Name: Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda la litografía bephore para inmovilizar ADN de longitud génica en superficies y facilitar la expresión génica sin células en biochips. Este método reproducible utiliza componentes comerciales disponibles.

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Agradecemos el apoyo financiero para este proyecto por la Volkswagen Stiftung (grant no. 89 883) y el Consejo Europeo de investigación (beca Convenio Nº 694410 - AEDNA). M.S.-S. agradece apoyo por el DFG a través de GRK 2062.

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<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Bephore litografía es una técnica robusta y versátil para el modelado inmovilización de ADN o ARN. Sin embargo, el procedimiento incluye varios pasos, que - si - pueden ser una fuente de fracaso o menor rendimiento del sistema.
Un paso crucial en la fabricación de chips de Bephore es la pegilación del sustrato, que proporciona la biocompatibilidad de la superficie. Aquí, el paso de limpieza con un procedimiento RCA es importante, ya que también activa la superficie para la silanización posteri...

Libre expresión génica, las reacciones son de gran interés para diversas aplicaciones en Bioquímica, biotecnología y biología sintética. Libre expresión de las proteínas fue instrumental para la preparación de las muestras de proteína pura, que fueron la base para numerosos estudios de biología estructural. Por ejemplo, sistemas libres de células fueron utilizados con éxito para la expresión de la proteína complejos1 o membrana proteínas2, que son difíciles de producir con la expresión de la célula. En particular, libre expresión génica reacciones también fueron utilizadas para dilucidar la estructura del código genético, a partir de los experimentos innovadores de Nirenberg y Matthaei en 19613.
Recientemente, ha habido un renovado interés en métodos sin células en biotecnología y biología sintética4,5,6. Sistemas libres de células pueden ser aumentados con compuestos no-biológica, y componentes de origen biológico distinto pueden combinarse más fácilmente7. A pesar de sistemas libres de células tienen la desventaja evidente que no es "crecer y dividir", es concebible para preparar Biorreactores abiertos libres de células con funciones metabólicas básicas y que sintetizan metabolitos cuando provisto de energía y carbono simple entradas8. Dentro del campo emergente de la biología sintética, sistemas libres de células prometen ser un "chasis" más predecible para la ejecución de funciones biológicas sintético.
Actualmente, las reacciones de expresión de genes sin células se llevan a cabo usando los extractos de célula (de diferentes fuentes tales como bacterias, levaduras, insectos), o sistemas de transcripción y traducción que fueron optimizados para diferentes aplicaciones (por ejemplo, procariotas vs. eucariotas la expresión génica, la producción de proteínas de membrana, etc.). Un popular protocolo para la preparación del extracto de la célula bacteriana (comúnmente llamados TXTL) fue proporcionado recientemente por V. Noireaux y compañeros de trabajo9. Sus propiedades biofísicas han sido completamente caracterizados10, y el sistema TXTL ha sido ya utilizado con éxito para llevar a cabo una serie de tareas bioquímicas complejas: por ejemplo, la Asamblea de bacteriófagos funcional a través de expresión sin células el genoma phage del11, la síntesis de proteína bacteriana filamentos12o la aplicación del gen sin células circuitos13,14.
Otro sistema popular en biología sintética libre de células es el sistema puro, que se reconstituye a partir de componentes purificados15,16. En comparación con el sistema TXTL, no contiene las nucleasas o maquinaria de degradación de proteínas. Mientras que la degradación de ADN lineal, las moléculas de ARN o proteínas es tan importante en el sistema puro, vías de decaimiento son realmente importantes para la implementación de funciones dinámicas. Para reducir el efecto de la degradación de la exonucleasa de plantillas gene lineal en el sistema TXTL (a través de RecBCD), la proteína extremo-protección de GamS debe agregar. El sistema puro y el TXTL están disponibles en el mercado.
Un tema estrechamente relacionado con preocupaciones de la biología celular gratis el estudio del efecto de la compartimentalización en reacciones bioquímicas y aún más la creación de estructuras de la célula artificiales o protocélulas17,18,19 ,20. Investigación sobre las células artificiales típicamente implica el encapsulamiento de un sistema de reacción bioquímica dentro de compartimientos vesiculares de fosfolípidos u otros Anfífilos. Mientras que estos sistemas ayudan a explorar aspectos fundamentales de la compartimentalización, o la aparición de la celularidad y estructuras auto-replicantes, afrontan los problemas típicos de los sistemas cerrados: en ausencia de un metabolismo funcional y apropiado mecanismos de transporte de membrana, es muy difícil mantener reacciones compartimentadas para largos períodos de tiempo - las moléculas del combustible se utilizan para arriba y se acumulan productos de desecho.
Una alternativa interesante a la compartimentación interior de dichos compartimientos imitan a las células es la organización espacial del material genético mediante métodos photolithographic. Inmovilización de "genes en un chip" fue promovido por el grupo Bar-Ziv en el Instituto Weizmann hace más de diez años21. Entre las principales cuestiones que tenían que resolver eran la adsorción inespecífica del ADN y la posible desnaturalización de proteínas en la superficie del chip. Bar-Ziv et al desarrolló una resistencia Fotolitografía dedicado llamado "Daisy", que se compone de un silano reactivo terminal para la inmovilización de las moléculas de resistir en las superficies de dióxido de silicio, un espaciador largo polietileno glicol (PEG) que aseguró biocompatibilidad y una headgroup photocleavable, que fue convertida en una amina reactiva a la irradiación con luz ultravioleta (UV). Se ha demostrado que la Margarita puede utilizarse para inmovilizar moléculas de la DNA del gene-longitud (con longitudes de varios kilo-pares de bases (kbp)) sobre una superficie de viruta. De un polímero física punto de vista, los sistemas representan cepillos de polímero injertados sobre un sustrato sólido. Debido a la naturaleza de polielectrolito de ADN, la conformación de estos cepillos es afectada fuertemente por efectos de iones específicos osmótico y otros22,23.
Lo más importante, se ha demostrado que genes inmovilizada de sustrato son aún funcionales y pueden ser transcrito y traducido en ARN y proteínas. Cepillos de gene son accesibles para ARN Polimerasas de solución24, y la mezcla macromolecular complejo de la transcripción y traducción no es desnaturalizada en la superficie. Una de las ventajas de la inmovilización de componentes genéticos en un sustrato es que pueden funcionar en un sistema de reactor abierto microfluídico que continuamente se suministra con moléculas pequeñas precursor y de la cuales productos de desecho puede ser eliminado25 , 26.
Recientemente hemos desarrollado una variante de este método llamado Bephore (para haz de electrones Biocompatible y fotoresistencia)27, que se basó exclusivamente en los componentes comercialmente disponibles y utilizados secuencia específica DNA filamento invasión las reacciones para la realización de un procedimiento de litografía varios pasos simples de implementar para la creación de células artificiales basadas en el chip. Un Resumen esquemático del procedimiento se muestra en la figura 1. Se basa en horquilla las moléculas de ADN que contiene un grupo photocleavable, que están inmovilizadas en una capa biocompatible de PEG. Fotorrotura de la horquilla expone una secuencia de cadena simple punto de apoyo, a través de que DNA moléculas de interés (que contiene la secuencia DIS "desplazar") pueden ser conectado vía invasión de filamento mediada por punto de apoyo.
Mientras que Bephore es potencialmente más fácil de implementar, Daisy permite la realización de muy denso y limpio "cepillos de gen", que tiene ventajas en ciertas aplicaciones. En principio, sin embargo, litografía Daisy y Bephore podría ser fácilmente combinada. Un método de litografía relacionada utilizando desplazamiento de hebra de ADN para estructurar ADN cepillos en oro fue previamente desarrollado por Huang et al., pero no fue utilizado en el contexto del gen libre expresión28,29.
En el siguiente protocolo brindamos que una descripción detallada de la producción de ADN cepillos para la expresión del gen libre utilizando el método de Bephore. Describimos cómo el gene se fabrican y demostrar el uso de multi-step foto-litografía para la inmovilización espacialmente estructurado de genes en un chip. También discutimos la fabricación de cámaras de reacción y la aplicación de la microfluídica para la realización de reacciones de expresión del gen de la en-viruta.

<table><tbody><tr><td>Oblea de silicio con dióxido de silicio de 50 nm (sustrato Bephore)Espesor de</td> <td>la oblea</td><td></td> Siegert <td>(&micro; m): 525 y más; 25, diámetro (mm): 100</td></tr><tr><td>oblea de silicio (para molde maestro PDMS)</td>Espesor <td>de la oblea</td><td></td> Siegert <td>(&micro; m): 525 y más; 25, Diámetro (mm): 76.2 (3")</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio n.º 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio n.º 1.5</td><td>Auxiliar</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotina-PEG-Silano</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5.000</td></tr><tr><td>Tolueno anhidro</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>ADN</td><td>Tecnologías de ADN integradas ( IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HF New</td><td>England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>Kit de PCR</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Kit de limpieza de PCR con columna de centrifugación</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>Sistema de expresión libre de células</td></tr><tr><td>PDMS&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PTFE (ID: 0,8 mm, OD: 1,6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>tecnología micro resist&nbsp; </td><td></td> GmbH <td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>micro resist technology&nbsp; </td><td></td> GmbH <td>Revelador fotorresistente</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>Promotor de adherencia</td></tr><tr><td>Pegamento de silicona de dos componentes</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lámina amarilla con protección UV</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mascarillas para fotolitografía</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Fotolitografía e imágenes de fluorescencia</td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en agua 60x</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Utilizado con Olympus BX51, NA 0.9</td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en agua 20x</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Utilizado con cámaras Olympus BX51, NA 0.5</td></tr><tr><td></td><td>Fotometría</td><td>Coolsnap HQ</td><td>Utilizado con Olympus BX51</td></tr><tr><td>Fuente de luz</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>Utilizado con Olympus BX51</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>Fluorescencia Imagen de la expresión génica</td></tr><tr><td>Objetivo 4x</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>Se utiliza con la cámara Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>Se utiliza con Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Fuente de luz</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>Se utiliza con la incubadora de jaula Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td></td><td>Okolab bold</td><td>line</td><td>Se utiliza con el controlador de presión Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Elveflow</td><td></td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotómetro</td><td>Implen</td><td>Medición de la concentración</td>de <td></td> ADN</tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, operado a 0,8 mbar con la muestra en una jaula de Faraday</td></tr></tbody></table>

superficie-inmovilización funcional de genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Inmovilización de genes en superficies litográfico estructurados permite el estudio del gen compartimentado procesos de expresión en un sistema de biorreactor de microfluidos abierto. En contraste con otros enfoques hacia sistemas celulares artificiales, tal configuración permite un suministro continuo con gene expresión reactivos y drenaje simultáneo de productos de desecho. Esto facilita la implementación de procesos de expresión génica sin células durante largos períodos de tiempo, lo cual es importante para la realización de sistemas de retroalimentación reguladora de genes dinámico. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la fabricación de biochips genéticos utilizando una técnica litográfica de simple-to-use basada en reacciones de desplazamiento de hebra de ADN, que utiliza exclusivamente los componentes comercialmente disponibles. También proporcionamos un protocolo sobre la integración de genes compartimentadas con un polidimetilsiloxano (PDMS)-sistema de microfluidos. Por otra parte, nos muestran que el sistema es compatible con microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, que puede ser utilizado para la observación directa de las interacciones moleculares entre el ADN y las moléculas contenidas en la mezcla de la expresión.

Litografía de dos etapas: la figura 5 muestra el resultado de un proceso de dos pasos litográficos en un portaobjetos de vidrio con la superposición de patrones de fluorescencia etiquetada DIS hilos.
Expresión de una proteína fluorescente de un cepillo de gene: figura 6 demuestra la expresión de la proteína fluorescente YPet de DNA inmovilizado. En varios puntos de tiem...

Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.

Superficie-Inmovilización funcional de Genes utilizando litografía de desplazamiento de varias fases de la cadena

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Los biochips de ADN son una atractiva plataforma de investigación para la biología autointético, desarrollada originalmente por el grupo BASF, que permite el funcionamiento de circuitos genéticos in vitro durante largos períodos de tiempo. Con este protocolo, esperamos poner esta tecnología a disposición de una gama más amplia de investigadores. Nuestro método, llamado litografía de bephore, representa una estrategia para la inmovilización del ADN basada en la reacción de desplazamiento de la cadena de ADN.La fuerza de esta técnica reside en sus capacidades litográficas de varios pasos, su simple reproducibilidad y la disponibilidad comercial de todos los componentes. Al igual que otras soluciones de biochip, el before se puede combinar con diferentes tecnologías. Por ejemplo, los cepillos genéticos funcionales se pueden ensamblar dentro de microcompartidores para la expresión de proteínas.Para empezar, prepare una mezcla de RCA mezclando cinco partes de agua con una parte de una solución de 30% de amoníaco en un vaso de precipitados de vidrio. Calienta la mezcla a 70 grados Celsius en un plato caliente mientras remueves. Una vez que alcance los 70 grados centígrados, agregue una parte 30%peróxido de hidrógeno.A continuación, coloque una oblea de silicio de 100 milímetros de diámetro en la solución, para eliminar el material orgánico y las partículas de ella. Después de 30 minutos, saque el sustrato, enjuáguelo bien con agua de una botella de lavado y séquelo con una pistola de nitrógeno. Proceder inmediatamente con la PEGylation del sustrato.Para lograr esto, primero diluir la biotina-PEG-Silane en tolueno seco a 5 miligramos por mililitro, y vórtice la solución hasta que esté bien mezclada. Con el sustrato colocado en un plato Petri de vidrio, pipetee lentamente la solución sobre el sustrato, cubriendo toda la superficie, pero evite permitir que la solución fluya sobre el borde. Una vez cubierta la superficie, cierre el plato Petri y, a continuación, agregue una cubierta adicional.Después de 30 minutos, retire la cubierta y agregue aproximadamente 40 mililitros de alcohol isopropílico al plato de Petri. Luego saque el sustrato, enjuáguelo de nuevo a fondo con alcohol isopropílico y séquelo con una pistola de nitrógeno. Cuando esté seco, guarde el sustrato en la oscuridad hasta que sea necesario.Preparar un sustrato utilizando un cortador de vidrio o un bisturí para formar trozos de un centímetro por un centímetro. A continuación, agregue una marca de alineación simple haciendo un rasguño corto desde el centro hacia un borde del sustrato. Sopla cualquier partícula pequeña del chip usando una pistola de nitrógeno.A continuación, mezcle dos gotas de un pegamento de silicona de dos componentes y aplique el pegamento a la superficie del chip, dejando el área alrededor de la punta del rasguño en blanco. Allí el pegamento proporciona una barrera hidrófoba, manteniendo soluciones acuosas en el chip. Esto facilita los pasos de lavado posteriores, y reduce la cantidad de ADN necesario para las incubaciones.En un paso posterior, el pegamento se puede pelar fácilmente. En los siguientes pasos, el ADN fotocleaveable se maneja solo en un entorno de luz amarilla. Cubra el chip con unos 10 microlitros de una mezcla de bephore a temperatura ambiente, y coloque el chip en una caja parcialmente llena de agua para reducir la evaporación.Después de una hora, lave el chip varias veces con PBS para eliminar cualquier mezcla de beforo sin ataduras. A continuación, agregue 10 microlitros de la mezcla de pasivación al chip. Después de dos horas, lave el chip varias veces con PBS para eliminar los agentes de pasivación no enlazados.Corte una máscara de foto impresa al tamaño adecuado para que se ajuste a un soporte de máscara adecuado. Insértelo en la posición del tope de campo y utilice las marcas de alineación para alinear la máscara en el soporte. Con el sustrato colocado en la etapa de microscopía, inserte un filtro rojo en la trayectoria de iluminación y concéntrese en la superficie del sustrato.A continuación, navegue a la región del sustrato que se expondrá. A continuación, inserte el soporte de la máscara, bloquee la iluminación y cambie al filtro UV. A una intensidad de luz baja, abra el obturador y utilice la cámara para enfocar rápidamente la máscara en el sustrato.Con el sustrato ahora alineado y la máscara enfocada, bloquee el camino de luz a la cámara e ilumine el sustrato a una alta intensidad de luz para el tiempo de exposición deseado. Después de la exposición, retire la muestra del microscopio y retire cuidadosamente el mayor tampón posible del sustrato sin secarla. A continuación, agregue de 10 a 20 microlitros de ADN con la secuencia para la fijación a la superficie.Coloque el sustrato en una caja húmeda para evitar que se seque e incubar el ADN en el sustrato durante dos horas a temperatura ambiente. Para observar la expresión génica compartimentada en un microscopio invertido, primero prepare por separado las dos partes del soporte de la muestra. Comience pegando un chip de bephore con un cepillo genético inmovilizado en el soporte de la viruta, utilizando cinta adhesiva de doble cara.A continuación, agregue un poco de grasa al vacío alrededor del orificio central de la parte inferior del soporte e inserte el soporte de viruta. Ahora ensamble la parte superior del soporte. Cortar un chip PDMS delgado con compartimentos lo más pequeños posible, dejando un canal abierto a un lado para luego permitir el intercambio de residuos y moléculas precursoras por difusión Después, tratar el plasma-tratar un resbalón de cubierta de vidrio en la parte posterior del chip PDMS con plasma de oxígeno.Inmediatamente después del tratamiento, coloque el chip PDMS en el centro del portaobjetos de vidrio, con los compartimentos apuntando hacia arriba. Luego, hornee el vaso con el PDMS durante una hora a 70 grados Centígrados. Poco antes de montar todo el portavelas, trate por plasma el portaobjetos de vidrio con el chip PDMS como antes.A continuación, agregue un poco de grasa al vacío alrededor del orificio grande del soporte superior y coloque la diapositiva de vidrio con el PDMS en él. Presione suavemente el vaso sobre la grasa. Retire cuidadosamente el tampón del chip y lávelo una vez con 10 microlitros del sistema de autoexpresión.A continuación, agregue 60 microlitros de sistema de autoexpresión en el chip y retire el pegamento de silicona de dos componentes de los bordes. Ahora, agregue 20 microlitros del sistema de expresión al PDMS. Después de colocar la gota en el PDMS, compruebe rápidamente en el microscopio estereoscópico que los compartimentos están bien mojados y sin burbujas de aire.Si hay burbujas de aire, trate de lavarlas. Para ensamblar las dos piezas del soporte, y para alinear cámaras y cepillos de ADN, trabajar bajo un microscopio estereoscópico. Inmovilice el soporte inferior con un brazo de sujeción para que los dos tornillos y las alas sean fácilmente accesibles con ambas manos.Inserte el soporte superior en el soporte inferior y tírelo hasta que las gotas del sistema de expresión sin celda se fusionen. A continuación, compruebe que los compartimentos y la marca de alineación se encuentran en una región similar en el plano XY. Desde abajo, arruine las tuercas de ala hasta que toquen el lado inferior del soporte.Mientras alinea los compartimentos y el chip en el plano XY, apriete suavemente las tuercas de ala. Este paso requiere cierta experiencia y depende de la construcción del portacuchillas. El PDMS debe ser presionado sobre el chip sólo con una fuerza suave.A continuación, rocíe una esponja en el recinto antievaporción con agua e inserte el soporte en la caja. A continuación, llene una jeringa de cinco mililitros con pegamento de silicona de dos componentes y úselo para sellar la caja. Por último, transfiera la caja a un microscopio con temperatura controlada e imagine el cepillo de ADN y la reacción mediante microscopía de fluorescencia.Un proceso litográfico de dos pasos, realizado aquí en un portaobjetos de vidrio bephore, produce patrones superpuestos de hebras de ADN con etiqueta fluorescente. En esta demostración de expresión génica en chip, el ADN se inmoviliza en la cámara de la izquierda. Cuando se expone a la mezcla de expresión, la proteína fluorescente amarilla YPet se sintetiza a partir del ADN inmovilizado.Para evaluar la actividad del sistema de expresión génica, se observa la recuperación de la fluorescencia después de un paso de blanqueo. A las dos horas, la intensidad de la fluorescencia se recuperó rápidamente. Sin embargo, después de cuatro y seis horas, no se recuperó, lo que indica que sin un nuevo suministro de la mezcla de expresión, la reacción terminó alrededor de la cuarta hora.Aunque la expresión génica es limitada en un sistema cerrado, puede mantenerse durante períodos de tiempo más largos suministrando a los compartimentos de expresión moléculas precursoras adicionales a través de micro-fluidos. El método bephore se utiliza para inmovilizar oligonucleótidos o ADN de longitud genética, que se puede aplicar para construir sistemas de cepillos de ADN que interactúan para la expresión auto-gengénica. La técnica también se puede utilizar para otras aplicaciones en la biofísica, como estudios de fluorescencia de molécula única.Después de ver este video, usted debe ser capaz de fabricar biochips bephore a partir de obleas o diapositivas de vidrio, e integrarlos en sus proyectos de investigación.

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