Detección de Tilapia lago Virus usando RT-PCR convencional y SYBR Green RT-qPCR
10 de noviembre de 2018
Este protocolo diagnóstico de Virus de lago de Tilapia (TiLV) en tejidos de tilapia utilizando metodologías de RT-PCR. El método completo se describe de la disección del tejido para extracción de RNA total, seguida de la síntesis de cDNA y detección de TiLV por PCR convencional o PCR cuantitativa utilizando dsDNA vinculante un tinte fluorescente vinculante.
Bienvenidos a todos. Mi nombre es Win Surachetpong. Soy Profesor Asistente en Microbiología Veterinaria y Facultad de Inmunología de Medicina Veterinaria en la Universidad Kasetstart, Tailandia.
Mi equipo y yo nos especializamos en enfermedades virales emergentes en la tilapia. Ahora estamos trabajando en el virus del lago tilapia que causa una alta mortalidad en la tilapia. Dado que la tilapia es la segunda especie de peces más importante que es el cultivo en todo el mundo, proporciona una fuente de proteínas para un millón de personas y desempeña un papel importante para la seguridad alimentaria.
Por lo tanto, el reciente brote del virus del lago tilapia causa un impacto socioeconómico que llevó a muchos científicos a tratar de encontrar una solución para este problema. Hasta ahora necesitamos un método muy sensible, rápido y preciso para detectar el virus. En este video, le mostraremos paso a paso para detectar el virus del lago de tilapia en el tejido de peces a partir de la recolección de muestras, la población de muestras y el análisis de PCR en tiempo real.
En primer lugar, solubilizar la sobredosis de aceite de tela en el agua para eutanasiar el pescado. Coloque el pez muerto en una bandeja, esterilice el equipo usando 95% de etanol, luego quemado con un quemador de alcohol. Corta lentamente el pescado desde la parte inferior del abdomen hacia arriba, para recoger el hígado.
Recoger parte del hígado en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. La primera parte de la extracción de ARN debe realizarse en una capucha de flujo laminar y llevar equipo de protección. Agregue un mililitro de reactivo de extracción de ARN en el tubo.
Pulverizar el hígado usando un tejido peste en homogéneo. Añadir 200 microlitros de cloroformo en el tubo. A continuación, mezcle suavemente invirtiendo el tubo varias veces.
Reservar durante tres minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a cuatro grados centígrados a 12.000 RCF durante 15 minutos. Recoja cuidadosamente los tubos de la centrífuga.
Transfiera suavemente 500 microlitros de la fase acuosa superior incolora a un nuevo tubo. Añadir un volumen de isopropanol en el tubo. Caliente a menos 20 grados centígrados durante dos horas o hasta la noche para precipitar el ARN.
Después de la incubación, centrifugar la solución en la misma condición de centrífuga. Recoger los tubos de la centrífuga, a continuación, desechar el sobrenadante. El pellet de ARN puede ser visto como señalado por la flecha.
Añadir un mililitro de 75% de etanol en el tubo para lavar el pellet de ARN, e invertir varias veces. Centrifugar a cuatro grados centígrados, a 10.000 RCF durante 15 minutos. Recoger los tubos de la centrífuga, a continuación, desechar el sobrenadante.
Extraiga el etanol sobrante usando la tubería automática, y seque al aire a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. Añadir de 30 a 60 microlitros RNase agua libre, precalegada a 55 a 60 grados centígrados para solubilizar el pellet de ARN. Utilice de una a dos microlitros de solución de ARN para medir la concentración utilizando un espectrofotómetro de micro volumen.
Los resultados aparecerán en la pantalla. Diluir la concentración a 200 nanogramos por microlitro utilizando agua libre de RNase. Realice la síntesis de ADNC utilizando los productos químicos y las condiciones enumeradas de la siguiente manera.
Utilice un termociclador para convertir el ARN en ADNc con las condiciones sugeridas. Los siguientes son los productos químicos y las condiciones utilizados para determinar la carga TiLV utilizando PCR en tiempo real. Dispensar seis mililitros de la mezcla maestra qPCR en cada vial de tubo de tira qPCR blanco.
Posteriormente, cuatro mililitros de muestra de ADNC se cargan en el pozo. En esta etapa se debe cambiar una nueva punta de tubería en cada pozo, para evitar la contaminación de la muestra a la muestra. Selle firmemente la tira qPCR con una tapa de tira qPCR transparente.
Mezcle suavemente la solución parpadeando en la punta de la tira. A continuación, gire hacia abajo usando micro centrífuga para recoger todo el líquido en la parte inferior de los vasos. Utilice la condición de dos pasos como se muestra en el video, seleccione el pozo en la placa de 96 pozos que va a utilizar.
Seleccione el verde cibernético como la flora para el tinte. Seleccione desconocido como tipo de muestra e inserte un nombre en un cuadro de nombre de ejemplo. Abra la tapa de una máquina PCR en tiempo real y coloque la tira qPCR en el pozo asignado.
A continuación, cierre la tapa. Ejecute la máquina con la condición seleccionada. La máquina arrancará y funcionará después de que la tapa haya alcanzado la temperatura deseada.
Después del final de las condiciones qPCR, se muestra la curva de amplificación. Aquí, la flecha de velocidad señala donde el nivel de umbral se corta entre la fase exponencial y la fase lineal que da como resultado el valor CT. A continuación, el valor ct se extrapola al número de copia del registro de virus para calcular que un número de virus permanece utilizando la curva estándar.
El pico de fusión también se muestra para identificar si el virus detectado por qPCR es, de hecho, TiLV en el que los picos de fusión generalmente oscilan entre 79,5 y 80,5 grados centígrados. Así que esperamos que este método sea herramientas importantes para los agricultores y la organización en todo el mundo, que pueden requerir implementar un control y limitar la propagación de la infección TiLV.
Resumen
Este protocolo describe el diagnóstico del virus del lago de la tilapia (TiLV) en tejidos de tilapia mediante metodologías de RT-PCR. Comprende todo el proceso, desde la disección de tejidos hasta la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y la detección de TiLV mediante PCR convencional o cuantitativa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología Veterinaria
- Virología
- Manejo de la Salud de los Peces
Antecedentes
- El virus del lago de la tilapia causa una mortalidad significativa en la tilapia, afectando la seguridad alimentaria.
- La tilapia es la segunda especie de pez más importante a nivel mundial.
- Los métodos de detección rápida y precisa son esenciales para el manejo de brotes.
- Este protocolo tiene como objetivo proporcionar un método confiable para la detección del TiLV.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método altamente sensible para detectar TiLV en tejidos de peces.
- Ayudar a los productores y organizaciones a controlar la propagación de TiLV.
- Proporcionar una guía paso a paso para investigadores y profesionales.
Métodos Utilizados
- Recolección de muestras y eutanasia de peces utilizando aceite de tela.
- Extracción de ARN de tejido hepático utilizando un flujo laminar.
- Síntesis de ADNc seguida de PCR en tiempo real para la detección de TiLV.
- Análisis de las curvas de amplificación y valores CT para cuantificar la carga de TiLV.
Resultados principales
- Extracción y cuantificación exitosas de ARN a partir de tejidos de tilapia.
- Detección del TiLV mediante PCR en tiempo real con condiciones específicas.
- Establecimiento de una curva estándar para la cuantificación del virus.
- Identificación del TiLV mediante el análisis del pico de fusión.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para la detección del TiLV.
- Puede ayudar en el manejo de brotes y en garantizar la seguridad alimentaria.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar el control de enfermedades virales en acuicultura.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección rápida y sensible del virus del lago de la tilapia (TiLV) es fundamental para la bioseguridad y el manejo de enfermedades en acuicultura, afectando directamente la seguridad alimentaria y las cadenas globales de suministro de proteínas. La integración de RT-PCR convencional y RT-qPCR con SYBR Green permite la detección cualitativa y cuantitativa del virus, apoyando programas de vigilancia e intervención temprana. Estos diagnósticos moleculares proporcionan datos accionables para la mitigación de riesgos y la asignación de recursos en entornos de investigación y operativos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la detección precisa de ARN de TiLV, apoyando la vigilancia de patógenos basada en hipótesis.
- Facilita la reducción de riesgos biológicos al distinguir muestras de tejido infectadas de las no infectadas.
- Brinda confianza predictiva en las estrategias de monitoreo de enfermedades y respuesta ante brotes.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona protocolos validados para la extracción de ARN y la preparación del ensayo de qPCR, asegurando la reproducibilidad.
- Ofrece resultados cuantitativos (valores de CT, número de copias virales) para una estandarización robusta del ensayo.
- Permite la realización de cribados a gran escala de cohortes grandes de muestras para estudios de vigilancia e investigación.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con el desarrollo de biomarcadores traslacionales al cuantificar la carga viral en casos subclínicos.
- Apoya la continuidad desde la detección en laboratorio hasta la vigilancia en campo y la planificación de intervenciones.
- Reduce el riesgo biológico en la validación de modelos preclínicos para la investigación de enfermedades acuáticas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo de PCR dual conecta el descubrimiento temprano, el desarrollo de ensayos y la investigación traslacional para patógenos virales acuáticos.
- Biología del descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración mecanicista de la dinámica de infección por TiLV.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para el análisis de muestras de alto rendimiento.
- Análisis: Ofrece valores de CT y cuantificación basada en curvas estándar para estudios comparativos.
- Investigación traslacional: Permite la detección de infecciones de bajo nivel, informando estrategias de vigilancia e intervención.
- Reutilización institucional: Ofrece un protocolo estandarizado y adaptable para programas continuos de vigilancia e investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad en la detección de patógenos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo diagnósticos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o no avance en la respuesta a brotes y la asignación de recursos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de los esfuerzos de vigilancia y las intervenciones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular y configuración de ensayos de qPCR.
- Necesita acceso a reactivos para la extracción de ARN, termocicladores e instrumentación de PCR en tiempo real.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a diversos tipos de tejidos y matrices de muestra con optimización del protocolo.
- Depende de la calidad de la muestra y la integridad del ARN para obtener resultados confiables.
