Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico
14 de marzo de 2019
Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación traslacional, como la relación entre los biomarcadores circulantes y el pronóstico del paciente. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de evaluar la expresión de un panel de biomarcadores circulantes con una metodología fácil y fiable con baja cantidad de material de entrada. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de pacientes con cáncer porque podría identificar biomarcadores circulantes útiles en la toma de decisiones y el seguimiento del tratamiento de los pacientes.
Además, este método puede proporcionar información sobre el análisis de biomarcadores circulantes. También se puede aplicar a otros sistemas, como el análisis de expresión de biomarcadores de tejidos para la caracterización molecular de la enfermedad. La demostración visual de este método es crítica, ya que los pasos de extracción son difíciles de aprender.
Para empezar, transfiera 400 microlitros de la muestra de plasma a un tubo de dos mililitros sin RNase. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de desnaturalizadora al tubo. Agregue cuatro microlitros de un pinchatro nanomolar.
Después de mezclar la solución, añadir 800 microlitros de fenol-cloroformo ácido. Vórtice la solución durante 60 segundos, y centrifugar a máxima velocidad durante 15 minutos. A continuación, transfiera el izado contenido en la fase acuosa superior a un tubo limpio, teniendo cuidado de no perturbar la interfase.
Mida el volumen de la fase acuosa recuperada y añada 1/3 de volumen de etanol al izado. A continuación, coloque un cartucho de filtro en un tubo de recogida nuevo. Transfiera hasta 700 microlitros de la mezcla de etanol-izado al cartucho de filtro.
Centrifugar el cartucho del filtro durante 30 segundos a 10.000 veces la gravedad. A continuación, mida el volumen total del flujo a través. A continuación, agregue 2/3 del volumen de etanol al filtrado y mezcle bien.
Coloque un segundo cartucho de filtro en un tubo de recogida fresco. A continuación, transfiera hasta 700 microlitros de la muestra al cartucho y centrifugar a 10.000 veces la gravedad durante 30 segundos antes de descartar el flujo a través. Agregue 700 microlitros de solución de lavado de microRNA al cartucho del filtro y centrífelo con un tubo de recogida a 10.000 veces la gravedad durante 15 segundos.
Deseche el paso de flujo y vuelva a colocar el cartucho del filtro en el mismo tubo. Después de esto, mueva el cartucho del filtro a un nuevo tubo de recogida. A continuación, añada 100 microlitros de solución de elución precalentada al cartucho.
Centrifugar el cartucho del filtro a 10.000 veces la gravedad durante 30 segundos para recuperar los microRNAs. Preparar el cóctel de mezcla de reacción de poliadenilación de acuerdo con el protocolo de texto. Transfiera dos microlitros de la muestra a cada pozo de una placa de reacción.
A continuación, agregue tres microlitros del cóctel de reacción a cada pozo. Vórtice y centrifugar la placa brevemente para girar hacia abajo el contenido. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto.
Prepare el cóctel de mezcla de reacción de ligadura en un tubo centrífugo. A continuación, añada 10 microlitros del cóctel a cada pozo de la placa de reacción. A continuación, mezcle el contenido de la placa de reacción en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguido de una breve centrífuga de la placa.
Después de esto, coloque la placa de reacción en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto. Para realizar la reacción de transcripción inversa, prepare la mezcla de reacción en un tubo de centrífuga de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, añada 15 microlitros de la mezcla a cada pocód en el pozo de la placa que contiene el producto de ligadura.
Mezclar el contenido de la placa en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguido de una breve centrífuga de la placa. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en el protocolo de texto. A continuación, prepare la mezcla de reacción miR-Amp y agregue 45 microlitros de la mezcla a cada pozo de una nueva placa de reacción.
Después de esto, añadir cinco microlitros del producto RT a cada pozo de la placa de reacción. Mezclar la placa en una coctelera a 1.900 rpm durante un minuto, seguida de una breve centrífuga de la placa. A continuación, coloque la placa en un ciclor térmico y siga el procedimiento descrito en la tabla uno del protocolo de texto.
Primero, diluya cada muestra de ADNc en el búfer TE. A continuación, prepare la mezcla de reacción PCR en un tubo centrífugo. añadiendo el 10% del volumen en exceso.
Transfiera 19 microlitros de la mezcla de reacción a cada pozo de la placa. Selle la placa y centrifuga brevemente. Finalmente, realice el protocolo térmico en un sistema RT-PCR, como se describe en la tabla dos del protocolo de texto.
Se realizaron diluciones en serie de control de picos para elegir cuál era la mejor concentración para añadir en todas las muestras plasmáticas de esta serie de casos en particular. Gracias a este protocolo, fue posible evaluar todos los biomarcadores en cada paciente, así como un solo biomarcador en la serie de casos generales. En este protocolo, se analizó un panel de miRNAs circulantes relacionados con la angiogénesis en relación con la supervivencia libre de progresión, la supervivencia global y la tasa de respuesta objetiva en pacientes con cáncer colorrectal tratados con un régimen de quimioterapia.
Comparando los niveles de expresión de miRNA entre la línea de base y la primera evaluación clínica, se observó un aumento en has-miR-155-5p. Este aumento se asoció con SLP y sistema operativo más cortos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar los pasos usando fenol-cloroformo bajo una campana de humo. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aislamiento y el análisis de proteínas circulantes o la codificación de ARN para responder a preguntas adicionales, como la evaluación de un panel más exhaustivo de biomarcadores circulantes.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biopsia líquida exploraran la expresión de biomarcadores circulantes en pacientes con cáncer. No olvide que trabajar con sangre y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como guantes y bata de laboratorio durante la realización de este procedimiento.
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Resumen
Este artículo presenta un método para evaluar los niveles de expresión de microARN (miARN) circulantes en muestras de plasma de pacientes con cáncer. La técnica utiliza un kit disponible comercialmente para la extracción de miARN y la transcripción inversa, seguida del análisis de un panel de 24 miARN seleccionados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biomarcadores
- Investigación del cáncer
Antecedentes
- Los biomarcadores circulantes pueden proporcionar información sobre el pronóstico del paciente.
- La evaluación de los niveles de miARN puede ayudar en la toma de decisiones terapéuticas.
- La metodología permite el análisis con una cantidad mínima de material de entrada.
- Las demostraciones visuales son esenciales para comprender el proceso de extracción.
Objetivo del estudio
- Evaluar la expresión de microARNs circulantes en pacientes con cáncer.
- Identificar posibles biomarcadores para el seguimiento del tratamiento.
- Mejorar la comprensión de la relación entre biomarcadores y pronóstico.
Métodos Utilizados
- Extracción de microARNs circulantes de muestras de plasma.
- Transcripción inversa de microARNs extraídos.
- Análisis de un panel de 24 microARNs seleccionados.
- Uso de placas personalizadas con sondas predepositadas en tiempo real.
Resultados Principales
- El método proporciona resultados confiables con una cantidad baja de material de entrada.
- Permite la evaluación simultánea de múltiples biomarcadores circulantes.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar el monitoreo del tratamiento y la toma de decisiones.
- Las aplicaciones potenciales se extienden al análisis de biomarcadores tisulares.
Conclusiones
- Esta técnica es valiosa para la investigación traslacional en cáncer.
- Puede conducir a mejores resultados en pacientes mediante una mejor identificación de biomarcadores.
- Los recursos visuales son cruciales para dominar la metodología de extracción.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los enfoques de biopsia líquida que utilizan microARNs circulantes ofrecen una estrategia mínimamente invasiva para monitorear la progresión del cáncer colorrectal metastásico y la respuesta terapéutica. Este método permite la evaluación cuantitativa de paneles de biomarcadores a partir de volúmenes limitados de plasma, lo que favorece la detección temprana de mecanismos de resistencia y orienta los ajustes del tratamiento. Al proporcionar datos cuantitativos reproducibles sobre la expresión de microARNs, la técnica contribuye a la toma de decisiones basada en biomarcadores en el desarrollo de fármacos oncológicos y en el diseño de ensayos clínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la dinámica de biomarcadores circulantes para apoyar la generación de hipótesis en vías relacionadas con la angiogénesis.
- Valor operativo: Proporciona un protocolo estandarizado para la extracción y cuantificación de miARN a partir de plasma, reduciendo la variabilidad en la detección temprana de biomarcadores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Facilita la preparación de muestras de plasma validadas para el análisis posterior mediante qRT-PCR de paneles múltiples de miARN.
- Valor operativo: Apoya la estandarización del ensayo mediante pasos definidos de extracción, retrotranscripción y normalización, utilizando el software GeNorm y Expression Suite.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona los cambios en la expresión de microARN circulantes (por ejemplo, hsa-miR-155-5p) con resultados clínicos como la supervivencia libre de progresión y la supervivencia global, permitiendo la evaluación de biomarcadores pronósticos.
- Valor operativo: Establece un método técnicamente robusto adecuado para el monitoreo longitudinal en estudios preclínicos y clínicos.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en el proceso de descubrimiento al permitir el análisis de biomarcadores que aporta información para la validación de dianas, la preparación de ensayos y la conexión traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el papel de los microARN circulantes en la progresión del cáncer y la respuesta terapéutica.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles a partir de muestras de plasma, lo que permite evaluar de forma confiable los efectos de compuestos o biomarcadores.
- Análisis: Genera datos de expresión normalizados adecuados para análisis estadístico y su correlación con puntos finales clínicos.
- Investigación Traducional: Conecta las mediciones moleculares con los resultados en pacientes, apoyando decisiones de avance ajustadas al riesgo.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma reutilizable para el análisis de biomarcadores circulantes en múltiples indicaciones en oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en las relaciones entre biomarcadores y enfermedades mediante mediciones cuantitativas y reproducibles.
- Valor operativo: Proporciona un flujo de trabajo robusto técnicamente y de bajo requerimiento de muestra, adecuado para la detección de alto rendimiento de biomarcadores.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar o descartar proyectos al permitir la identificación temprana de biomarcadores pronósticos asociados con resultados de supervivencia.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos basada en la modulación del biomarcador y su correlación clínica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de ARN y en qRT-PCR para prevenir la degradación y garantizar una cuantificación precisa.
- Depende del acceso a sistemas de extracción con fenol-cloroformo, cicladores térmicos e instrumentación de PCR en tiempo real.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de extracción y normalización para obtener resultados reproducibles en diferentes sitios.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método a distintos tipos de biofluidos o modelos de enfermedad.
- Comprende limitaciones prácticas relacionadas con el manejo de reactivos peligrosos y la necesidad de usar campanas extractoras durante los pasos con fenol-cloroformo.
