Name: Spatiotemporally controlado translocación Nuclear de los huéspedes en las células vivas utilizando colas Molecular enjaulados como etiquetas de Photoactivatable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprende a inducir la translocación nuclear controlada por luz en células vivas utilizando etiquetas de pegamento molecular enjaulado. Este método permite la liberación selectiva de fármacos en el núcleo celular con precisión espaciotemporal.

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Reconocemos el centro para la integración de NanoBio, la Universidad de Tokio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para jóvenes científicos (B) (26810046) K.O. y parcialmente financiado por subvenciones de investigación promovido especialmente (25000005) a T.A. R.M. gracias la becas de investigación de la sociedad de Japón para la promoción de la ciencia (JSPS ) para jóvenes científicos y el programa de líderes en las escuelas de posgrado (GPLLI).

1. preparación de los huéspedes con pegamento-R enjauladoclave
<ol><li>Preparar la solución de pegamento-NBD Caged.<ol>
<li>Sintetizar el Cagedpegamento-NBD (figura 1) siguiendo los procedimientos previamente descritos20.</li>
		<li>Preparar una solución stock de Cagedpegamento-al siguiente día laborable (10 mM) en seco de dimetilsulfóxido (DMSO). Nota: Almacene la solución en oscuridad. La solución puede diluirse con buffers acuosos o medios de cultivo celular en uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de pegamento-QD Caged.<ol>
<li>Sintetizar Cagedpegamento-dibenzocylooctyne (Cagedpegamento-DBCO) (figura 1) siguiendo los procedimientos anteriormente descritos20.</li>
		<li>Preparar una solución stock de Cagedpegamento-DBCO (10 mM) en DMSO seco.</li>
		<li>Para la preparación de Cagedpegamento-QD, primero preparar QDs funcionalizados azida (azida-QD; Figura 3). Añadir 100 μl de una solución de dimetil formamida (DMF, 125 μm) de azida-PEG4-NHS éster (figura 3) a 400 μL de un DMF (500 nM) solución de puntos cuánticos (QDs) con PEG funcionalizados de Amina (amina-QD; Figura 3). Removemos la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Dializan la solución resultante para 24 h contra 800 mL de DMF usando una membrana de celulosa regenerada con 3.500 corte de peso molecular (MWCO).</li>
		<li>Diluir la solución madre de Cagedpegamento-DBCO a 50 μm con DMF. Añadir 200 μL de la solución a la solución de diálisis posterior (figura 3) y removemos la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente.</li>
		<li>Dializan la solución resultante para 24 h contra 800 mL de DMF usando una membrana de celulosa regenerada (25.000 MWCO).</li>
		<li>Diluir la solución resultante a 200 nM con DMF.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg"> Figura 3: ilustración esquemática de la preparación de Cagedpegamento-QD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. preparación de muestra de células Hep3B para observaciones microscópicas
<ol><li>Mantener las células del carcinoma Hep3B hepatocelular humano en mínimo medio esencial del águila (EMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C debajo del 5% CO2.</li>
	<li>Las células de la semilla el día antes del experimento. Células de3 Hep3B semilla 5.0 × 10 por bien de un sustrato de vidrio de 8 cámaras en EMEM (10% FBS, 200 μL) e incubar la muestra de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo y enjuague dos veces la muestra de células con 100 μl de una solución salina fosfato buffer de Dulbecco (D-PBS).</li>
</ol>3. observación de la translocación Nuclear de los huéspedes de molécula pequeña accionada por la luz UV
<ol><li>Suministrar la muestra de células (preparado en paso 2.3) con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-NBD (10 μm) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas. Nota: La incubación de la muestra de células en EMEM FBS-libre por más de 4 h causa daño celular grave.</li>
	<li>Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces.</li>
	<li>Para la visualización de los endosomas, fuente de la muestra de células con 200 μL de EMEM (10% SBF) que contienen un tinte rojo fluorescente (p. ej., LysoTracker rojo, 100 nM) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 20 min Quite la cultura medio y enjuagar la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces. La celda muestra con 200 μL de EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Para la translocación nuclear de Cagedpegamento-NBD, exponer la muestra de células a la luz de 2 minutos a través de una fibra óptica con una fuente de luz de xenon 100 W equipada con un filtro de paso de banda 365 nm UV. Para una muestra de células de referencia sin exposición a UV, mantener la muestra de células en oscuridad. Nota: La tapa de los substratos de cristal puede quitarse para eficiente exposición Ultravioleta. Desde hace mucho tiempo exposición a la luz UV puede causar citotoxicidad a las células.</li>
	<li>Para la visualización de los núcleos, añadir 1 μl de Hoechst 33342 (1 mg/mL) al medio de cultivo e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 10 minutos.</li>
	<li>Someter la muestra de células para la microscopía de láser confocal y grabar las micrografías en excitación a 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm) y 710 nm (dos fotones; Λ OBS = 390 465 nm) para el NBD, tinte rojo fluorescente y Hoechst 33342, respectivamente.</li>
</ol>4. observación de translocación Nuclear de los huéspedes de molécula pequeña por NIR dos fotones de luz
<ol><li>Suministrar la muestra de células (preparado en paso 2.3) con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-NBD (10 μm) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.</li>
	<li>Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces. La celda muestra con 200 μL de EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Someter la muestra de células para la microscopía de láser confocal y grabar las micrografías en excitación a 488 nm (λobs = 500-530 nm).</li>
	<li>Para la translocación nuclear de Cagedpegamento-NBD, irradiar la región incluyendo la célula de interés con un láser de excitación de dos fotones (710 nm), instalada como una fuente de luz en el microscopio, por 2 min (30 s × 4). Observar el desplazamiento como se describe en el paso 4.3.</li>
</ol>5. observación de la translocación Nuclear de huéspedes Macromolecular accionado por la luz UV
<ol><li>Suministrar la muestra de células (preparado en paso 2.3) con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-QD (10 nM) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.</li>
	<li>Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces. La celda muestra con 200 μL de EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Para la translocación nuclear de Cagedpegamento-QD, exponer la muestra de células a la luz de 2 minutos a través de una fibra óptica con una fuente de luz de xenon 100 W equipada con un filtro de paso de banda 365 nm UV. Para una muestra de células de referencia sin exposición a UV, mantener la muestra de células en oscuridad.</li>
	<li>Para la visualización de los núcleos, añadir 1 μl de Hoechst 33342 (1 mg/mL) al medio de cultivo e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 10 minutos.</li>
	<li>Someter la muestra de células para la microscopía de láser confocal y grabar las micrografías en excitación a 405 nm (λobs = 430-520 nm) y 488 nm (λobs = 625-680 nm) para Hoechst 33342 y QDs, respectivamente.</li>
</ol>6. Análisis de viabilidad de la célula
<ol><li>Mantener humano hepatocelular carcinoma Hep3B células en EMEM (10% SBF) a 37 ° C debajo del 5% CO2.</li>
	<li>Las células de la semilla el día antes del experimento. Células de3 Hep3B semilla 5.0 × 10 por pozo de una placa de cultivo de 96 pozos en EMEM (10% FBS, 200 μL) e incubar la muestra de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces.</li>
	<li>La célula muestra con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-NBD (0.1-100 μm) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.</li>
	<li>Exponer la muestra de células a la luz UV por 2 minutos a través de una fibra óptica con una fuente de luz de xenon 100 W equipada con un filtro de paso de banda 365 nm. Para una muestra de células análogo sin exposición a UV, mantener la muestra de células en oscuridad.</li>
	<li>Añadir 10 μl de reactivo (10 μl) de la célula contando Kit-8 al medio de cultivo e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% CO2 h 2.</li>
	<li>Sujetos de la muestra de células para espectroscopia de absorción (λ = 450 nm) usando un lector de microplacas.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
<li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+for+Cancer%3A+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li>
<li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENE+THERAPY%3A+Twenty-First+Century+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li>
<li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).</li>
<li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li>
<li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+in%21+Go+out%21+Inducible+control+of+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li>
<li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li>
<li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidinium-based+%26%2334%3Bmolecular+glues%26%2334%3B+for+modulation+of+biomolecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Guanidinium-based &#34;molecular glues&#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li>
<li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer%3A+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li>
<li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+%26%2334%3BMolecular+Glue%26%2334%3B+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &#34;Molecular Glue&#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue%3A+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li>
<li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+glues+for+manipulating+enzymes%3A+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li>
<li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Investigaciones anteriores de activadas por luz desplazamiento de proteínas en el núcleo celular se han logrado utilizando jaulas NLS7,8,9. Como se mencionó anteriormente, estos métodos requieren técnicas adicionales para incorporar las proteínas etiquetadas de NLS en el citoplasma. En cambio, nuestra etiqueta de pegamento-R Cagedpermite la translocación nuclear foto-inducida, sino también la absorción celular de los ...

El núcleo de la célula, que lleva la información genética, es uno de los orgánulos más importantes como objetivo subcelular-administración de fármacos, desde la modulación de la replicación de genes y expresión es eficaz para el tratamiento de varias enfermedades incluyendo el cáncer y genética trastornos1,2,3. Para nuclear entrega de medicamentos, Conjugación de péptidos etiquetas tales como localización nuclear (NLS) de señales4,5,6 ha sido ampliamente investigada. Sin embargo, para reducir efectos colaterales no deseados, es necesario el control espacio-temporal de la translocación nuclear.
Previamente, activadas por luz desplazamiento de proteínas en el núcleo celular se ha logrado utilizando jaulas NLS7,8,9. NLS emigra en el núcleo de la célula atando a transporte citoplásmico proteínas6. En los métodos divulgados, proteínas huésped teniendo enjaulados NLS directamente incorporadas en el citoplasma por microinyección8 o expresadas en las células diana mediante un código genético expansión técnica9. Por lo tanto, un método que puede lograr la absorción celular y translocación nuclear foto-inducida es ventajoso para aplicaciones prácticas.
Adjunto, describimos desplazamiento nuclear activada por la luz de los huéspedes en las células vivas utilizando etiquetas dendríticas pegamento molecular enjaulado (Cagedpegamento-R, figura 1). Pega molecular solubles en agua10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 cojinete varios colgantes de Gu+ se han desarrollado anteriormente que se adhieren firmemente a proteínas11,12,13,14,15, 16,17, los ácidos nucleic18,19,20, fosfolípido de las membranas21y arcilla nanosheets22,23 a través de la formación de múltiples puentes de sal entre sus colgantes de Gu+ y grupos oxyanionic en los objetivos. Los colgantes de Gu+ de Cagedpegamento-R están protegidos por un grupo de photocleavable aniónico, nitroveratryloxycarbonyl butirato-sustituido (BANVOC). Los huéspedes etiquetados Cagedpegamento-R se toman en la vida de las células mediante endocitosis y estancia en endosomas (figura 2). En photoirradiation, los grupos NVOC BAde Cagedpegamento-R son despegados para rendir un uncaged molecular pegamento (pegamento deUncaged-R) llevar varios colgantes de Gu+ , que luego facilita la migración de la huésped de etiquetado en el citoplasma, seguido por el núcleo de la célula (figura 2). La etiqueta de Cagedpegamento-R puede ser uncaged por la exposición a UV o dos fotones la luz de infrarrojo cercano (NIR) sin fototoxicidad grave. Demostramos la entrega nuclear spatiotemporally controlada de huéspedes macromoleculares como los huéspedes de molécula pequeña con las etiquetas de cola-R Caged, usando puntos cuánticos (QDs) y un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; Al siguiente día laborable), respectivamente, como ejemplos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figura 1: Estructuras esquemáticas del Cagedpegamento-R. Los colgantes de ion (Gu+) Guanidinio 9 de Cagedpegamento-R están protegidos por un grupo de nitroveratryloxycarbonyl butirato-sustituido (BANVOC). Los grupos NVOC BAson troceados por la irradiación con UV o luz NIR dos fotones. El núcleo focal de Cagedpegamento-R es functionalized con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Reimpreso con el permiso de referencia20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figura 2: Ilustración esquemática de translocación nuclear activada por la luz de los huéspedes conjugado con una etiqueta de Cagedpegamento-R. El invitado /Cagedconjugado de pegamento-R es tomado en la vida de las células mediante endocitosis. En photoirradiation, el Cagedpegamento-R es uncaged para obtener una etiqueta de pegamento-R Uncaged, que puede facilitar el escape endosomal de la huésped de etiquetado. Posteriormente, el huésped etiquetado emigra en el núcleo celular. Reimpreso con el permiso de referencia20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Azide-PEG4-NHS ester</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de celulosa regenerada (MWCO 3,500)</td><td>NIPPON Genetics</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de celulosa regenerada (MWCO 25,000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B Cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>sustrato de vidrio de 8 cámaras</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de 96 pocillos</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tampón de fosfato de Dulbecco (D-PBS)</td><td>Wako Pure Chemical Industrias</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Kit de conteo de células-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Equipado con láser de excitación de dos fotones (láser Mai Tai, Spectra-Physics)</td></tr><tr><td>Láser confocal microscopio de barrido</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de xenón</td><td>Asahi Spectra</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Paradigm</td><td></td></tr></tbody></table>

spatiotemporally controlado translocación nuclear de los huéspedes en las células vivas utilizando colas molecular enjaulados como etiquetas de photoactivatable

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

El núcleo es uno de los orgánulos más importantes como objetivo subcelular-administración de fármacos, desde la modulación de la replicación de genes y expresión es eficaz para tratar diversas enfermedades. Aquí, demostramos enjaulado de translocación nuclear activada por la luz de los huéspedes que utilicen etiquetas pegamento molecular (enjauladopegamento-R), cuyos múltiples colgantes de ion (Gu+) Guanidinio están protegidos por un grupo de photocleavable aniónico (butirato-sustituido nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Los huéspedes etiquetados Cagedpegamento-R se toman en la vida las células mediante endocitosis y permanecer en endosomas. Sin embargo, en photoirradiation, Cagedpegamento-R se convierte en uncaged molecular pegamento (pegamento deUncaged-R) llevar varios colgantes de Gu+ , que facilita el escape endosomal y la subsecuente translocación nuclear de los invitados. Este método es prometedor para selectivo sitio nuclear contra entrega de la droga, ya que los invitados etiquetados pueden migrar en el citoplasma, seguido por el núcleo celular sólo cuando photoirradiated. Enjaulado Etiquetas cola-R pueden ofrecer a invitados macromoleculares como puntos cuánticos (QDs) así como huéspedes de moléculas pequeñas. Enjaulado Etiquetas cola-R pueden ser uncaged con luz UV, pero también dos fotones (NIR) la luz infrarroja, que puede penetrar profundamente en el tejido.

Antes de photoirradiation, células Hep3B incubadas con Cagedpegamento-NBD exhibieron emisión de fluorescencia punteado desde su interior (λext = 488 nm; Figuras 4A y 4C, verde). Una micrografía análogo se obtuvo con excitación a 543 nm para el rojo fluorescente tinte (figuras 4B y 4C, rojo), indicando que el Cagedpegamento-NBD localizada en los endosomas. En cons...

Este protocolo describe translocación nuclear activada por luz de huéspedes en las células vivas utilizando etiquetas enjaulado pegamento molecular. Este método es prometedor para la entrega de drogas dirigidas a nuclear sitio selectivo.

Spatiotemporally controlado translocación Nuclear de los huéspedes en las células vivas utilizando colas Molecular enjaulados como etiquetas de Photoactivatable

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el área de la administración de medicamentos, como cómo entregar un medicamento a un granular celular específico. La principal ventaja de esta técnica es que la translocación nuclear del gas puede ser inducida por la luz. Demostrando el procedimiento serán Rina Mogaki y Akio Arisaka los estudiantes de posgrado de mi grupo.Para comenzar a preparar el pegamento molecular de la jaula ligada punto cuántico mediante la síntesis de pegamento molecular enjaulado vinculado dibenzocyclooctyne como se describe con más detalle en otros lugares. Preparar una solución de 10 mililitros de la dibenzocicloctyne ligada al pegamento molecular enjaulado en DMSO seco. A continuación, prepare el pegamento molecular enjaulado vinculado al punto cuántico haciendo primero puntos cuánticos funcionalizados aseye.Para lograr esto agregue 100 microlitros de 125 micromolar aseyes peg4 NHS éster en DMF a 400 microlitros de una solución DMF que contiene 500 nanomolares de puntos cuánticos que están recubiertos con clavija funcionalizada de amina. Revuelva la mezcla durante una hora a temperatura ambiente. Coloque la solución resultante en una membrana de

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Investigación

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Chemistry

Química

SNAP-etiqueta y una etiqueta CLIP-los sistemas de etiquetado de proteínas permiten la conexión específico, covalente de moléculas, incluyendo tintes fluorescentes, con una proteína de interés en las células vivas. Una vez clonado y expresado, la proteína marcada se puede utilizar con una variedad de sustratos para numerosas aplicaciones posteriores sin tener que clonar otra vez.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.

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Un método para el control espacio-temporal de la actividad GTPasa pequeña luz se describe. Este método se basa en la rapamicina inducida FKBP-FRB heterodimerización y sistemas de enjaulamiento foto-. Optimización de la luz de la irradiación permite la activación espacio-temporalmente controlada de las pequeñas GTPasas a nivel subcelular.

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

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Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

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Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

Este protocolo muestra cómo realizar el seguimiento un desplazamiento nuclear de la proteína bajo estrés de calor usando una fluorescencia verde (GFP) fusion proteína como marcador y 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. El protocolo de tinción de DAPI es rápido y conserva las señales de localización subcelular de GFP y proteína.

Detección de localización subcelular de la proteína por etiquetado de proteína de fluorescencia verde y 4', 6-Diamidino-2-phenylindole coloración en Caenorhabditis elegans

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Combinación de actuador de fuerza magnética 3D e imágenes de fluorescencia multifuncionales para estudiar la mecanobiología del núcleo

Este protocolo describe cómo configurar y realizar análisis automatizados de manera eficiente de datos de imágenes de células vivas obtenidos a partir del seguimiento del transporte nucleocitoplasmático a través de herramientas optogenéticas.

Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

Aprende a inducir la translocación nuclear controlada por luz en células vivas utilizando etiquetas de pegamento molecular enjaulado. Este método permite la liberación selectiva de fármacos en el núcleo celular con precisión espaciotemporal.

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Spatiotemporally controlado translocación Nuclear de los huéspedes en las células vivas utilizando colas Molecular enjaulados como etiquetas de Photoactivatable

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