Name: Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda técnicas fluorimétricas para evaluar la integridad de membranas espermáticas mediante sondas fluorescentes, microscopía y citometría de flujo. Estos métodos permiten predecir el potencial de fertilización con precisión.

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Los autores desean agradecer a compañía israelí "SION" para la inseminación artificial y cría (Hafetz Haim, Israel) por su ayuda y cooperación y la Sra. Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francia) para obtener ayuda con la configuración del instrumento y entrenamiento.

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices israelíes de 1994 para el bienestar animal. Espermatozoides bovinos fue suministrado por empresa comercial israelí para la inseminación artificial y cría. Eyaculados de 11 toros fueron evaluados en este estudio.
1. preparación de muestras de esperma
Nota: El procedimiento se basa en protocolo1,3 del laboratorio Roth.
<ol><li>Obtener aproximadamente de 1 a 6 mL de semen de toro en un tubo de 15 mL a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cada 1 ml de semen, añadir 6 mL de tampón NKM precalentado (a 37 ° C) (110 mM NaCl, KCl, de 5 mM 20 mM fregonas [ácido propanesulfonic 3-N-morphilino; pH 7.4]) y centrifugar para 8 min a 600 x g, 1 – 2 veces hasta que el sobrenadante esté claro. Nota: Si la concentración espermática o el volumen inicial es muy alto, dividida en dos tubos en el primer lavado.</li>
	<li>Quitar inmediatamente y desechar el sobrenadante y dejar aproximadamente 1 cm del sobrenadante por encima de la pelotilla.</li>
	<li>Lean cuidadosamente los tubos en un ángulo de 30 º para aumentar la superficie de los espermatozoides nadar hacia arriba y esperar 20-30 min para permitir que los espermatozoides a nadar hasta a 37 ° C. Nota: Se observa turbidez.</li>
	<li>Con una micropipeta con cuidado, retire la parte superior 1 mL del sobrenadante que contiene los espermatozoides móviles a un nuevo tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>No el esperma a 37 ° C hasta su uso.</li>
	<li>Estiman que el conteo de espermatozoides utilizando un hemocitómetro de Neubauer. Nota: Puede utilizar una cámara de conteo diferente, pero la cuenta es diferente.<ol>
<li>Para evitar el movimiento del espermatozoide, diluir 100 μl de los espermatozoides móviles con 10 mL de agua bidestilada (DDW) (dilución 1: 100) en un tubo de 15 mL y mezclar suavemente.</li>
		<li>Cargar 10 μl de la muestra en cada lado del hemocitómetro y el cubreobjetos. Asegúrese de evitar formación de burbujas dentro de la cámara como esto puede resultar en un conteo de esperma inexacta.</li>
		<li>Observar bajo un microscopio compuesto con el objetivo 20 X. Nota: La red completa en un hemocitómetro contiene 9 cuadrados grandes, cada 1 mm2, y el cubreobjetos basa 0,1 mm por encima del piso de la cámara. Así, el volumen sobre el área central de la cuenta es de 0.1 mm3 o 0.1 μl. La zona central del hemocitómetro contiene 25 cuadrados medianos y cada cuadrado mediano tiene 16 plazas más pequeñas con líneas simples.</li>
		<li>Contar el número total de células que se encuentran en 4 cuadrados de la esquina del medio y la plaza central. Para mayor precisión, contar dos cámaras (ambos lados del hemocitómetro de Neubauer) y utilizar la media para calcular la concentración de células.</li>
		<li>Multiplicar al número obtenido por 5 (para obtener el número de células por conteo de área) y 10.000 (para obtener el número de células por 1 mL de la muestra diluida) para calcular el conteo de espermatozoides. Luego multiplique el recuento obtenido por el factor de dilución (1: 100). Nota: Por ejemplo, un número promedio de espermatozoides contados en 5 de las 25 plazas medio dentro de la zona central de la cuenta de dos compartimientos es de 150 ([152 + 148] / 2). Así, el número promedio de espermatozoides por cámara (o 0,1 μl) es 150 x 5 = 750. Multiplicar 750 por 10.000 para obtener el número de células por 1 mL de muestra diluida (7.500.000) y luego multiplicar por 100 (factor de dilución) para obtener 75 x 107 células por mL de muestra de semen original.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. técnica #1: Evaluación simultánea de las membranas de espermatozoides utilizando fluorescentes múltiples sondas
Nota: Membranas del esperma (plasma y acrosómica y mitocondrial) se evaluaron como se ha descrito por Celeghini et al10, con algunas modificaciones. Se utilizó la microscopía epifluorescente, combinado con una cámara digital con excitación a 450-490 nm y emisión a 515 565 nm con un filtro triple.
<ol><li>
Preparar soluciones madre.
	<ol>
<li>Prepare a 0,1 mg/mL solución DAPI disolviendo 5 mg de DAPI en 50 mL de tampón fosfato salino (PBS). Preparar 50 alícuotas de μl y almacenar a-20 ° C. Antes del uso diluir la solución madre con PBS en 1:10 (solución de trabajo; 10 μg/mL).</li>
		<li>Prepare 1 mg/mL PSA-FITC solución disolviendo 1 mg de PSA-FITC en 1 mL de PBS. Preparar 50 alícuotas de μl y almacenar a-20 ° C. Antes del uso diluir la solución madre con PBS en 1:10 (solución de trabajo, 100 μg/mL).</li>
		<li>Preparar solución stock de 1 mg/mL 1 JC disolviendo 1 mg de JC-1 en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar 10 alícuotas μl y almacenar a-20 ° C. Antes del uso diluir la solución con DMSO en 1:10 (solución de trabajo; 0,1 mg/mL).</li>
		<li>Disolver 10 mg de PI en 400 μL de PBS (dando 2,5 mg/mL) para preparar la solución madre de PI. Tienda a + 4 ° C. Diluir el caldo 1 con PBS a 1:20 (solución de trabajo; 0,125 mg/mL). Almacenar a 4 ° C como una solución de reserva. PRECAUCIÓN: PI es un mutágeno potencial y debe ser manejado con cuidado. El tinte debe eliminarse de forma segura y según la normativa local aplicable.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferencia 133 μl de espermatozoides móviles (criterio 1.5) a un nuevo tubo de 1,5 mL (25 x 106 espermatozoides/mL). Nota: Si la concentración de la muestra es mayor, diluirlo en buffer NKM para lograr la concentración requerida; Si la concentración de la muestra de la natación por ejemplo es menor, centrifugar el sobrenadante obtenido después de nadar hasta a 1.000 x g durante 5 min, retirar 0.5 mL del sobrenadante y contar otra vez los espermatozoides.</li>
	<li>Añadir 17 μl de DAPI (solución de trabajo) e incubar 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>A la pelotilla, añadir 100 μl de buffer NKM.</li>
	<li>Añadir 50 μl de PSA-FITC, 2 μl de JC-1 y 3 μl de PI (soluciones de trabajo) e incubar 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>El precipitado, agregar 40 μl de tampón NKM y resuspender mediante pipeteo.</li>
	<li>Transferir 10 μl de la muestra a un portaobjetos de vidrio, el borrón de transferencia y el cubreobjetos.</li>
	<li>
Visualizar inmediatamente por microscopía de epifluorescencia (uso 40 x objetivo) con un triple filtro, equipado con una cámara digital y capturar una imagen por separado para cada filtro. Nota: No hay ninguna importancia a la orden de filtros visualizado.<ol>
<li>Visualizar en el canal DAPI con excitación a 358 nm y emisión a 461 nm.</li>
		<li>Visualizar bajo canal FITC para monómeros verdes con excitación a 450 – 490 nm y emisión a 515 – 565 nm.</li>
		<li>Visualizar bajo canal de PI para hacer rojo con excitación de 488 nm y emisión a 590 nm.</li>
		<li>Visualizar según JC-1 rojo agregados con excitación a 559 nm y emisión en el rango de 574 – 627 nm; JC-1 verdes monómeros con excitación de 488 nm y emisión en el rango de 500-535 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Unir las tres imágenes que recibió de los filtros en formato JPG/JPEG, usando la opción "merge" de software de la cámara.</li>
	<li>Abra la imagen fusionada con la herramienta "Paint" y utilice la opción de pincel para marcar espermatozoides contados.</li>
	<li>
Clasificar basados en la fluorescencia emitida por cada sonda de espermatozoides:
	<ol>
<li>En general evaluar al menos 200 espermatozoides por diapositiva, todas las células aparecen azul (DAPI).</li>
		<li>Evaluar la viabilidad por recuento de células muertas, que aparecen púrpura (PI [rojo] + [blue] DAPI) y calcular el porcentaje de células muertas (células muerta contado total células x 100).</li>
		<li>Evaluar el estado del acrosoma con los patrones de tinción fluorescente (FITC-PSA). Calcular los porcentajes de los diferentes patrones (acrosoma intacto, dañados o reaccionado células total contado células x 100). Nota: Membrana acrosómica dañada aparece como una gorra de acrosoma totalmente barnizado, verde; membrana acrosómica reaccionada muestra residual verde ecuatorial o superior coloración; las células que contienen intacta membrana acrosómica no exhibirán ninguna coloración verde de la región acrosómica.</li>
		<li>Evaluar la ΔΨm distinción de espermatozoides con alta ΔΨm, que exhiben un midpiece teñido de rojo y los espermatozoides con baja ΔΨm que exhiben un midpiece teñido de verde. Cuenta roja y verde midpieces por separado y calcular su cociente (rojo/verde).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. técnica #2: Evaluación de las membranas de espermatozoides listos para usar y citometría de flujo
Nota: Evaluación de la integridad de la membrana plasmática, integridad de la membrana acrosómica y potencial de membrana mitocondrial se realizó con kits de citometría de flujo lista para usar que contiene liofilizados fluorocromos en cada pozo. El procedimiento se realizó según los fabricantes con algunas modificaciones.
<ol><li>
Evaluación de integridad de membrana plasmática
	<ol>
<li>Tome el número deseado de pocillos del paquete del kit de viabilidad y concentración (PI y SYbr14), transferencia a la base de trabajo y cubierta con una tapa flexible (proteger de la luz).</li>
		<li>Añadir 199 μl de solución tampón para citometría por pozo.</li>
		<li>Añadir 1 μl de semen homogénea en 57 x 106/ml (57.000 células por pocillo) y homogeneizar por pipeteo.</li>
		<li>Cubra la placa con la tapa negra.</li>
		<li>Incubar 10 min a 37 ° C, protegido de la luz.</li>
		<li>Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo con la 'viabilidad' de configuración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Potencial de membrana mitocondrial
	<ol>
<li>Tome el número deseado de pocillos del paquete del kit de actividad mitocondrial (JC-1), transferencia a la base de trabajo y cubierta con una tapa flexible (proteger de la luz).</li>
		<li>Añadir 10 μl de etanol absoluto por pozo y pipeta para Resuspender el polvo presente en el pozo.</li>
		<li>Añadir 190 μl de PBS por pozo y homogeneizar mediante pipeteo.</li>
		<li>Añadir 0,75 μl de semen homogénea en 57 x 106/ml (50.000 células por pocillo) y homogeneizar por pipeteo.</li>
		<li>Cubra la placa con la tapa negra.</li>
		<li>Incubar durante 30 min a 37 ° C, protegido de la luz.</li>
		<li>Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo con la actividad de ʽmitochondrial de ajuste '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Integridad de la membrana acrosómica Nota: PSA-FITC tinción (ver técnica de #1) permite la evaluación de las 3 categorías de acrosoma (acrosoma intacto, acrosoma reaccionado y acrosoma dañado). Uso del citómetro de flujo y viabilidad y kit de integridad del acrosoma (PI y FITC-PNA), los espermatozoides son separados en estas 3 categorías.<ol>
<li>Tomar el número de pozos el paquete de kit de integridad viabilidad y acrosoma, transferirlos a la base de trabajo y cubierta con una tapa flexible (proteger de la luz).</li>
		<li>Añadir 200 μL de solución tampón para citometría por pozo.</li>
		<li>Añadir 0,7 μl de semen homogénea en 57 x 106/ml (40.000 células por pocillo) y homogeneizar por pipeteo.</li>
		<li>Cubra la placa con la tapa negra.</li>
		<li>Incubar durante 45 min a 37 ° C, protegido de la luz.</li>
		<li>Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo con la ʽInCyte de ajuste '.</li>
		<li>Analizar el histograma resultante por bloquear tres áreas de marcador según la intensidad de fluorescencia, en representación de insignificantes, baja fluorescencia células con acrosoma intacto, sin manchas (R1), baja fluorescencia células con residual manchado parte del acrosoma (R2) y células altamente fluorescentes con acrosoma interrumpida (R3). Nota: Utilice la sección "analizar archivos adquiridos mediante otros módulos" en la guía del usuario del instrumento para crear las tres regiones (R1, R2, R3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. técnica #3: Evaluación de las membranas de espermatozoides mediante sondas fluorescentes y citometría de flujo
Nota: Uso de anexina V combinado con PI fluorocromos permite evaluar apoptosis calcular la proporción de espermatozoides apoptóticos (índice de apoptosis).
<ol><li>Preparar 1 x annexin tampón de Unión V de 20 x solución (diluido 500 μl de tampón de Unión V 20 x solución con 9,5 mL de agua destilada estéril de anexina).</li>
	<li>Estiman que el conteo de espermatozoides utilizando un hemocitómetro de Neubauer como se describe en la sección 1.7.</li>
	<li>Lavar 106 espermatozoides en 1 mL de 1 x anexina V enlace buffer y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Aspire completamente el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el sedimento en 100 μl de 1 x annexin tampón de unión de V.</li>
	<li>Añadir 10 μl de anexina V conjugada con FITC.</li>
	<li>Mezclar bien e incubar durante 15 min en oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar espermatozoides mediante la adición de 1 mL de 1 x anexina V enlace tampón por 106 células y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Aspire completamente el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 500 μl de 1 x anexina V enlace tampón por 106 células totales.</li>
	<li>Añadir 1 μg/mL PI inmediatamente antes del análisis con un citómetro de flujo.</li>
	<li>Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo en ʽInCyte'.</li>
</ol>

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<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses.

Potencial de fecundación de espermatozoides depende de múltiples factores que refleja su calidad. Una alta concentración de espermatozoides y una alta proporción de espermatozoides móviles altamente progresivamente podrían considerarse semen de alta calidad. Sin embargo, esa evaluación no toma en cuenta otros parámetros celulares y funcionales. El uso de la 'bancada' microcapillary citometría de flujo puede ser fácilmente adaptado a la evaluación de diferentes estructuras de esperma mediante sondas fluorescentes, como de...

Integridad y funcionalidad de las membranas del esperma son algunos de los factores que indica viabilidad espermática y la fertilización posible. La membrana plasmática actúa como una barrera entre los compartimientos intracelulares y extracelulares, manteniendo así el equilibrio osmótico celular1. Cualquier estrés que induce daño en la integridad de la membrana plasmática pueden la homeostasis, reducen la capacidad de viabilidad y fertilización e incrementar la muerte celular. Por ejemplo, criopreservación reduce la viabilidad espermática debido al daño a la membrana plasmática, como resultado de los cambios de temperatura y estrés osmótico2. Hemos divulgado previamente que exponer los espermatozoides de Toro para bajas concentraciones de contaminantes de los alimentos tales como la plaguicidas atrazina, su metabolito principal diaminochlorotriazine o la aflatoxina de micotoxina B1, reduce el esperma viabilidad1,3 . Esto fue determinado por el ADN de doble hebra con DAPI de etiquetado en combinación con PI, que se une al ADN de las células con una membrana de plasma dañada.
Reacción acrosómica (RA) consiste en la fusión de la membrana acrosómica externa y la membrana plasmática suprayacente resultando en la liberación de enzimas acrosómica4,5. Estos son eventos esenciales para la penetración de la zona pelúcida y fusión del espermatozoide con el ovocito6más. Por lo tanto, la evaluación de la integridad de la membrana acrosómica constituye un parámetro útil para evaluar la calidad del semen y la fertilidad masculina7,8,9. Varias técnicas fluorescentes son convenientes para la verificación de integridad del acrosoma, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. En nuestros estudios anteriores, utilizando los patrones de FITC-PSA tinción1,3, proporciona las definiciones precisas para (i) acrosoma intacto, (ii) dañar la membrana del acrosoma y (iii) reacción acrosómica. En el informe actual, evaluar el estado del acrosoma mediante citometría de flujo de esperma dedicado y comparar los resultados a aquellos que utilizan la microscopía de fluorescencia.
Las mitocondrias son organelos multifuncionales involucrada en, entre otras cosas, ATP síntesis, producción de especies reactivas del oxígeno, señales de calcio y apoptosis. Disfunciones fisiológicas, incluyendo la infertilidad masculina y femenina, se asocian con alteración de la función mitocondrial11. Las mitocondrias del espermatozoide se arreglan en la midpiece y desempeñan un papel crucial en el esperma motilidad12. Es bien aceptado que el alto potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se asocia con motilidad normal y fertilización alta capacidad13. En cambio, ΔΨm bajo se asocia con un nivel elevado de especies reactivas de oxígeno y reducción de la tasa de fertilización14. Sin embargo, varios compuestos ambientales, por ejemplo los disruptores endocrinos, pueden inducir estrés celular y conducir a un aumento transitorio en hiperpolarización1,3, ΔΨm, aumento de la producción de radicales libres y eventualmente, 15de la apoptosis. La sonda fluorescente 5, 5', 6, 6'-tetra-cloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1) permite examinar por ejemplo, los efectos de las toxinas transmitidas por los alimentos en esperma ΔΨm1,3.
Espermogramas estándar, basadas en parámetros morfológicos y fisiológicos, no son lo suficientemente buenas como predecir la calidad del semen. Se requieren métodos más precisos para asegurar la calidad del esperma. Presentamos dos métodos posibles para determinar la calidad del esperma basada en evaluaciones de las membranas del esperma: coloración cuádruple simultánea con sondas fluorescentes específicas y microscopía de fluorescencia, descrito en nuestros estudios1,3 y citometría de flujo de esperma dedicado avanzado recientemente en nuestro laboratorio y ya siendo utilizado por otros16,17,18.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [ácido 3-N-morflino propanosulfónico]</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO Sigma</td><td></td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Neubauer Alemania</td><td></td><td>hemocitómetro</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>sonda fluorescente</td></tr><tr><td>PI (yoduro de propidio)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>sonda fluorescente</td></tr><tr><td>FITC-PSA (aglutinina de Pisum sativum conjugada con isotiocianato de fluoresceína)</td> <td>Sonda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fluorescente Sigma L0770JC-1 (5,5',6,6'-tetra-cloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolil yoduro de carbocianina)</td><td>ENZOBiochem, Nueva York, NY, EE. UU</td><td>. ENZ52304</td><td>sonda fluorescente</td></tr><tr><td>Anexina V conjugada a FITC</td><td>MACS, Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td><td>sonda fluorescente</td></tr><tr><td>Tampón de unión a la anexina V 20x solución madre</td><td>MACS, Tampón Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td></td><td>microscopio de fluorescencia invertida</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tokio, Japón</td><td></td><td>cámara digital</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francia</td><td></td><td>citómetro de flujo de espermatozoides microcapilar</td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, EE.UU.; distribuido por el software IMV Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución tamponada para citometría</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francia</td><td>023862</td><td>tampón</td></tr><tr><td>Kit de viabilidad y concentración</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francia</td><td>024708</td><td>kit para la evaluación de la viabilidad</td></tr><tr><td>Kit de actividad mitocondrial</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francia</td><td>024864</td><td>kit para la actividad mitocondrial Kit</td></tr> de <tr><td>viabilidad e integridad del acrosoma</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francia</td><td>025293</td><td>kit para la evaluación de la integridad del acrosoma</td></tr><tr><td>JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, EE. UU</td><td></td>. <td>Software</td></tr><tr>de<td>esperma bovino</td> <td>"SION", empresa israelí de inseminación artificial y dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Espermogramas estándar que describe la calidad del esperma se basan principalmente en los parámetros fisiológicos y visuales, como el volumen de eyaculado y concentración, motilidad y motilidad progresiva, morfología espermática y viabilidad. Sin embargo, ninguna de estas evaluaciones es suficiente predecir la calidad del semen. Dado que el mantenimiento de viabilidad espermática y la fertilización potencial depende de la integridad de la membrana y función intracelular, evaluación de estos parámetros puede permitir una mejor predicción de la capacidad de fertilización del esperma. Aquí, Describimos tres métodos posibles para evaluar la calidad del esperma mediante sondas fluorescentes específicas combinadas con análisis de citometría de flujo o microscopia de fluorescencia. Análisis evaluaron la integridad de la membrana plasmática con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y yoduro de propidio (PI), integridad de la membrana acrosómica usando conjugados con isotiocianato de fluoresceína aglutinina de Pisum sativum (PSA-FITC) y integridad de la membrana mitocondrial con 5, 5', 6, 6'-tetra-cloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1). También se presentan combinaciones de estos métodos. Por ejemplo, el uso de anexina V combinado con PI fluorocromos permite evaluar apoptosis calcular la proporción de espermatozoides apoptóticos (índice de apoptosis). Creemos que estas metodologías, que se basan en el examen de las membranas del espermatozoide, son muy útiles para la evaluación de la calidad del esperma.

Figura 1 muestra fluorimétrico simultánea evaluación de membranas del esperma (plasma y acrosómica y mitocondrial) usando PI, DAPI y FITC-PSA JC-1. Evaluación de las membranas de espermatozoides utilizando tinción simultánea con cuatro puntas de prueba fluorescentes permite, por ejemplo, evaluar la proporción de espermatozoides en cada categoría: vivo y muerto; alta vs baja ΔΨm; intactos vs. dañado el acrosoma, simultáneamente para ...

Aquí, presentamos a metodologías para evaluar la integridad de la membrana de spermatozoan, una característica celular asociada con la capacidad de fertilización del esperma. Se describen tres técnicas para la evaluación de fluorimétrico de las membranas del esperma: coloración simultánea con sondas fluorescentes específicas, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo avanzada dedicado de esperma. También se presentan ejemplos de la combinación de las metodologías.

Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

El objetivo de estos procedimientos es evaluar la integridad de las membranas espermáticas utilizando sondas fluorescentes específicas combinadas con microscopía de fluorescencia o análisis de citometría de flujo. Estas técnicas podrían ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción, como la predicción del potencial de fertilización y la calidad de la muestra de espermatozoides. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten una evaluación precisa de múltiples membranas espermáticas que se sabe que se asocian con el potencial de fertilización de espermatozoides.Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el diagnóstico de la calidad de la eyaculación, ya que permite una evaluación más precisa del plasma esperma y la integridad de la membrana acrosoma, así como el potencial de la membrana mitocondrial. Para comenzar este procedimiento, obtenga aproximadamente de uno a seis mililitros de semen de toro en un tubo de 15 mililitros a temperatura ambiente. Agregue seis mililitros de tampón NKM precalentados a 37 grados centígrados a cada mililitro de semen.Centrifugar a 600 veces g durante ocho minutos. Repita la centrifugación una o dos veces hasta que el sobrenadante esté limpio. Después de esto, deseche inmediatamente la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente un centímetro de sobrenadante por encima del pellet.Incline cuidadosamente los tubos en un ángulo de 30 grados en la incubadora y espere de 20 a 30 minutos para permitir que los espermatozoides naden hacia arriba. Usando una micropipeta, retire cuidadosamente el mililitro restante de sobrenadante que ahora contiene el espermatozoide móvil y transfiéralo a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Mantenga el esperma a 37 grados Celsius hasta que esté listo para usar.En primer lugar, prepare todas las soluciones de stock necesarias como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera 133 microlitros de los espermatozoides móviles a una concentración de 25 millones de espermatozoides por mililitro a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 17 microlitros de la solución de trabajo DAPI e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón NKM al pellet. A continuación, añada 50 microlitros de FITC-PSA, dos microlitros de JC-1 y tres microlitros de PI. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 microlitros de tampón NKM. A continuación, transfiera 10 microlitros de la muestra a un portaobjetos de vidrio.Difuminar la muestra y añadir un cubreobjetos. Después de esto, comience inmediatamente a visualizar la muestra por microscopía de epifluorescencia con un objetivo 40X y un filtro triple como se describe en el protocolo de texto, utilizando una cámara digital para capturar una imagen separada para cada filtro. Utilice la opción de fusión en el software de la cámara para combinar las tres imágenes recibidas de los filtros, guardando el nuevo archivo en formato JPEG.Abra la imagen combinada con la herramienta de pintura y utilice la opción de pincel para marcar el espermatozoide. A continuación, clasificar los espermatozoides en función de la fluorescencia emitida por cada sonda, asegurándose de evaluar al menos 200 espermatozoides por diapositiva. Todas las celdas deben aparecer azules desde el DAPI.Contar las células muertas, que parecen púrpuras, para evaluar la viabilidad. A continuación, utilice los patrones de tinción de fluorescencia para evaluar el estado del acrosoma. Por último, evaluar el potencial de la membrana mitocondrial mediante la distinción de los espermatozoides con alto potencial de membrana mitocondrial que exhiben una mitad teñida de rojo de los espermatozoides con bajo potencial de membrana mitocondrial que exhiben una mitad teñida de verde.Cuente las piezas medias rojas y verdes por separado y calcule su relación. Para comenzar la evaluación de la integridad de la membrana plasmática, tome el número deseado de pozos del kit de viabilidad y concentración. Transfiera los pozos a la base de trabajo y cúbralos con una tapa flexible para protegerlos de la luz.Añadir 199 microlitros de solución tamponada para la citometría a cada pozo. Luego agregue un microlitro de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar por pipeteo. Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando el ajuste de viabilidad. Para comenzar a evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, saque el número deseado de pozos del kit de actividad mitocondrial. Transfiéralos a la base de trabajo.Añadir 10 microlitros de etanol absoluto a cada pozo y utilizar una pipeta para resuspender el polvo presente dentro del pozo. Añadir 190 microlitros de PBS por pozo y homogeneizar por pipeteo. Añadir 0,75 microlitros de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar mediante pipeteo.Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando el ajuste de actividad mitocondrial. Para comenzar a evaluar la integridad de la membrana acrosomal, saque el número deseado de pozos del kit de viabilidad e integridad acrosome.Transfiera los pozos a la base de trabajo y cúbralos con una tapa flexible para protegerlos de la luz. Añadir 200 microlitros de solución almacenada en búfer para la citometría a cada pozo. Luego agregue 0,7 microlitros de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar por pipeteo.Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando la configuración de información. En este estudio, la calidad del semen se evalúa utilizando diferentes técnicas, una de las cuales evaluó las membranas espermáticas utilizando sondas fluorométricas.Es posible evaluar las diferencias en la calidad de la muestra de espermatozoides en términos de integridad de la membrana. Por ejemplo, la eyaculación del toro número siete tenía un porcentaje relativamente bajo de células muertas, una baja proporción de espermatozoides con acrosoma pseudo-reaccionado y un mayor potencial de membrana mitocondrial en comparación con la eyaculación del toro número uno. A continuación, se evalúan las muestras para detectar la viabilidad y la actividad mitocondrial.Los histogramas de estos ejemplos representativos representan los espermatozoides no cerrados y los desechos y los espermatozoides cerrados. Estos histogramas también representan las células viables y muertas y la distribución de espermatozoides a membrana mitocondrial polarizada y despolarizada. La integridad del acromos se evalúa con un kit listo para usar y se lee con citometría de flujo, dividiendo el área en tres áreas marcadoras que representan células fluorescentes bajas insignificantes con acrooma intacto no manchado, células fluorescentes bajas con parte residual manchada del acrooma, y células altamente fluorescentes con acrooma alterado.Al intentar estos procedimientos, es importante asegurarse de preparar correctamente la muestra inicial de espermatozoides. Estas técnicas pueden proporcionar información sobre la evaluación de la calidad de los espermatozoides y se pueden aplicar a diversos organismos como bovino, aves de corral y humanos. La comparación entre las dos técnicas, la tinción cuádruple y la citometría de flujo indicaron que no había diferencias significativas para la viabilidad, el potencial de membrana mitocondrial y la integridad del acrooma que revelaba que las dos técnicas producían resultados coincidentes.

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Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

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