Name: Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante la supervisión de los estados de sueño/vigilia en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprende a manipular circuitos neuronales mediante optogenética durante el monitoreo de estados de sueño/vigilia en ratones. Este método permite estudiar la relación causal entre la actividad del BNST y la regulación del sueño con alta resolución temporal.

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Este estudio fue apoyado por el Programa de Estudios de Investigadores de Merck (#54843), una Subvención en Ayuda para La Investigación Científica de KAKENHI sobre áreas innovadoras, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) y una Subvención en Ayuda de KAKENHI para Investigación Exploratoria en Áreas Innovadoras (T.S.) (18H02595).

Todos los experimentos aquí fueron aprobados por el Comité de Experimento y Uso Animal de la Universidad de Tsukuba, cumpliendo con las directrices de NIH.
1. Cirugía animal, inyección de virus, electrodo para EEG/EMG e implantación de fibra óptica
PRECAUCION: Deben seleccionarse técnicas adecuadas de protección y manipulación en función del nivel de bioseguridad del virus que se va a utilizar. AAV se debe utilizar en una sala de inyección aislada con calificación P1A, y el tubo que transporta AAV debe esterilizarse con un autoclave después de que se haya agotado todo el volumen. El sitio quirúrgico y todo el material implantado deben estar limpios y estériles durante el uso. NOTA: Vea la figura1.
<ol><li>Desinfectar el equipo quirúrgico con el autoclave.</li>
	<li>Anestetizar ratones con isoflurano usando un vaporizador anestésico. Observe hasta que el ratón haya alcanzado la profundidad deseada de la anestesia, determinada por la pérdida de respuesta a pellizcar la cola con fórceps. Aplique pomada oftálmica en los ojos para evitar que se sequen.</li>
	<li>Desinfectar el campo quirúrgico con solución de yodo o 70% EtOH (3x) y secar lo suficiente. Permita que el virus se desconda sobre hielo mientras se realiza la cirugía. Cubra el área quirúrgica con papel de banco de laboratorio absorbente.</li>
	<li>Fije la cabeza del ratón en el aparato estereotáctico con barras de oído y un pellizco nasal. Después de confirmar que la cabeza se mantiene establemente, haga una incisión mediasgittal en el cuero cabelludo para asegurar se encuentran las posiciones del bregma y lambda en el mismo nivel en una línea horizontal.</li>
	<li>Para evitar un espacio de posicionamiento, ajuste adecuadamente los niveles de pellizcar la nariz y las barras de los oídos hacia arriba y hacia abajo. El bregma y lambda se refieren a la intersección entre la sutura saggitalis y sutura coronalis o sutura lambdoidal, respectivamente (Figura 2).</li>
	<li>Utilice abrazaderas Serafin para sujetar la piel y mantener el acceso al cráneo. Después de la exposición del cráneo, desinfectar la superficie del cráneo con yodo o 5% H2O2, para permitir que las suturas craneales incluyendo el bregma y lambda se visualicen más claramente.</li>
	<li>Preparar la inyección vectorial AAV:
	<ol>
<li>Lave el interior de una jeringa de 10 ml (ver Tabla de materiales)secuencialmente con 70% EtOH, 100% EtOH y agua esterilizada, 5 veces cada una. Fije la jeringa en la abrazadera de un brazo de bomba de microinyección y asegúrese de que se haya descargado toda la solución de la jeringa.</li>
		<li>Aspirar con cuidado 2 l de aceite mineral sin burbujas de aire, luego aspirar el volumen designado de la solución de virus. Después de la aspiración, manipule el botón del émbolo y confirme que la solución del virus emerge en la punta de la aguja. NOTA: El volumen de inyección de la solución de virus se determinó en experimentos piloto utilizando la misma cepa de ratón y el mismo producto de virus. La relación entre el volumen de solución del virus y la extensión de la zona de infección debe estimarse de antemano.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyectar vector AAV:
	<ol>
<li>Ajuste la punta de la aguja de microinyección en el bregma y anote las coordenadas como el punto original. Mueva la punta al lugar de inyección designado (para el BNST: anteroposterior + 0,2 mm, mediolateral a 1,0 mm, dorsoventral - 4,2 mm) y coloque la punta de la aguja en la posición. Ponga una marca en el cráneo y taladre agujeros de aproximadamente 2 mm de diámetro utilizando un taladro dental con una cortadora de metal duro de 0,7 mm. Tenga cuidado de no dañar la dura o el tejido cerebral.</li>
		<li>Después de extraer la sangre de alrededor de los orificios con un hisopo de algodón, mueva lentamente la aguja a la posición del BNST. Inyectar lentamente la cantidad designada de solución del virus (0,07 l/min) con un microinyector mecánico. Después de completar la inyección, deje la aguja durante 5 minutos para permitir que la solución se infiltre lo suficiente en el tejido BNST. Saque con cuidado la aguja.</li>
		<li>Para la inyección bilateral, repita los pasos 1.8.1-1.8.2 en el otro lado. Durante todo el procedimiento, mantenga el cráneo húmedo con aplicaciones de solución salina estéril. NOTA: Utilizamos implantes EEG/EMG personalizados (W: 5 mm, D: 7 mm, H: 1 mm) con cuatro electrodos EEG (4 mm), dos electrodos EMG (2 mm; cortar el electrodo de 4 mm a 2 mm con pinzadas) y 6 electrodos (4,5 mm) (Figura2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Soldar dos cables de acero inoxidable (ver Tabla de Materiales)de los cuales 1 mm del aislamiento se despoja de ambos extremos a los electrodos EMG. Ajustar el centro de los electrodos al bregma y marcar la posición de cada electrodo EEG (anteroposterior a 1,5 mm, mediolateral a 1,0 mm) y determinar la posición del implante (Figura2B).</li>
	<li>Fibras ópticas de implante:
	<ol>
<li>Fije una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo del manipulador de modo que tenga un ángulo de 30o contra una línea horizontal (este proceso sólo es necesario para evitar interferencias entre electrodos y fibras ópticas, como en el caso de la estimulación BNST). Ponga la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas.</li>
		<li>Mueva la punta a la línea de inserción objetivo y marque la posición en el cráneo. Coloque también marcas adicionales cerca del sitio de inserción para los tornillos de anclaje. Taladre el cráneo en cada sitio con un taladro dental para insertar la fibra óptica y fijar el tornillo. Fije el tornillo en el cráneo. Tenga cuidado de no romper la dura o dañar cualquier tejido por tornillo.</li>
		<li>Inserte la fibra óptica suavemente hasta llegar por encima del BNST con un manipulador. La férula debe recaer en el cráneo restante (Figura1B).</li>
		<li>Aplique cemento dental fotocurable (ver Tabla de Materiales)para cubrir la fibra y el tornillo. El tiempo de reacción para solidificar el pegamento debe especificarse en el manual del fabricante (Nuestro material necesita exposición a la luz durante al menos 10 s con fotogenerador de longitud de onda específica. No es necesario secar el pegamento después de esto).</li>
		<li>En este paso, asegúrese de que ningún material (tornillo o pegamento) ocupe el espacio de montaje de los electrodos. Además, evite realizar cualquier interrupción en el cemento para la férula que se conecta a la fibra óptica y el cable. Repita los pasos 1.10.1-1.10.4 en el lado opuesto para la estimulación bilateral.</li>
	</ol></li>
	<li>Agujeros de perforación para electrodos EEG/EMG. Inserte las puntas de los electrodos en los orificios. Sostenga el implante y aplique adhesivo de cianoacrilato en el espacio entre el cráneo y los electrodos. Inserte de nuevo con atención para no interferir con ningún material.</li>
	<li>Cubrir la circunferencia de los electrodos y fibras ópticas con adhesivo de cianoacrilato seguido de la aplicación de cianoacrilato accelerant en el adhesivo. Este paso evita causar cualquier interrupción en la zona de conexión de cable de ferrule-to-optic y electrode-to-lead (Figura1C). NOTA: El adhesivo de cianoacrilato y su acelerador son perjudiciales para el ojo del ratón. Preste atención para no causar derrames de estas sustancias químicas. Además, tenga cuidado de no tocar fuertemente los electrodos y las fibras con el fin de evitar la desviación inesperada inmediatamente después de la solidificación adhesiva.</li>
	<li>Exponer los músculos del cuello del ratón e insertar los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG para que se localice justo debajo de los músculos nucales. La conexión de luz entre la punta del electrodo y la fascia muscular es suficiente para captar la señal EMG.</li>
	<li>Aplique adhesivo de cianoacrilato para llenar los implantes y solidificar el adhesivo con líquido de aceleración. Luego, coloque el ratón en una almohadilla de calor para recuperarse hasta que aparezca el reflejo postural. Ajustar la temperatura de la almohadilla de calor a la temperatura corporal en reposo de los animales (36,0 oC en ZT 0-12 en el caso de ratones C57BL6; no exceda los 38,0 oC). NOTA: No se requiere un antibiótico para la cirugía estéril.</li>
	<li>Siga sus pautas institucionales locales para la analgesia postoperatoria. Mantenga a los ratones en una jaula doméstica durante un período de recuperación de al menos 7 días.</li>
</ol>2. Monitoreo de EEG/EMG con fotoexcitación de neuronas dirigidas en estados específicos del sueño
PRECAUCION: Este protocolo incluye el uso de equipos láser de clase 3B o dispositivos LED. Los experimentadores deben estar al tanto de la información de seguridad. Se requieren gafas protectoras.
<ol><li>Antes de conectar el cable láser a la fibra óptica, ajuste la intensidad del láser con un escalador. Ate la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada con una férula y confirme que no hay espacio en la unión entre la fibra y el cable.</li>
	<li>Encienda el interruptor principal del láser y espere 20 minutos para que se caliente.</li>
	<li>Emitir el láser al comprobador de intensidad y ajustar la intensidad del láser a 10 mW/mm2. Cambie el modo láser a la lógica del transistor y confirme que los pulsos de luz son emitidos por la fibra controlada por el regulador de patrón que se establece en 10 ms para la duración, 40 ms para el descanso, 20 veces para el ciclo, y 20 veces repetir (es decir, 20 Hz de 10 ms pulsos de luz para 20 s).</li>
	<li>Después del período de recuperación, mueva los ratones a la cámara experimental para registrar EEG/EMG. Ratones de la casa a una temperatura constante de 23oC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con alimentos y agua disponibles ad libitum.</li>
	<li>Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable que está atado a un anillo deslizante para evitar el enredo. Se recomienda cubrir la unión con material impermeable a la luz, como papel de aluminio para evitar fugas de láser. Si se requiere un experimento bilateral, utilice un anillo deslizante con un accesorio de bifurcación para los cables.</li>
	<li>En este protocolo, evaluamos la latencia a la vigilia desde el sueño NREM o el sueño REM, por lo que el tiempo de grabación debe limitarse en el tiempo optimizado zeitgeber (ZT0 se define como el momento en que la luz está encendida). Este protocolo se llevó a cabo entre ZT4 - ZT10. Deje que los ratones permanezcan libremente en la cámara experimental durante al menos 1 h como aclimatación.</li>
	<li>Durante el período experimental, monitoriza las señales EEG y EMG en el mismo monitor y evalúa el estado del ratón como vigilia, sueño NREM o sueño REM. Utilice el control de ganancia para cada onda para que sea más fácil distinguir cada estado.</li>
	<li>Para la medición del sueño NREM a la latencia de vigilia, observe sueño NREM estable para 40 s o sueño REM estable durante 30 s, luego encienda el interruptor del generador de patrones para la fotoestimulación (este protocolo genera 20 Hz de 10 ms pulsos de luz para 20 s). Confirme la emisión del láser a las fibras ópticas implantadas.</li>
	<li>Registre las señales EEG/EMG hasta que el estado de sueño cambie a la vigilia. Si se necesitan dos o más ensayos experimentales, limite la manipulación optogenética a una vez al día porque la fotoestimulación es una intervención artificial que podría afectar la arquitectura del sueño/vigilia.</li>
	<li>Después del experimento, anestesia profundamente y perpetúe con solución salina estéril y paraformaldehído (PFA) para el muestreo de todo el cerebro para el análisis inmunohistoquímico26.</li>
</ol>3. Análisis del tiempo de latencia desde NREM Sleep hasta Wakefulness
<ol><li>Después de grabar las señales EEG/EMG, transfiera los datos de la señal a un ordenador para puntuar los estados de sueño/vigilia. Este protocolo describe el método para el análisis de EEG con software de grabación (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Inicie la aplicación de signo de suspensión y haga clic en la pestaña Archivo y seleccione Abrir para elegir los datos grabados (archivo .kcd). Haga clic en la pestaña Suspender para seleccionar Tiempo de época para ajustar la ventana de tiempo para cada época (utilizamos 1 época/4 seg).</li>
	<li>Puntuación manual de estados de sueño/vigilia basados en señales EEG/EMG, de acuerdo con los siguientes criterios: vigilia, alta EMG y baja tensión EEG con alta frecuencia; NREM, tono EMG bajo y alto voltaje EEG con alta frecuencia de (0,5-4 Hz); y REM, EMG indica atonía muscular y baja tensión EEG con alta frecuencia de 6-9 Hz. Un estado que no continúa consecutivamente durante 16 s (es decir, 4 épocas) no se define como un cambio de estado porque no es un estado estable.</li>
	<li>Haga clic y mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón en la primera época y arrastre el cursor hasta que finalice la tendencia específica de más de 16 s (4 épocas). A continuación, suelte el botón izquierdo del ratón y elija el estado adecuado (vigilia o sueño NREM o sueño REM) en la ventana emergente. Repita este procedimiento para puntuar todas las señales EEG/EMG registradas en el archivo.</li>
	<li>Encuentre la hora exacta de estimulación en la época en la que el EEG muestra sueño NREM o REM, y la época que muestra la transición de estado después del punto de estimulación. Cuente el número de épocas entre los períodos justo después de la estimulación y justo antes de la transición del estado.</li>
	<li>A continuación, multiplique el número contado de épocas por 4 s (A). En la época de la estimulación, tome una captura de pantalla y mida la anchura entre el punto de estimulación y el final de la época. A continuación, divida la longitud medida por toda la longitud de la época y multiplique por 4 s (B). Del mismo modo, calcule la duración del sueño NREM en la época del cambio de estado, lo que significa el tiempo entre el inicio de la época y el punto de cambio de estado (C).</li>
	<li>Suma A, B y C para obtener la latencia del sueño NREM a la vigilia. El mismo procedimiento se utiliza para el análisis de la transición de estado de sueño REM a vigilia.</li>
</ol>

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<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li>
</ol>

Este proyecto fue apoyado financieramente por Merck & Co.

Aquí presentamos un método para evaluar el efecto de la estimulación optogenética de las neuronas con identidades químicas particulares en las transiciones de estado de sueño / vigilia y dio un ejemplo de manipulación de las neuronas GABABNST. Nuestros datos mostraron que la excitación optogenética de las neuronas GABABNST resulta en la transición inmediata del sueño NREM a la vigilia.
Varios diseños experimentales están disponibles debido al desarrollo de numerosos tipos...

El sueño es esencial para una función cognitiva óptima. Los hallazgos recientes también sugieren que las alteraciones en el sueño se asocian con una amplia gama de enfermedades1,2,3. Aunque las funciones del sueño están todavía en gran medida sin resolver, recientemente se han hecho progresos sustanciales en la comprensión de los circuitos neuronales y mecanismos que controlan los estados de sueño/vigilia4. En los mamíferos, hay tres estados de vigilancia: vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido (NREM) y sueño de movimiento ocular rápido (REM). La vigilia se caracteriza por oscilaciones EEG rápidas (5-12 Hz) de baja amplitud con actividad motora intencionada y sostenida. El sueño NREM se define por oscilaciones lentas (1-4 Hz) de alta amplitud (ondas delta), con falta de conciencia y actividad motora deliberada. El sueño REM se caracteriza por oscilaciones relativamente rápidas (6-12 Hz)de baja amplitud y casi completa atonía muscular bilateral 5.
Borbely propuso una teoría de la regulación de la vigilia del sueño conocida como los dos modelos de proceso6,7. Un proceso homeostático, también conocido como proceso S, representa la presión del sueño que se acumula durante la vigilia y se disipa durante el sueño. Otro proceso, conocido como proceso C, es un proceso circadiano, que explica por qué los niveles de vigilancia fluctúan en el ciclo de 24 h. Además de estos dos procesos, los factores alostáticos también son importantes para la regulación del sueño/vigilia8,9. Los factores allostáticos incluyen estados nutricionales y emociones. El miedo y la ansiedad suelen ir acompañados de un aumento de la excitación junto con las respuestas autonómicas y neuroendocrinas10,11,12. Se cree que el sistema límbico desempeña un papel en la regulación del miedo y la ansiedad, y los mecanismos subyacentes a las respuestas autonómicas y neuroendocrinas se han estudiado extensamente, pero la vía por la cual el sistema límbico influye en los estados de sueño/vigilia no ha sido aún así se han revelado. Un gran número de estudios recientes con opto- y farmacogenética han sugerido que las neuronas y circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia se distribuyen por todo el cerebro, incluyendo los cortices, el antecefálico basal, el tálamo, el hipotálamo, y el tallo cerebral. En particular, los recientes avances en optogenética nos han permitido estimular o inhibir circuitos neuronales específicos in vivo con altas resoluciones espaciales y temporales. Esta técnica permitirá avanzar en nuestra comprensión de los sustratos neuronales del sueño y la vigilia, y cómo los estados de sueño/vigilia están regulados por procesos circadianos, presión de sueño y factores alostáticos, incluyendo la emoción. Este artículo tiene como objetivo introducir cómo utilizar la manipulación optogenética combinada con la grabación de sueño/vigilia, que podría tener el potencial de actualizar nuestra comprensión de los connectomes y mecanismos en el cerebro que juegan un papel en la regulación del sueño NREM, sueño REM, y la vigilia. La comprensión de este mecanismo por el cual el sistema límbico regula los estados de sueño/vigilia es de suma importancia para la salud, porque el insomnio generalmente se asocia con la ansiedad o el miedo a no poder dormir (somnifobia).
Se cree que el BNST juega un papel esencial en la ansiedad y el miedo. GAD 67-expresando neuronas GABAérgicas son una población importante del BNST12,13. Examinamos el efecto de la manipulación optogenética de estas neuronas (GABABNST) en estados de sueño/vigilia. Uno de los mayores avances en neurociencia en los últimos años han sido los métodos que permiten la manipulación de las neuronas con identidades químicas particulares in vivo, con altas resoluciones espaciales y temporales. La optogenética es muy útil para demostrar vínculos causales entre la actividad neuronal y las respuestas conductuales específicas14. Describimos la optogenética como un método para examinar la conectividad funcional de los circuitos neuronales definidos en la regulación de los estados de sueño/vigilia. Mediante la utilización de esta técnica, se ha logrado un gran progreso en la comprensión de los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia15,16,17,19,19 . En muchos casos, las opsins se introducen específicamente en neuronas con identidades químicas particulares en regiones cerebrales selectivas mediante una combinación de ratones Cre-driver y transferencia de genes mediada por AAV inducible Cre. Además, la expresión focal de opsins fotosensibles como la cifrodopsina 2 (ChR2)20 o la arqueerhodopsina (ArchT)21 combinada con un sistema Cre-loxP o Flp-FRT nos permite manipular una población neuronal selectiva y específica vía neural22.
Aquí describimos los experimentos sobre neuronas GABAérgicas en el BNST como un ejemplo. Para expresar opsins en una población neuronal designada, se utilizan con mayor frecuencia ratones conductores de Cre apropiados y vectores de virus dependientes de Cre. También son útiles las líneas transgénicas o de impacto en las que las opsins se expresan en determinadas poblaciones neuronales. En los siguientes experimentos, utilizamos ratones knock-in GAD67-Cre 23 en los que sólo las neuronas GABAérgicas expresan la recombinación de Cre con un fondo genético C57BL/6J, y un vector AAV que contiene ChR2 (hChR2 H134R) fusionado con EYFP o EYFP como un vector de control con un interruptor "FLEx (Flip-escision)"24. El procedimiento describe específicamente la excitación optogenética de las neuronas GABAérgicas en el BNST durante el seguimiento de los estados de sueño/vigilia25.

<table><tbody><tr><td>1x1 Juntas rotativas de fibra óptica</td><td>Doric</td><td>FRJ 1x1 FC-FC</td><td>para optogenética</td></tr><tr><td>Cabezal de 6 pines</td><td>KEL corporation</td><td>DSP02-006-431G</td><td></td></tr><tr><td>Zócalo de 6 pines</td><td>Hirose</td><td>21602X3GSE</td><td></td></tr><tr><td>Convertidor A/D</td><td>NIPPON KODEN</td><td>N/A</td><td>A Convertidor analógico a digital</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td><td></td><td></td><td>3.70 veces; 1013(copias genómicas/ml)</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td><td></td><td></td><td>5.82&veces; 1013(copias genómicas/ml)</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Película Fuji</td><td>014-23302</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>para registro de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Vaporizador anestésico</td><td>Muromachi</td><td>MK-AT-210D</td><td></td></tr><tr><td>Inyector automático</td><td>KD scientific</td><td>780311</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de carburo</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td>&phi; 0,7 mm. Recomendado como taladro dental, utilizado con micromotor rotativo de alta velocidad&nbsp;</td></tr><tr><td>Adhesión de cianoacrilato&nbsp; (Aron alfa A) y aceleración</td><td>Konishi</td><td>#30533</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de polimerización dental</td><td>3M</td><td>Elipar S10</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo epoxi</td><td>Konishi</td><td>#04888</td> aislamiento <td>alrededor de la soldadura de 6 pines y cable blindado</td></tr><tr><td>Cable de conexión de fibra óptica (ramificación)</td><td>Doric</td><td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td><td></td></tr><tr><td>Gad67-Cre</td><td>ratones proporcionados por el Dr. Kenji Sakimura</td><td></td><td>El gen de la recombinasa Cre se encuentra en el alelo Gad67</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>65461-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de micromotor rotativo de alta velocidad</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Se utiliza con el cortador de carburo</td></tr><tr><td>Manguito de interconexión</td><td>Thorlab</td><td>ADAF1</td><td>&phi; 2,5 mm Cerámica&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pfizer</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>Láser&nbsp; &nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>N/A</td><td>Longitud de onda de 473 nm</td></tr><tr><td>Comprobador de intensidad láser</td><td>COHERENTE</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador láser</td> Bio <td>centro de investigación</td><td>STO2</td><td>referenciado como generador de pulsos en texto</td></tr><tr><td>Fibra óptica con férula &nbsp;</td><td>Thorlab</td><td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-rh10</td><td>proporcionado por PennVector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>Addgene</td><td>plasimid # 20296</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>proporcionado por el Dr. Karl Deisseroth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cordón de parche</td><td>Doric</td><td>D202-9089-0.4</td><td>0.4m de longitud, conductor láser entre láser y junta rotativa</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cemento dental fotocurable</td><td>3M</td><td>56846</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Serafin</td><td>Stoelting</td><td>52120-43P</td><td></td></tr><tr><td>Cable blindado</td><td>mogami</td><td>W2780</td><td>Soldadura a zócalo de 6 polos para registro de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Cámara de registro del sueño</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fabricado en cubo (21 cm; 29 cm y 19 cm) con soporte para depósito de</td></tr><tr><td>agua Software de señalización del sueño</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>para análisis de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Anillo colector</td><td>neuroscience,inc</td><td>N/A</td><td>para análisis de EEG/EMG</td></tr><tr><td>Tornillo de acero inoxidable</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi; 1.0 x 2.0</td></tr><tr><td>Alambre inoxidable</td><td>Alambre Cooner</td><td>AS633</td><td>&nbsp; 0.0130 pulgadas de diámetro</td></tr><tr><td>Marco estereotáxico con consola digital</td><td>Koph</td><td>N/A</td><td>Modelo 940</td></tr><tr><td>Aguja de jeringa</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Software de grabación vital</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>para registro de EEG/EMG</td></tr></tbody></table>

manipulación optogenética de circuitos neuronales durante la supervisión de los estados de sueño/vigilia en ratones

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

En los últimos años, la optogenética ha sido ampliamente utilizada en muchos campos de la investigación neurocientífica. En muchos casos, una opsin, como la rodopsina de canal 2 (ChR2), se expresa mediante un vector de virus en un tipo particular de células neuronales en varios ratones Cre-driver. La activación de estas opsins se activa mediante la aplicación de pulsos de luz que se entregan por láser o LED a través de cables ópticos, y el efecto de la activación se observa con una resolución de tiempo muy alta. Los experimentadores son capaces de estimular agudamente las neuronas mientras monitorean el comportamiento u otro resultado fisiológico en ratones. La optogenética puede permitir estrategias útiles para evaluar la función de los circuitos neuronales en la regulación de los estados de sueño/vigilia en ratones. Aquí describimos una técnica para examinar el efecto de la manipulación optogenética de las neuronas con una identidad química específica durante el electroencefalograma (EEG) y la monitorización del electromiograma (EMG) para evaluar la etapa del sueño de los ratones. Como ejemplo, describimos la manipulación de las neuronas GABAérgicas en el núcleo de la cama de la estría terminalis (BNST). La excitación optogenética aguda de estas neuronas desencadena una rápida transición a la vigilia cuando se aplica durante el sueño NREM. La manipulación optogenética junto con la grabación EEG/EMG se puede aplicar para descifrar los circuitos neuronales que regulan los estados de sueño/vigilia.

El presente estudio mostró el efecto de la excitación optogenética de las neuronas GABABNST en la transición del estado del sueño. ChR2-EYFP se expresó focalmente en las neuronas GABA en el BNST. Un estudio histoquímico de hibridación in situ mostró que ChR2-EYFP fue colocalizado en neuronas que expresan señales de MRNA GAD 67, lo que indica que estas son neuronas GABAérgicas. Las muestras de rodajas inmunohistoquímicas confirmaron la posición de la fibra óptica, cuya punta est...

Aquí, describimos métodos de manipulación optogenética de determinados tipos de neuronas durante la monitorización de los estados de sueño/vigilia en ratones, presentando nuestro trabajo reciente en el núcleo de la estría terminal is como ejemplo.

Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante la supervisión de los estados de sueño/vigilia en ratones

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Este procedimiento puede ayudarnos a identificar la función de circuito neuro específico que intervienen en la regulación de la vigilia del sueño con menos manipulación invasiva y alta resolución temporal. Este método nos permite el monitoreo de la superficie EEG en tiempo real junto con la manipulación de un circuito neuro específico para examinar la relación causal entre los circuitos y los estados de vigilia del sueño. Shota Kodani va a demostrar el procedimiento.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del otro, aplicar ungán al ojo del animal y utilizar las barras de oído y el pasador de la nariz en el aparato estereotáctico para estabilizar la cabeza del ratón anestesiado en una almohadilla absorbente. Cuando la cabeza esté fijada en su posición, haga una incisión de hundimiento medio en el cuero cabelludo para confirmar que la intersección entre la sutura sagittalis y la sutura coronalis o sutura lambdoidea están en una línea horizontal al mismo nivel. Para evitar un espacio de posicionamiento, ajuste el pellizco de la nariz y las barras de las orejas según sea necesario.Luego, usando abrazaderas de serafína para mantener la piel abierta desinfectar la superficie expuesta del cráneo para permitir que las suturas craneales se visualicen más claramente. Para inyectar el vector del virus asociado al adeno, cargue una jeringa esterilizada con etanol de 10 mililitros con dos microlitros de aceite mineral, seguido del volumen experimental del virus que se va a inyectar. Utilice la bomba de microinyección para ajustar la punta de la aguja de microinyección en el bregma y observe las coordenadas como el punto de origen.A continuación, mueva la punta al lugar de inyección designado y coloque la punta de la aguja en la posición. Marque el cráneo en el lugar de inyección y utilice un taladro dental equipado con un cortador de carburo de 0,7 milímetros para perforar un agujero de aproximadamente dos milímetros de diámetro en el cráneo. Después de extraer sangre de alrededor del agujero con un hisopo de algodón, mueva lentamente la aguja al núcleo de la cama de la estrías terminalis o BSNT e inyecte lentamente el volumen designado de solución ánltica.A continuación, deje la aguja en su lugar durante cinco minutos para permitir que la solución se infiltre lo suficiente en el tejido BNST antes de retraer cuidadosamente la aguja. Para electroencefalograma, o EEG, y electromiograma, o EMG, implantación de electrodos, primero soldar dos alambres de acero inoxidable de los cuales se ha despojado un milímetro de aislamiento de ambos extremos a los electrodos EMG y colocar el centro de los electrodos en el bregma. A continuación, marque la posición de cada electrodo EEG.Para determinar la posición del implante de fibra óptica, conecte una férula de fibra óptica al manipulador y gire el brazo manipulador a un ángulo más o menos de 30 grados contra una línea horizontal. Ponga la punta de fibra en el bregma y registre las coordenadas. Mueva la punta a la línea de inserción objetivo y marque la posición en el cráneo y la posición del tornillo de anclaje junto al sitio de inserción.Utilice el taladro dental para perforar el cráneo en cada sitio y utilice el manipulador para insertar suavemente la fibra óptica hasta que llegue por encima del BNST. La férula debe descansar sobre el cráneo restante. Fije la fibra al cráneo con un tornillo de anclaje, teniendo cuidado de no romper la dura o dañar ningún tejido.A continuación, cubra la fibra y atornille con cemento dental fotocurable. A continuación, taladre agujeros para electrodos EEG/EMG e inserte la punta del primer electrodo en un orificio. Sosteniendo el implante con una mano, aplicar adhesivo de cianoacrilato al espacio entre el cráneo y el electrodo e insertar el electrodo el resto del camino, teniendo cuidado de no dañar ningún tejido.Cuando se hayan colocado todos los electrodos, cubra la circunferencia de los electrodos y las fibras ópticas con adhesivo adicional de cianoacrilato y acelerador de cianoacrilato para evitar causar cualquier interrupción en la férula al cable óptico y electrodo a las zonas de conexión del cable de plomo. Ahora exponga los músculos del cuello e inserte los cables para el electrodo EMG debajo del músculo. Ajuste la longitud del electrodo EMG de modo que encaje justo debajo de los músculos nucales y llene los implantes con más adhesivo y acelerador de cianoacrilato.A continuación, coloque el ratón sobre una almohadilla de calor con monitoreo hasta que se recompensa completa. Para la monitorización de EEG/EMG durante la fotoexcitación de neuronas dirigidas, primero utilice un escalar para ajustar la intensidad del láser y utilice una férula para amarrar la punta del cable láser a una fibra óptica no utilizada. Confirme que no hay espacio en la unión entre la fibra y el cable.Después de 20 minutos, emita el láser calentado al comprobador de intensidad y ajuste la intensidad a 10 milivatios por milímetro cuadrado. Establezca la duración del pulso de luz en 10 milisegundos, el período de descanso en 40 milisegundos, el ciclo en 20 y la repetición en 20. Cambie el modo láser a la lógica del transistor y confirme que los pulsos de luz se emiten desde la fibra controlada por el regulador del patrón.Conecte el electrodo implantado y el adaptador de cable y, a continuación, cubra la unión con material impermeable ligero para evitar fugas de láser. Y cuando el láser esté listo, mueva los ratones a la cámara experimental para la grabación EEG/EMG. Para evaluar la latencia a la vigilia de movimiento ocular no rápido o sueño de movimiento ocular rápido, limite el tiempo de grabación y el tiempo de ganancia optimizado del sitio y deje que los ratones se muevan libremente en la cámara experimental durante al menos una hora.Durante el período experimental, monitoree las señales EEG y EMG en la misma pantalla de grabación. Evalúe el estado del ratón como vigilia, sueño de movimiento ocular no rápido o sueño de movimiento ocular rápido usando el control de ganancia para cada onda para facilitar la distinción de cada estado. Para la medición del sueño de movimiento ocular no rápido a la latencia de vigilia, observe el sueño estable de movimiento ocular no rápido durante 40 segundos, luego encienda el generador de patrones para la estimulación fotográfica y confirme la emisión láser a las fibras ópticas implantadas.A continuación, registre las señales EEG/EMG hasta que el estado de suspensión cambie a vigilia. Aquí se muestran rastros de EEG/EMG representados antes y después de la estimulación fotográfica durante el sueño no rápido del movimiento ocular. Un EEG de alto voltaje y frecuencia lenta sin señales EMG, representa el sueño no rápido del movimiento ocular.La estimulación fotográfica desencadenó una transición aguda a la vigilia unos dos segundos después de la estimulación en ratones que expresan la canalización-2 mientras que los ratones de control no demostraron esta transición, lo que sugiere que la excitación de las neuronas BNST GABA durante el sueño de movimiento ocular no rápido desencadena una rápida inducción de vigilia. Por el contrario, la estimulación fotográfica durante el sueño de movimiento ocular rápido no tuvo ningún efecto, por lo que un efecto de transición sólo surgió en el sueño de movimiento ocular no rápido. Es importante tener cuidado con las coordinaciones precisas para la inyección de virus y los pasos de implantación de fibra óptica.Los rastros EEG/EMG capturados durante el análisis del sueño se pueden utilizar para evaluar las consecuencias de la manipulación de la foto en los diferentes estados vigilantes en ratones. Esta técnica también nos ayudará a identificar otros componentes y circuitos involucrados en la regulación de los estados de vigilia del sueño. Utilice gafas protectoras para evitar daños por láser en el ojo y asegúrese de esterilizar siempre el autoclave el contenedor vectorial de virus asociado al adeno después de su uso.

optogenetic-manipulation-neural-circuits-during-monitoring

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un procedimiento para la manipulación de la actividad de las neuronas piramidales corticales cerebrales optogenetically mientras que el electroencefalograma, electromiograma, y ​​la concentración de lactato cerebral son monitoreados. Grabaciones experimentales se realizaron en ratones de cable-atados mientras se someten espontáneas de sueño / vigilia ciclos. Optogenético equipo es ensamblado en nuestro laboratorio; aparato de control está disponible comercialmente.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Fuente: Kodani, S., et.al. Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante el monitoreo de estados de sueño / vigilia en ratones. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la manipulación optogenética de los circuitos neuronales involucrados en la transición del sueño a la vigilia en ratones. El procedimiento consiste en implantar quirúrgicamente una fibra óptica y electrodos en el cerebro y los músculos para permitir la estimulación de la luz y el registro electrofisiológico. Al...

Manipulación optogenética de circuitos neuronales para la transición del sueño a la vigilia en ratones

Este video muestra un protocolo para modular las oscilaciones theta en un modelo de ratón modificado genéticamente con canales iónicos sensibles a la luz en sus neuronas del tabique medial GABAérgico. Al entregar pulsos de luz al hipocampo, el protocolo tiene como objetivo sincronizar la actividad neuronal y generar oscilaciones theta, que se registran como potenciales de campo local.

Manipulación selectiva de oscilaciones theta en un modelo de ratón

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

El registro del electroencefalograma (EEG) y el electromiograma (EMG) en ratones que se comportan libremente es un paso crítico para correlacionar el comportamiento y la fisiología con el sueño y la vigilia. El protocolo experimental descrito en este documento proporciona un sistema basado en cable para adquirir registros de EEG y EMG en ratones.

Poligráfico Procedimiento de Grabación en medición del sueño en ratones

Aquí, presentamos procedimientos experimentales y analíticos para describir la dinámica temporal de las variables neuronales y cardíacas del sueño no REM en ratones, que modulan la respuesta del sueño a los estímulos acústicos.

Cuantificación de la dinámica infrarroja de la potencia espectral y la frecuencia cardíaca en ratones dormidos

Describimos el uso de optogenetics y grabaciones electrofisiológicas para la manipulación selectiva de oscilaciones de hippocampal de la theta (5-10 Hz) en ratones de comportarse. La eficacia del arrastre de ritmo se controla usando el potencial de campo local. Una combinación de opto - e inhibición farmacogenética aborda la lectura eferente del hipocampo sincronización.

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Se describe un método de alto rendimiento de medición de sueño por medio de la actividad casa jaula monitoreo. Este método ofrece ventajas sobre los métodos tradicionales basados en el EEG. Bien validado para la determinación de la duración total del sueño y puede ser una poderosa herramienta para controlar el sueño en modelos de roedores de la enfermedad humana.

Determinación no invasiva, de alto rendimiento de la duración del sueño en roedores

Este trabajo presenta un método para realizar un optogenetic de una sola unidad grabación fiable desde un ratón despierto utilizando un optrode de cristal a medida.

Optogenetics identificación de un tipo Neuronal con un vidrio Optrode en ratones despiertos

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Este artículo describe un protocolo para la manipulación de dianas moleculares en la corteza cerebral utilizando virus adenoaso asociados y para monitorear los efectos de esta manipulación durante la vigilia y el sueño utilizando registros electrocorticográficos.

Registro electrocorticográfico de áreas de la corteza cerebral manipuladas con un virus adenoaso asociado dirigido a la cofilina en ratones

Aprende a manipular circuitos neuronales mediante optogenética durante el monitoreo de estados de sueño/vigilia en ratones. Este método permite estudiar la relación causal entre la actividad del BNST y la regulación del sueño con alta resolución temporal.

Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante la supervisión de los estados de sueño/vigilia en ratones

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