Detección de Tilapia lago Virus usando RT-PCR convencional y SYBR Green RT-qPCR

Bienvenidos a todos. Mi nombre es Win Surachetpong. Soy Profesor Asistente en Microbiología Veterinaria y Facultad de Inmunología de Medicina Veterinaria en la Universidad Kasetstart, Tailandia.

Mi equipo y yo nos especializamos en enfermedades virales emergentes en la tilapia. Ahora estamos trabajando en el virus del lago tilapia que causa una alta mortalidad en la tilapia. Dado que la tilapia es la segunda especie de peces más importante que es el cultivo en todo el mundo, proporciona una fuente de proteínas para un millón de personas y desempeña un papel importante para la seguridad alimentaria.

Por lo tanto, el reciente brote del virus del lago tilapia causa un impacto socioeconómico que llevó a muchos científicos a tratar de encontrar una solución para este problema. Hasta ahora necesitamos un método muy sensible, rápido y preciso para detectar el virus. En este video, le mostraremos paso a paso para detectar el virus del lago de tilapia en el tejido de peces a partir de la recolección de muestras, la población de muestras y el análisis de PCR en tiempo real.

En primer lugar, solubilizar la sobredosis de aceite de tela en el agua para eutanasiar el pescado. Coloque el pez muerto en una bandeja, esterilice el equipo usando 95% de etanol, luego quemado con un quemador de alcohol. Corta lentamente el pescado desde la parte inferior del abdomen hacia arriba, para recoger el hígado.

Recoger parte del hígado en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. La primera parte de la extracción de ARN debe realizarse en una capucha de flujo laminar y llevar equipo de protección. Agregue un mililitro de reactivo de extracción de ARN en el tubo.

Pulverizar el hígado usando un tejido peste en homogéneo. Añadir 200 microlitros de cloroformo en el tubo. A continuación, mezcle suavemente invirtiendo el tubo varias veces.

Reservar durante tres minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a cuatro grados centígrados a 12.000 RCF durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente los tubos de la centrífuga.

Transfiera suavemente 500 microlitros de la fase acuosa superior incolora a un nuevo tubo. Añadir un volumen de isopropanol en el tubo. Caliente a menos 20 grados centígrados durante dos horas o hasta la noche para precipitar el ARN.

Después de la incubación, centrifugar la solución en la misma condición de centrífuga. Recoger los tubos de la centrífuga, a continuación, desechar el sobrenadante. El pellet de ARN puede ser visto como señalado por la flecha.

Añadir un mililitro de 75% de etanol en el tubo para lavar el pellet de ARN, e invertir varias veces. Centrifugar a cuatro grados centígrados, a 10.000 RCF durante 15 minutos. Recoger los tubos de la centrífuga, a continuación, desechar el sobrenadante.

Extraiga el etanol sobrante usando la tubería automática, y seque al aire a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Añadir de 30 a 60 microlitros RNase agua libre, precalegada a 55 a 60 grados centígrados para solubilizar el pellet de ARN. Utilice de una a dos microlitros de solución de ARN para medir la concentración utilizando un espectrofotómetro de micro volumen.

Los resultados aparecerán en la pantalla. Diluir la concentración a 200 nanogramos por microlitro utilizando agua libre de RNase. Realice la síntesis de ADNC utilizando los productos químicos y las condiciones enumeradas de la siguiente manera.

Utilice un termociclador para convertir el ARN en ADNc con las condiciones sugeridas. Los siguientes son los productos químicos y las condiciones utilizados para determinar la carga TiLV utilizando PCR en tiempo real. Dispensar seis mililitros de la mezcla maestra qPCR en cada vial de tubo de tira qPCR blanco.

Posteriormente, cuatro mililitros de muestra de ADNC se cargan en el pozo. En esta etapa se debe cambiar una nueva punta de tubería en cada pozo, para evitar la contaminación de la muestra a la muestra. Selle firmemente la tira qPCR con una tapa de tira qPCR transparente.

Mezcle suavemente la solución parpadeando en la punta de la tira. A continuación, gire hacia abajo usando micro centrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior de los vasos. Utilice la condición de dos pasos como se muestra en el video, seleccione el pozo en la placa de 96 pozos que va a utilizar.

Seleccione el verde cibernético como la flora para el tinte. Seleccione desconocido como tipo de muestra e inserte un nombre en un cuadro de nombre de ejemplo. Abra la tapa de una máquina PCR en tiempo real y coloque la tira qPCR en el pozo asignado.

A continuación, cierre la tapa. Ejecute la máquina con la condición seleccionada. La máquina arrancará y funcionará después de que la tapa haya alcanzado la temperatura deseada.

Después del final de las condiciones qPCR, se muestra la curva de amplificación. Aquí, la flecha de velocidad señala donde el nivel de umbral se corta entre la fase exponencial y la fase lineal que da como resultado el valor CT. A continuación, el valor ct se extrapola al número de copia del registro de virus para calcular que un número de virus permanece utilizando la curva estándar.

El pico de fusión también se muestra para identificar si el virus detectado por qPCR es, de hecho, TiLV en el que los picos de fusión generalmente oscilan entre 79,5 y 80,5 grados centígrados. Así que esperamos que este método sea herramientas importantes para los agricultores y la organización en todo el mundo, que pueden requerir implementar un control y limitar la propagación de la infección TiLV.