Name: Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a construir láminas multicapa de células madre mesenquimales usando un sistema de cultivo dinámico 3D con perfusión. Este método mejora el suministro de nutrientes y la viabilidad celular para terapia regenerativa.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (número 31771064); la ciencia y tecnología de planificación proyecto de la provincia de Guangdong (grant números 2013B010404030, 2014A010105029 y 2016A020214012); la ciencia y la tecnología de planificación proyecto de Guangzhou (número 201607010063); y el grado de innovación y programa de formación empresarial (número 201610559028); la Fundación Nacional de ciencia para jóvenes científicos de China (la concesión número 31800819).

Todos los procedimientos de experimento animal y la célula de vástago se llevó a cabo según las normas éticas de la guía nacional para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobados por la Universidad de Jinan Animal cuidado y uso (Guangzhou, China).
1. preparación del andamio DPP con la descelularización de PLA2 método14
Nota: Ver figura 1A para un esquema del método de descelularización de2 PLA.
<ol><li>Preparar 100 mL de 200 U/mL PLA2 solución. Añadir 0,5 g de desoxicolato de sodio y 2 mL de PLA2 en 198 mL de tampón carbonato. Esta solución debe utilizarse dentro de las 24 h después de su preparación.</li>
	<li>Obtener el pericardio porcino fresco (FPP) del matadero y volver al laboratorio dentro de 1 h. Nota: La FPP debe almacenarse a 4 ° C durante el transporte. Medidas 1.10 1.2 deben realizarse con agitación continua en un baño de agua con termostato.</li>
	<li>Lave bien la FPP con 200 mL de tampón fosfato (PBS) que contiene 1% de penicilina-estreptomicina en un vaso de precipitados de 500 mL a 10 ° c 10 minutos repetir este paso 2 x.</li>
	<li>Dividió la FPP de dos capas y eliminar el tejido adiposo con pinzas y tijeras. Nota: Mantenga la FPP mojado por la adición de 50 mL de PBS cada 20 min durante la extracción del tejido adiposo.</li>
	<li>Forma de la FPP en2 piezas de 10 x 10 cm con unas tijeras. Lave la FPP con 200 mL de tampón carbonato (CBS) que contiene 1% de penicilina-estreptomicina en un vaso de precipitados de 500 mL a 10 ° C por 10 minutos repetir la operación 2 x.</li>
	<li>Transferir la FPP a puro agua y remojar en 10° C por 12 h.</li>
	<li>Tomar las muestras de 10 x 10 cm2 en 50 mL de CBS que contiene 200 U/mL PLA2 y solución de desoxicolato de sodio 0.5% (p/v) a 37 ° C por 6 h.</li>
	<li>Lavar las muestras con CBS que contiene penicilina-estreptomicina de 1% a 10 ° C durante 10 minutos, repetir este paso 2 x.</li>
	<li>Remoje cada muestra en 50 mL de CBS que contiene 200 U/mL PLA2 y solución de desoxicolato de sodio 0.5% (p/v) a 37 ° C por 2 h.</li>
	<li>Lavar las muestras con CBS que contiene penicilina-estreptomicina de 1% a 10 ° C por 2 h. Repita este paso para 10 x menos. Coloque las muestras en placas planas y secar hasta peso constante en un horno de temperatura constante a 55 ° C. Nota: La muestra debe ser secada completamente. Pesar la muestra DPP cada 10 minutos y repetir 3 x o hasta que el peso no cambia.</li>
	<li>Forma de cada muestra DPP en un círculo de 10,5 mm de diámetro con un trépano. Embalar cada DPP en una bolsa estéril sellada.</li>
	<li>Esterilizar las muestras DPP por irradiación gamma (25 kGy). Almacenan las muestras DPP a 4 ° C antes de usar. Nota: Todas las muestras pueden almacenarse hasta por seis meses a 4 ° C.</li>
</ol>2. preparación de la celda de hoja de construcción
<ol><li>Autoclave de todos los instrumentos y componentes del tejido portador a 121 ° C por 30 min, incluyendo tubos centrífuga de 1,5 mL, pinzas, pinzas, tijeras, con dientes negro bases (componente portador de tejido) y anillos de tensión blanco (componente portador de tejido).</li>
	<li>Prepare 20 mL de solución de sacarosa al 10% libre de gérmenes. Peso de 2 g de sacarosa y disolver el sacarosa en 18 mL de agua ultrapura. Autoclave de la solución de sacarosa al 10% a 121 ° C por 30 min o filtro de la solución con un filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Autoclave de los dispositivos de sistema de perfusión dinámica a 121 ° C durante 30 minutos, incluyendo un gas intercambian de equipo, una botella de vidrio de 500 mL, un contenedor de cultura de la perfusión y los tubos de tejido conectivos.</li>
	<li>Preparar los instrumentos esterilizados y tejidos componentes del portador. Poner la parte negra de la base del portador del tejido en una placa de cultivo.</li>
	<li>Recoger un andamio DPP seco y poner en el centro de la base negra. Poner un anillo de tensión blanco en el andamio DPP y fijarla en el portabebés de tejido. Nota: Asegúrese de andamio es totalmente fijado en el portabebés de tejido y no hay ningún espacio entre la base negra y el anillo de tensión blanco. Si no, separar el portador de tejido y fijar otra vez el andamio.</li>
	<li>Añada 100 μl de medio de cultivo en el andamio DPP para la rehidratación. Nota: Si el andamio no se fija bien en el portabebés de tejido, el medio de cultivo se infiltran en la placa de cultivo.</li>
	<li>Poner el andamio en una incubadora de 37 ° C y deje que se remoje durante 15 minutos.</li>
</ol>3. preparación de las células para la construcción de hoja de la célula
Nota: Este protocolo es para cultivo de células utilizando un plato de 100 mm. Ver figura 1B para un esquema de la construcción de la estructura de varias capas de células.
<ol><li>Aislar BMSCs13. Nota: Este método está diseñado para la construcción de una hoja varias capas de células MSC. BMSCs rata se utilizan en el presente Protocolo. Las BMSCs están aislados mediante el método adherente de toda la médula ósea, y las BMSCs son ampliados en vitro para obtener suficiente cantidad de células.<ol>
<li>Autoclave de los instrumentos a 121 ° C durante 30 minutos, incluyendo fórceps, pinzas dentadas y las tijeras. Preparar una jeringa de inyección de 2 mL y CMMo medio de cultivo (Dulbecco modificado Eagle medio [DMEM] 10% suero fetal bovino, glutamina 1% y 1% penicilina-estreptomicina).</li>
		<li>Eutanasia a las ratas de Sprague-Dawley (SD) macho de tres semanas de edad por la dislocación de la vértebra cervical. Remoje el animal en 100 mL de solución de alcohol 75% en un vaso durante 5 minutos.</li>
		<li>El animal saca el vaso y coloque propensa en la mesa de operación. Haga una incisión en la piel en la parte posterior del animal con tijeras y pinzas. Aislar los tejidos de la piel y el músculo para exponer el fémur del muslo.</li>
		<li>Aislar el fémur del muslo y ponerlo en 30 mL de PBS en un tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque dos fémur muslo en un tubo. Vórtice el tubo de la centrífuga para lavar completamente el tejido. Repetir este paso 2 x.</li>
		<li>Cortar ambos extremos de los fémures con tijeras y exponer la cavidad de la médula ósea.</li>
		<li>Aspirar 2 mL de medio de cultivo CMMo con una jeringa de inyección. Inserte la aguja en la cavidad de la médula ósea y eliminar la médula ósea con medio de cultivo. Lave cada fémur dos muslo en una placa de cultivo de 100 mm.</li>
		<li>Para cada placa de cultivo de 100 mm, añadir 2 mL de medio de cultivo en la placa de cultivo. Coloque la placa de cultivo en la incubadora de 37 ° C y la cultura estática durante 72 h.</li>
		<li>Sacar la placa de cultivo de la incubadora. Vuelva a colocar el sobrenadante con 6 mL de medio de cultivo fresco.</li>
		<li>Observar BMSCs primarias bajo un microscopio. Después de esto, de paso las BMSCs cada 5-7 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tomar las células fuera de la incubadora. Observar las células bajo un microscopio y elegir las células convenientes para la construcción de la hoja de la célula. Cuando las BMSCs alcanzan 80% - 90% de confluencia, las células pueden ser elegidas como las células sembradas.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de la placa de cultivo. Lave suavemente las células con 2 mL de PBS caliente. Quitar todos los PBS de la placa de cultivo y hacer restos seguro no líquidos. Añadir 2 mL de tripsina 0.25% (u otra solución disociación) al plato e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.</li>
	<li>Detener el efecto de la tripsina por añadir 2 mL de medio de cultivo y lave suavemente las células del plato. Transferir la suspensión de células en un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugado las células a 225 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células con 3 mL de solución 10% (p/v) de sacarosa. Nota: solución sacarosa al 10% (w/v) se utiliza para lavar las células con el fin de obtener una mezcla uniforme de célula-hidrogel en los siguientes pasos.</li>
	<li>Aspire 10 μl de la suspensión de células y contar el número de células con un hemocitómetro. Calcular el volumen necesario para el siguiente paso. Para la hoja de una célula, se utilizan BMSCs 3 millones.</li>
	<li>Extracto de 3 millones de células y transferirlos a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar las células a 225 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células con 1 mL de solución 10% (p/v) de sacarosa. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 1.5 mL. Nota: Usando un tubo centrífuga de 1.5 mL es beneficioso para la preparación de la mezcla células-hidrogel.</li>
	<li>Centrifugar las células a 260 xg por 5 minutos completamente Quite el sobrenadante y obtener el sedimento celular.</li>
</ol>4. preparación de las BMSCs y el RAD16-mezcla hidrogel de péptido
Nota: Ver figura 1B para un esquema de la construcción de la estructura de varias capas de células.
<ol><li>Añadir 20 μl de solución de sacarosa al 10% (w/v) para el tubo centrífuga de 1.5 mL. Suavemente agite las BMSCs y obtener una suspensión uniforme. Nota: No generan las burbujas durante la resuspensión.</li>
	<li>Añadir 20 μl de RAD16-I péptido hidrogel en la parte superior de la suspensión. Revuelva suavemente el RAD16-I suspensión péptido y de la célula con la punta de la pipeta. Cuando se mezclan la suspensión celular y el hidrogel, pipetee suavemente la mezcla un par de veces.</li>
	<li>Sacar el andamio DPP de la compañía de tejidos y aspirar suavemente el medio de cultivo con una punta de pipeta. Nota: Asegúrese de que el andamio de la DPP es rehidratado completamente antes de agregar la mezcla de células-hidrogel.</li>
	<li>Aspirar la mezcla y agregarla uniformemente al andamio DPP. Nota: El volumen total de la mezcla sería de 40-50 μl. Se recomienda agregar la mezcla 10 μL en un momento desde el centro hacia el exterior del andamio.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio de cultivo a la parte inferior del transportador del tejido. Poner la hoja de la célula en la incubadora de 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Sacar la hoja de la célula de la incubadora. Añadir 4 mL de medio de cultivo en la placa de cultivo y sumerja la hoja de la célula. Poner la hoja de la célula en la incubadora de 37 ° C por 2 h de cultura estática.</li>
</ol>5. cultivo in Vitro de una hoja de varias capas 3D de la célula mediante un sistema dinámico de la cultura
Nota: Ver figura 1 para un diagrama esquemático del sistema dinámico de 3D.
<ol><li>Preparar el sistema de perfusión dinámico, incluyendo una bomba peristáltica, equipo de intercambio de gas, una botella de vidrio de 500 mL, un contenedor de cultura de la perfusión y los tubos de tejido conectivos. Montar el sistema de perfusión dinámico como se muestra en la figura 2.</li>
	<li>Añadir 200 mL de medio de cultivo a la botella de vidrio estéril. Inserte la hoja de la célula en la cámara del contenedor de la cultura. Nota: Preste atención a la dirección de la superficie superior de la hoja de la célula.</li>
	<li>Añadir 3 mL de medio de cultivo en el contenedor de tejido y cerrar el recipiente. Ponga el sistema de perfusión dinámica en la incubadora y arranque la bomba. Fijar el caudal de la bomba peristáltica en 8 mL/min cultura la hoja de la célula en el sistema de perfusión dinámica durante 48 h.</li>
</ol>6. obtención de la hoja de la célula de varias capas de MSC
<ol><li>Autoclave de los instrumentos y componentes del tejido portador a 121 ° C durante 30 minutos, incluyendo tubos centrífuga de 1.5 mL, pinzas y pinzas dentadas.</li>
	<li>Sacar el conducto de entrada de la botella de vidrio para detener el suministro del medio de cultivo en el contenedor. Nota: Detenga la bomba peristáltica cuando el contenedor de la cultura es vacíelo.</li>
	<li>Sacar la hoja de la célula desde el contenedor de la cultura y ponerla en una placa de cultivo.</li>
	<li>Utilice una pinza para inmovilizar el portador de tejido y otros pinzas dentadas para separar el anillo blanco de la tensión de la base negra. Finalmente, obtener la hoja de la célula de BMSCs varias capas.</li>
	<li>Para la preservación de corto, cada hoja de la célula puede transferirse a un tubo centrífuga de 1.5 mL con el fórceps. El andamio DPP debe fijarse a la pared interna del tubo centrífugo y debe difundir la hoja de la célula hacia fuera tanto como sea posible en el tubo de centrífuga.</li>
	<li>Suavemente añadir 1 mL de medio de cultivo en el tubo centrífugo para sumergir la capa celular. Cierre la tapa del tubo de centrífuga y guarde la hoja de la célula a 4 ° C. Nota: La hoja de la célula debe trasplantada o analizada tan pronto como sea posible. Se recomienda utilizar la hoja de la célula dentro de 4 h.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente Protocolo informa un método eficiente para la construcción de una hoja de varias capas de MSC. Esta hoja celular exhibe óptima resistencia mecánica, alta siembra densidad celular y células madre favorable bioactividad. Utilizando BMSCs como ejemplo, la estructura 3D de la célula rápidamente se construye con RAD16-I péptido hidrogel. Después de ser cultivadas en el sistema de perfusión dinámica, la hoja de varias capas de CMMo se obtiene con éxito y las BMSCs mantienen una alta expresión de marcadores de célul...

Terapia de células madre se ha divulgado como un tratamiento efectivo para muchas enfermedades; sin embargo, retención celular baja y pobre supervivencia dentro de la zona de destino siguen siendo cuestiones críticas después de la inyección de células madre tradicional. Para resolver este problema, científicos ingeniería tejido desarrollado la técnica de la hoja de la célula. Una hoja monolayered célula con la matriz extracelular intacta en primer lugar se preparó utilizando la temperatura de respuesta cultura plato1, y sus seguimiento estudios informaron mejorías significativas de la célula de vástago de retención y sobrevivencia en el infartado zona2,3. Entre los métodos, construcción de la hoja de varias capas de células se ha divulgado como una estrategia efectiva para mejorar la supervivencia de la célula y la célula hoja efecto terapéutico3,4. Desde entonces, los científicos han trabajado en el desarrollo de métodos de construcción de hoja de diferentes células con el fin de aumentar la cantidad de celulares, propiedad de la célula de vástago y propiedades mecánicas de las hojas de la célula. Hasta ahora, ciertos tipos de hoja de la célula han sido construidos y estudiados en el tratamiento del infarto de miocardio5, cartílago lesión6, y7de la herida de la piel.
La actividad biológica de células antes del trasplante demostró una influencia emergente sobre la regeneración del tejido lesionado, y estrategias de construcción de hoja de diferentes células tienen diferentes efectos sobre las células madre. Por un lado, hojas de células confluentes sólo consistieron de alta densidad de las células madre y matrices extracelulares naturales podían ser adquiridos por apilamiento de hojas monolayered celular8 o mediante el uso de técnicas ingeniería de tejido magnético9. Por otra parte, los investigadores desarrollaron diferentes andamios para proporcionar una resistencia mecánica adecuada y apoyo celular crecimiento10,11,12, que permitió una baja siembra densidad para asegurar la nutrición la célula de vástago de la fuente. Sin embargo, a pesar de estos enfoques, la fuente de baja nutrición eficiente dentro de la estructura de la hoja de varias capas de la célula sigue siendo una preocupación importante durante la construcción en vitro . Por lo tanto, se necesita urgentemente un sistema de construcción de hoja celular eficiente y factible.
Este protocolo describe los pasos para preparar una hoja de células multilayeredmesenchymal la célula de vástago (MSC). En este sistema de construcción, la resistencia mecánica de la hoja de la célula proviene de una DPP. Partiendo de este andamio, la estructura 3D de la célula puede rápidamente construir con RAD16-I hidrogel de péptido y un sistema de perfusión dinámica se utiliza para la hoja de varias capas de células, con el fin de estabilizar la estructura de la hoja de celular 3D y proporciona nutrición suficiente de la cultura fuente para las células. Usando este sistema, una hoja de varias capas de CMMo se preparó con éxito y exhibe un efecto terapéutico óptimo en el infarto de miocardio de rata modelo13.

<table><tbody><tr><td>Fosfolipasa A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6534</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato</td><td>Gibco BRL</td><td>89033</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina / anfotericina&nbsp;</td><td>Gibco BRL 15640055</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de mesa</td><td>Changzhou Aohua Instrument Co.</td><td></td><td></td>KT20183</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino sudamericano&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>10270-106/P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina/2.21 mM EDTA</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de bioseguridad</td><td>Esco,Singapur</td><td>AC2-2S1</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de temperatura constante&nbsp;</td><td>Esco, Singapur</td><td>CLS-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga &nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>EP tubo</td><td>Axygen</td><td>31617934</td><td></td></tr><tr><td>Máquina centrífuga</td><td>TOMOS</td><td>1-16R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pura Matrix&nbsp;</td><td>BD</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cultivo dinámico de perfusión</td><td>Minucells y Minutissue</td><td>D-93077</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Ismatec</td><td>IPC N8</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de bomba</td><td>Ismatec</td><td>Nr.1306</td><td></td></tr><tr><td>MINUSHEET 1300&nbsp;</td><td>Componentes portadores de tejidos de Ratisbona</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr>Sistema de perfusión dinámica <td>MINUSHEET</td><td>en Ratisbona</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0006</td><td>Equipo de intercambio de gas de Ratisbona</td><td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>MINUSHEET 0002</td><td>Ratisbona</td><td></td><td>500 mL botella de vidrio&nbsp;</td></tr><tr>Contenedor de cultivo de perfusión <td>MINUSHEET 1301</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3d

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Terapia con células madre muestra un prometedor futuro en regenerar las heridas órganos y tejidos, y la técnica de la hoja de la célula ha sido desarrollada para mejorar la retención baja celular y la supervivencia pobre dentro de la zona de destino. Sin embargo, durante el proceso de construcción en vitro , una solución para mantener la actividad biológica de células madre y aumento de la cantidad de células dentro de la hoja de la célula es urgente. Aquí, este protocolo presenta un método para la construcción de una hoja de varias capas de células con células madre favorable bioactividad y óptima operatividad. Pericardio porcino decellularized (DPP) es preparado por fosfolipasa un método de descelularización2 (PLA2) como el andamio de la hoja de la célula, y rata médula ósea las células madre mesenquimales (BMSCs) son aisladas y ampliadas como las células sembradas. La estructura de la hoja temporal varias capas celulares se construye mediante el uso de RAD16-I péptido hidrogel. Finalmente, la hoja de la célula se cultiva con un sistema de perfusión dinámica para estabilizar la estructura tridimensional (3D), y la hoja de la célula podría obtenerse después de un cultivo de 48-horas en vitro. Este protocolo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de una hoja de varias capas de células, y la hoja de la célula podría desarrollarse como un producto de terapia de células madre favorable en el futuro.

El esquema de la construcción de la hoja de varias capas de células madre se muestra en la figura 1. Preparando el andamio de la hoja de la célula por el método de descelularización de2 PLA es el primer paso. Basado en el andamio, una estructura temporal celular 3D se construye mediante la mezcla de las células madre con el hidrogel del péptido RAD16-1. Para obtener una hoja de varias capas de células con células madre favorable bioactividad y ópti...

Este artículo proporciona un método eficiente y factible para la construcción de hojas de varias capas de células madre con células madre favorable propiedad.

Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Terapia con células madre se ha divulgado ampliamente como un tratamiento prometedor para muchas enfermedades. Y las técnicas de la hoja celular se han desarrollado con el fin de mejorar la retención de la célula y la supervivencia dentro de los objetivos, también. Durante la construcción de láminas celulares, el suministro de nutrición insuficiente sigue siendo un problema clave para la pérdida de la función de las células madre, y es una propiedad de células madre insatisfactorias que finalmente afectaría los efectos terapéuticos in vivo.Nuestro propósito de preparar el producto de lámina de células madre multicapa disponibles, nuestro equipo desarrolló el andamio de láminas celularizadas, pericardio y láminas celulares. Sobre la base del andamio, el arrancador de células multicapa se construiría rápidamente con hidrógeno nonapéptido y se utiliza un sistema de perfusión dinámica para garantizar el suministro de nutrición de la célula madre in vitro. Saque un andamio DBP seco y colótelo en el centro de la base negra.Coloque un anillo de tensión blanco en el andamio DBP y colócalo en el soporte de tejido. Asegúrese de que el andamio DBP esté totalmente fijado en el soporte de tejido. Agregue 100 medios de cultivo de microlitros en el andamio DBP.Coloque el andamio en la incubadora de 37 grados Celsius y déjelo remojar durante 15 minutos. Saque las células de la incubadora, retire los medios de cultivo del plato de cultivo, lave suavemente las células con dos mililitros de PBS caliente. Retire todo el PBS del plato de cultivo y asegúrese de que no quede líquido.Añadir dos mililitros a 1.25%solución de trippsina al plato, e incubar las células durante tres minutos. Detenga el efecto de la trippsina añadiendo dos mililitros de cultivo medio. Lave suavemente las células del plato.Transfiera las suspensiones celulares en un nuevo tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar las células a 220 veces la gravedad durante cinco minutos, y obtener sedimentos celulares. Retire el sobrenadante y acabe con el sedimento celular.Re suspenda las células con una solución de tres mililitros de 10%sacarosa. Aspirar 10 microlitros suspensión celular, y el número de celda de contenido lee un hemocicómetro, extraer tres millones de células y transferir en su nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifugar las células a 220 veces la raíz cuadrada durante cinco minutos, eliminar completamente los sobrenadantes y obtener el sedimento de las células.Preparar 20 microlitros 10%solución de sacarosa. Reabrir suavemente las células y obtener una suspensión uniforme. Añadir 20 microlitro péptidos hidro gel en la parte superior de la suspensión mezclar suavemente el gel de péptido hidro, y las células suspensión con la T, sacar el andamio DBP, dejando el portador del tejido, y luego aspirar suavemente la mediana de calculi con un T.Aspirar la mezcla la mezcla y añadir uniformemente al andamio DBP.Añadir un mililitro de esteliceto de calcio en la parte inferior del portador del tejido. Agregue suavemente un medio cultural de cuatro mililitros en el plato de cultivo y luego emerja la hoja de celda. Ponga las células en la incubadora durante dos horas para que se escaren.El sistema de perfusión dinámica incluye un recipiente de cultivo de perfusión, el recremento de intercambio de gas y una botella de vidrio. Los ensamblados son sistemas de perfusión dinámicos como se muestra en la figura. Añadir dos medios de cultivo hidrolilitros en la botella de vidrio.Inserte la hoja celular en la cámara del recipiente de cultivo, agregue tres medianas de cultivo de mililitros en el recipiente, coloque los sistemas de perfusión dinámica en las incubadoras y comience a bombear. Abra el contenedor de referencia cultural en el recumbent bipositivo. Saque la hoja de celda del recipiente de cultivo y colóquela en un plato de cultivo.Utilice un fórceps para inmovilizar el portador del tejido y utilice otros dos fórceps para separar el anillo de tensión blanca de la base negra. Por último, obtenga la hoja de celda multicapa. El andamio DBP es transparente.El SEM revende muestra que las universidades capturadas y los componentes están completamente reservados. Las hojas celulares se pueden obtener y mantener por fórceps para su conservación corta. Estas láminas celulares podrían transferirse a un tubo cilindriforme de 1,5 mililitros.Como modelo, por ejemplo, comenzando con muestras de células de BMFC altamente positivas para el marcador de células madre CD 9O y el CD 29. Después de la construcción de la célula, el BMFC está dejando la hoja celular sigue siendo altos niveles de expansión de CD 90 y el CD 29. La construcción de la estructura de celdas multicapa es el paso crítico del protocolo.El tiempo de la sartén requiere cuatro geles hidroeléctricos cuando el valor PH cambia de SA a neutro, por lo tanto, es importante lavar la célula con solución de sacarosa para eliminar los iones de superficie. Además, la relación de volumen de la suspensión celular y el panthihidrogel no es buena amiga para la construcción de la estructura multicapa temporal. Después de la formación de la estructura de células madre 3D, verá que el sistema de perfusión dinámica es importante para estabilizar la estructura multicapa, así como para mantener las viabilidades de las células madre.La infiltración dinámica de la mediana de cultivo podría facilitar que las células madre proliferen y extrapolar el contexto celular dentro de la estructura multicapa también los termómetros de cultivo dinámicos deben ajustarse de acuerdo con diferentes tipos de células madre.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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Aprende a construir láminas multicapa de células madre mesenquimales usando un sistema de cultivo dinámico 3D con perfusión. Este método mejora el suministro de nutrientes y la viabilidad celular para terapia regenerativa.

Construcción de una hoja de varias capas células madre mesenquimales con un sistema de cultivo dinámico 3D

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