Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D
20 de octubre de 2018
Este artículo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de hojas de varias capas de células madre con células madre favorable propiedad.
Terapia con células madre se ha divulgado ampliamente como un tratamiento prometedor para muchas enfermedades. Y las técnicas de la hoja celular se han desarrollado con el fin de mejorar la retención de la célula y la supervivencia dentro de los objetivos, también. Durante la construcción de láminas celulares, el suministro de nutrición insuficiente sigue siendo un problema clave para la pérdida de la función de las células madre, y es una propiedad de células madre insatisfactorias que finalmente afectaría los efectos terapéuticos in vivo.
Nuestro propósito de preparar el producto de lámina de células madre multicapa disponibles, nuestro equipo desarrolló el andamio de láminas celularizadas, pericardio y láminas celulares. Sobre la base del andamio, el arrancador de células multicapa se construiría rápidamente con hidrógeno nonapéptido y se utiliza un sistema de perfusión dinámica para garantizar el suministro de nutrición de la célula madre in vitro. Saque un andamio DBP seco y colótelo en el centro de la base negra.
Coloque un anillo de tensión blanco en el andamio DBP y colócalo en el soporte de tejido. Asegúrese de que el andamio DBP esté totalmente fijado en el soporte de tejido. Agregue 100 medios de cultivo de microlitros en el andamio DBP.
Coloque el andamio en la incubadora de 37 grados Celsius y déjelo remojar durante 15 minutos. Saque las células de la incubadora, retire los medios de cultivo del plato de cultivo, lave suavemente las células con dos mililitros de PBS caliente. Retire todo el PBS del plato de cultivo y asegúrese de que no quede líquido.
Añadir dos mililitros a 1.25%solución de trippsina al plato, e incubar las células durante tres minutos. Detenga el efecto de la trippsina añadiendo dos mililitros de cultivo medio. Lave suavemente las células del plato.
Transfiera las suspensiones celulares en un nuevo tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar las células a 220 veces la gravedad durante cinco minutos, y obtener sedimentos celulares. Retire el sobrenadante y acabe con el sedimento celular.
Re suspenda las células con una solución de tres mililitros de 10%sacarosa. Aspirar 10 microlitros suspensión celular, y el número de celda de contenido lee un hemocicómetro, extraer tres millones de células y transferir en su nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 220 veces la raíz cuadrada durante cinco minutos, eliminar completamente los sobrenadantes y obtener el sedimento de las células.
Preparar 20 microlitros 10%solución de sacarosa. Reabrir suavemente las células y obtener una suspensión uniforme. Añadir 20 microlitro péptidos hidro gel en la parte superior de la suspensión mezclar suavemente el gel de péptido hidro, y las células suspensión con la T, sacar el andamio DBP, dejando el portador del tejido, y luego aspirar suavemente la mediana de calculi con un T.Aspirar la mezcla la mezcla y añadir uniformemente al andamio DBP.
Añadir un mililitro de esteliceto de calcio en la parte inferior del portador del tejido. Agregue suavemente un medio cultural de cuatro mililitros en el plato de cultivo y luego emerja la hoja de celda. Ponga las células en la incubadora durante dos horas para que se escaren.
El sistema de perfusión dinámica incluye un recipiente de cultivo de perfusión, el recremento de intercambio de gas y una botella de vidrio. Los ensamblados son sistemas de perfusión dinámicos como se muestra en la figura. Añadir dos medios de cultivo hidrolilitros en la botella de vidrio.
Inserte la hoja celular en la cámara del recipiente de cultivo, agregue tres medianas de cultivo de mililitros en el recipiente, coloque los sistemas de perfusión dinámica en las incubadoras y comience a bombear. Abra el contenedor de referencia cultural en el recumbent bipositivo. Saque la hoja de celda del recipiente de cultivo y colóquela en un plato de cultivo.
Utilice un fórceps para inmovilizar el portador del tejido y utilice otros dos fórceps para separar el anillo de tensión blanca de la base negra. Por último, obtenga la hoja de celda multicapa. El andamio DBP es transparente.
El SEM revende muestra que las universidades capturadas y los componentes están completamente reservados. Las hojas celulares se pueden obtener y mantener por fórceps para su conservación corta. Estas láminas celulares podrían transferirse a un tubo cilindriforme de 1,5 mililitros.
Como modelo, por ejemplo, comenzando con muestras de células de BMFC altamente positivas para el marcador de células madre CD 9O y el CD 29. Después de la construcción de la célula, el BMFC está dejando la hoja celular sigue siendo altos niveles de expansión de CD 90 y el CD 29. La construcción de la estructura de celdas multicapa es el paso crítico del protocolo.
El tiempo de la sartén requiere cuatro geles hidroeléctricos cuando el valor PH cambia de SA a neutro, por lo tanto, es importante lavar la célula con solución de sacarosa para eliminar los iones de superficie. Además, la relación de volumen de la suspensión celular y el panthihidrogel no es buena amiga para la construcción de la estructura multicapa temporal. Después de la formación de la estructura de células madre 3D, verá que el sistema de perfusión dinámica es importante para estabilizar la estructura multicapa, así como para mantener las viabilidades de las células madre.
La infiltración dinámica de la mediana de cultivo podría facilitar que las células madre proliferen y extrapolar el contexto celular dentro de la estructura multicapa también los termómetros de cultivo dinámicos deben ajustarse de acuerdo con diferentes tipos de células madre.
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Resumen
Este artículo proporciona un método eficiente y factible para construir láminas de células madre multilaminares con propiedades favorables de células madre. El estudio aborda los desafíos en la terapia con células madre, particularmente en relación con el suministro de nutrientes durante la construcción de láminas celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Terapia con Células Madre
- Técnicas de Láminas de Células
- Medicina Regenerativa
Antecedentes
- La terapia con células madre es un tratamiento prometedor para diversas enfermedades.
- Las técnicas de láminas celulares mejoran la retención y supervivencia celular.
- Un suministro insuficiente de nutrientes puede provocar la pérdida de la función de las células madre.
- Mejorar las propiedades de las células madre es crucial para lograr resultados terapéuticos efectivos.
Objetivo del estudio
- Preparar productos de láminas de células madre multilaminares.
- Desarrollar un andamio que soporte la nutrición de las células madre.
- Mejorar los efectos terapéuticos de las células madre in vivo.
Métodos Utilizados
- Desarrollo de pericardio de tamaño polar celularizado y andamio de lámina celular.
- Construcción de células multicapa utilizando hidrógeno de nonapéptido.
- Implementación de un sistema de perfusión dinámico para el suministro de nutrientes.
- Utilización de un andamio de DBP desecado para el ensamblaje de láminas celulares.
Resultados principales
- Construcción exitosa de láminas de células madre multilaminares.
- Mejora en el suministro de nutrientes a las células madre in vitro.
- Mayor retención y función de las células madre.
- Potencial de mejores resultados terapéuticos in vivo.
Conclusiones
- El método desarrollado es eficiente y factible para la construcción de láminas de células madre.
- Abordar el suministro de nutrientes es fundamental para el éxito de la terapia con células madre.
- Las aplicaciones futuras podrían mejorar la eficacia del tratamiento para diversas enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La terapia con células madre enfrenta desafíos en la retención y supervivencia celular tras el trasplante, lo que limita la eficacia terapéutica. Este protocolo aborda el suministro insuficiente de nutrientes durante el cultivo in vitro mediante la integración de un sistema de perfusión dinámico con una matriz descelularizada, mejorando la bioactividad de las células madre y la estabilidad de la lámina celular. El enfoque permite la producción a escala de láminas multilaminares de células madre mesenquimales para aplicaciones en medicina regenerativa.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el comportamiento de las células madre en un microentorno tridimensional que imita la arquitectura del tejido nativo.
- Valor operativo: Proporciona una plataforma reproducible para evaluar la retención de marcadores de células madre mesenquimales (CD90, CD29) bajo condiciones de cultivo dinámicas.
- Valor predictivo: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al mantener la pluripotencialidad y la capacidad de proliferación in vitro.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera láminas celulares estandarizadas y multicapa con integridad estructural cuantificable para ensayos funcionales posteriores.
- Valor operativo: Utiliza un hidrogel de péptido RAD16-I y un cultivo por perfusión para garantizar una distribución celular uniforme y el acceso a nutrientes en todas las capas.
- Escalabilidad: Facilita la preparación de láminas celulares compatibles con el manejo mediante pinzas y su transferencia a tubos estándar para biobanco o procesamiento adicional.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la viabilidad de las células madre y su potencial de expansión, lo cual es fundamental para la modelización de la eficacia preclínica.
- Valor operativo: El sistema de perfusión dinámica estabiliza la estructura tridimensional durante el cultivo de 48 horas, reduciendo la variabilidad en el grosor y la celularidad de la lámina.
- Continuidad traslacional: Conecta la fabricación de láminas en fase de descubrimiento con la validación preclínica mediante la preservación del fenotipo de las células madre.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, permitiendo la amplificación de células madre en etapas tempranas y la formación de láminas antes de las pruebas funcionales o del implante in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las interacciones entre células madre y su nicho en un entorno tridimensional controlado y perfundido.
- Tamizaje: Proporciona láminas multilaminares listas para ensayos, con una composición celular consistente, para la evaluación de compuestos o citocinas.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa de la conservación de marcadores de células madre (por ejemplo, CD90, CD29) como indicador del éxito del cultivo.
- Investigación Traducional: Ofrece un sistema relevante para enfermedades que permite evaluar la actividad paracrina y el potencial de injerto de las células madre.
- Reutilización Empresarial: Los componentes del andamiaje y de la perfusión pueden estandarizarse entre proyectos para lograr una producción reproducible de láminas de células madre.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la funcionalidad de las células madre mediante la conservación de la expresión de marcadores y la proliferación.
- Valor operativo: La preparación estandarizada del andamiaje y el cultivo con perfusión reducen la variabilidad entre lotes.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al aumentar el rendimiento y la viabilidad de las células madre antes de las aplicaciones posteriores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos de células madre basada en métricas de integridad de la lámina y bioactividad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células madre, manipulación de hidrogeles y configuración de sistemas de perfusión.
- Depende del acceso a pericardio porcino descelularizado, hidrogel de péptido RAD16-I y biorreactores de perfusión estériles.
- Necesita la estandarización de las relaciones volumétricas entre la suspensión celular y el hidrogel para lograr una formación consistente de múltiples capas.
- La adaptación a otros tipos de células madre puede requerir la optimización de las tasas de flujo de perfusión y la duración del cultivo.
- Limitación práctica: los pasos de manipulación manual (por ejemplo, transferencia del andamio, eliminación del anillo) introducen variabilidad dependiente del operador.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Title
1:02
Preparations Before Cell Sheet Construction
1:39
Preparing Cells for Cell Sheet Construction
3:22
Preparing BMSCs and RAD16-I Peptide Hydrogel Mixture
4:36
In vitro Culture of 3D Multilayered Cell Sheet Using a Dynamic Culture System
5:18
Obtain the Multilayered MSC Cell Sheet
5:49
Results
6:34
Conclusion
