón derecho en una posición en el área del cambiador de muestra y seleccione Montar muestra.

Seleccione el botón central y luego tres clics en el centro en el centro del borde de la punta del bucle. Guarde la posición centrada seleccionando Guardar. En Avanzadas, agregue el flujo de trabajo Reorientación visual a la cola de recopilación de datos.

A continuación, inicie el flujo de trabajo haciendo clic en Recopilar cola. A continuación, seleccione una de las posiciones centrales guardadas haciendo clic en ella. Haga clic de nuevo en el botón central, luego en un centro de tres clics en el centro del inicio del vástago del bucle.

Guarde la segunda posición haciendo clic en Guardar. Y luego haz clic en Continuar. Después de que el flujo de trabajo alinee el plano del soporte de muestra con el eje de rotación del goniómetro, centre el soporte de muestra de nuevo en algún lugar en el centro de la malla.

Oriente el soporte de muestra de modo que la cara de la malla sea perpendicular a la dirección del haz de rayos X girando el eje omega utilizando el software de control de la línea de haz. En el software de control de la línea de haz, haga clic en el menú desplegable Apertura y seleccione un valor. A continuación, haga clic en el icono de la herramienta de malla para abrir la ventana de herramientas de malla.

En la vista de muestra del software de control de línea de haz, dibuje la malla haciendo clic con el botón izquierdo y arrastrando el ratón sobre el área que contiene cristales en el soporte de muestra. Para guardar la malla, haga clic en el botón más en la ventana de herramientas de malla. En el campo de resolución del software de control de la línea de haz, introduzca la resolución a la que se deben recopilar las imágenes de difracción.

Si no se conoce información previa sobre la calidad de difracción de los cristales, se recomienda un valor entre dos y 2,5. Seleccione MeshAndCollect en la pestaña Recopilación avanzada de datos. Añádalo a la cola y haga clic en Recopilar la cola.

En la ventana de parámetros, utilice los parámetros predeterminados dependientes de la línea de viga. En el experimento descrito aquí, los parámetros predeterminados son 0,037 segundos de tiempo de exposición por punto de escaneo de malla, 100% de transmisión y oscilación de un grado por línea de escaneo de malla. Haga clic en Continuar.

El escaneo de malla se ejecuta y las imágenes de difracción recogidas en cada punto de cuadrícula se analizan y clasifican de acuerdo con la fuerza de difracción con el software Dozer. Después del análisis Dozer, se genera un mapa de calor y el orden para las colecciones de datos parciales subsiguientes se asigna automáticamente en función de la fuerza de difracción. Por último, haga clic en Continuar para iniciar las colecciones de datos parciales.

MeshAndCollect tal como se implementó en MXCuBE se utilizó para la recopilación de conjuntos de datos de difracción parcial a partir de pequeños cristales de Cerulean ubicados en el mismo soporte de muestra en el que la identificación visual de cristales era difícil. Para examinar el soporte de muestra, se dibujó una cuadrícula sobre el centro del bucle de malla y, en función del mapa de calor de puntuación Dozer, se recopilaron automáticamente 85 conjuntos de datos de difracción parcial. Estos se integraron individualmente y luego se fusionaron para producir un conjunto de datos con una integridad del 99,8% con una resolución de 1,7 angstroms.

Como era de esperar, la estructura cristalina de Cerulean podría resolverse mediante reemplazo molecular utilizando el conjunto de datos generado. Después del refinamiento, se obtuvo una R de trabajo del 22,8% y una R libre del 25,4%. La superposición de la estructura previamente determinada muestra un RMSD global en posiciones c-alfa de 0.1 angstroms.

Para los proyectos en los que la optimización de la fase de crecimiento del cristal, MeshAndCollect ofrece la posibilidad de obtener un conjunto de datos completo basado en la combinación de estos conjuntos de datos parciales amorfos obtenidos a partir de cristales más pequeños. Esta técnica allanó el camino para que los biólogos estructurales resolvieron una estructura a partir de la muestra de piezas donde sólo unas décimas de micro cristales no podían ser producidos.