Name: Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprende el método E plus E para enriquecer y expandir células T específicas de antígeno raro mediante nanopartículas magnéticas. Esta técnica avanza la inmunoterapia personalizada y la investigación oncológica.

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J.W.H. agradece el centro de entrenamiento de NIH cáncer nanotecnología en el Instituto de Johns Hopkins la nanobiotecnología, la nacional Science Fundación graduados beca de investigación (DGE-1232825) y la Fundación de arcos para apoyo de becas. Este trabajo fue financiado por el apoyo de los institutos nacionales de salud (R21 P01-AI072677, R01-CA108835,-CA185819), iniciativa de innovación TEDCO/Maryland y la Fundación de Coulter (JPS).

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<li>Srivastava, P. K., Duan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+antigenic+fingerprint+of+each+individual+cancer+for+immunotherapy+of+human+cancer%3A+genomics+shows+a+new+way+and+its+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572(2014).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433(2016).</li>
</ol>

Los autores declaran la siguiente competencia interest(s) financieros: bajo un acuerdo de licencia entre NexImmune y la Universidad Johns Hopkins, Jonathan Schneck tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad en las ventas de los productos descritos en este artículo. Él era también un fundador de NexImmune y posee acciones en la empresa. Se desempeña como miembro de Junta Directiva y Consejo Asesor científico de NexImmune. Los términos de estos acuerdos han sido revisados y aprobadas por la Universidad Johns Hopkins con arreglo a sus políticas de conflicto de intereses.

Hemos creado una tecnología de aislamiento de novela células de T específicas de antígeno basada en nanopartículas artificiales antígeno que presenta las células (aAPCs). Nanopartícula aAPCs péptido-carga del MHC en la superficie que permite la Unión de células de T específicas de antígeno y activación junto con activación coestimuladoras. aAPCs también son paramagnéticos y así se puede utilizar para enriquecer raros antígenos específicos de células T mediante un campo magnético. Hemos optimizado y estudió las propiedade...

Con el surgimiento de muchos inmunoterapias, hay necesidad de ser capaz de caracterizar y controlar las respuestas inmunitarias. En particular, la respuesta inmune adaptativa es de interés debido a la especificidad y la durabilidad de las células. Recientemente, terapias de la célula de T del receptor de antígeno quimérico se han aprobado para la terapia del cáncer; sin embargo, los receptores de antígeno se basa en el antígeno de superficie celular común CD19, en lugar de los antígenos específicos para el cáncer1. Más allá de la especificidad, las inmunoterapias pueden sufrir de la falta de control y la limitada comprensión de la dinámica respuesta inmune en cáncer y autoinmunidad.
Uno de los desafíos de estudiar la respuesta antígeno específica es su extremadamente baja frecuencia, por ej., linfocitos T antígeno específicos son 1 de cada 104 106 T células2,3. Así, para investigar que T las células están presentes o en respuesta, las células necesitan que sea enriquecido y ampliado, o su señal a amplificar. Es caro y difícil de mantener las células de alimentador mediante las técnicas actuales que se centran en la expansión de las células antígeno específicas. Las técnicas actuales que se centran en amplificar la señal de T específicas de antígeno de las células, como ensayo de la enzima-ligado immunospot (ELISPOT), limitar la reutilización de esas células de T4. Por último, debido a la baja sensibilidad, con frecuencia estas dos técnicas deben combinarse para la enumeración específica de antígeno.
Para enfrentar estos problemas, hemos desarrollado el antígeno artificiales basados en nanopartículas magnéticas que presenta células (aAPC)5,6,7,8. La aAPC puede ser funcionalizado con un complejo de péptido señal específica de antígeno cargado de histocompatibilidad (pMHC) y moléculas coestimuladoras -e.g., un anticuerpo anti-CD28-tanto enriquecer las células T antígeno específica y posteriormente estimular su expansión (figura 1). Las partículas así pueden ser un producto estándar rentable que puede ser tanto modificado para requisitos particulares para cubrir estímulos específicos de antígeno estandarizado a través de experimentos y pacientes. Realizar el enriquecimiento y ampliación del proceso resultados en cientos de miles de doble expansión de antígenos específicos de células CD8 + T y puede resultar en frecuencias hasta un 60% después de sólo una semana, lo que permite la caracterización o uso terapéutico de la gran número de células. Adjunto, describimos cómo hacer nanopartículas aAPCs, algunas consideraciones de diseño críticas en la elección de las propiedades de las nanopartículas y demostrar algunos resultados típicos de utilización de estas partículas en aislamiento y expansión de células T CD8 + específica de antígeno.

<table><tbody><tr><td>DimerX I: Dimérico soluble recombinante humano HLA-A2:Ig Proteína de fusión</td><td>BD Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: Ratón dimérico soluble recombinante H-2D[b]:Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551323</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: Ratón dimérico soluble recombinante H-2K[b]:Proteína de fusión Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>550750</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 50 000</td><td>GE Ciencias de la Vida 28932362</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO 50 000</td><td>GE Ciencias de la Vida</td><td>28932257</td><td></td></tr><tr><td>Beta 2 Humana Purificada Microglobulina</td><td>Bio-Rad</td><td>PHP135</td><td></td></tr><tr><td>nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanopartículas</td><td>Micromod</td><td>79-01-102</td><td></td></tr><tr><td>Super Mag NHS Perlas activadas, 0.2 y micro; m</td><td>Ocean Nanotech</td><td>SN0200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microperlas anti-biotina UltraPure</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-637</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante Sulfo-SMCC&nbsp;</td><td>ProteoChem</td><td>c1109-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de 2-Iminotiolano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6256 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de media área de 96 pocillos, poliestireno negro</td><td>Corning</td><td>3875</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ig, &lambda; 1, &lambda; 2, & &lambda; 3 Cadena ligera&nbsp; Clonar &nbsp; R26-46&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553434</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratón Anti-Armenio y Hámster Sirio IgG&nbsp; Clonar &nbsp; G192-1</td><td>BD Biociencias</td><td>554026</td><td></td></tr><tr><td>B6. Ratones Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (PMEL transgénico)</td><td>Ratones de Laboratorio Jackson</td><td>005023</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (tipo salvaje B6)</td><td>Kit</td><td></td> de aislamiento de células T 000664 <td></td></tr><tr><td>de laboratorio Jackson CD8a+, ratón</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Columnas LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina-Ficoeritrina, SAv-PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td></td></tr><tr><td>Imanes de disco N52 de 0,75 pulgadas&nbsp;</td><td>K& J Magnetics</td><td>DX8C-N52</td> APC anti-ratón CD8a <td></td></tr><tr><td>Anticuerpo, clon 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas verdes reparables, para excitación de 488 nm&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L-34969</td><td></td></tr></tbody></table>

enriquecer y ampliar las células t específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Hemos desarrollado una herramienta para enriquecer y expandir las células T específicas de antígeno. Esto puede ser útil en casos tales como A) detectar la existencia de antígenos específicos de células T, B) sondear la dinámica de las respuestas específicas de antígeno, C) entender cómo respuestas antígeno específicas afectan al estado de enfermedad como autoinmunidad, D) desmitificar heterogéneos las respuestas de células T específicas de antígeno, o E) utilizan células de antígeno-específica para la terapia. La herramienta se basa en una partícula magnética que hemos conjugado antígeno específicas y células T señales coestimuladoras y que llamamos como artificial antígeno que presenta las células (aAPCs). En consecuencia, puesto que la tecnología es fácil de producir, se puede fácilmente ser adoptado por otros laboratorios; por lo tanto, nuestro propósito aquí es describir en detalle la fabricación y el uso posterior de la aAPCs. Se explica cómo asociar señales coestimuladoras y antígeno específicas a la aAPCs, cómo utilizarlas para enriquecer para linfocitos T antígeno específicos y cómo ampliar linfocitos T antígeno específicos. Además, se destacan ingeniería diseño consideraciones basan en información experimental y biológica de nuestra experiencia con caracterización de linfocitos T antígeno específicos.

Para completar una exitosa enriquecimiento y expansión de linfocitos T antígeno específicos, la carga de péptido MHC-Ig y moléculas coestimuladoras deben con éxito acoplarse a la partícula de la aAPC. Basado en los 3 métodos de fijación de la partícula, proporcionamos algunos datos representativos para un resultado de procedimiento verbal exitosa (figura 5a). De hecho, si la densidad del ligando es demasiado baja, entonces no habrá efectiva estimulación de cé...

Linfocitos T antígeno específicos son difíciles de caracterizar o utilizar en terapias debido a su extremadamente baja frecuencia. Aquí proporcionamos un protocolo para desarrollar una partícula magnética que puede atar a las células T antígeno específicas para enriquecer estas células y luego ampliarlas varias centenas para caracterización y tratamiento.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Así que la principal ventaja de nuestra novedosa técnica, la denominamos E plus E, que significa enriquecimiento más expansión, es que podemos enriquecer y expandir estas células, células raras específicas de antígenos, simultáneamente. Esto nos permite desarrollar un número suficiente de células que vamos a poder utilizar para investigar su papel en diferentes entornos y en diferentes entornos clínicos o incluso nos permite desarrollar ahora un gran número de células que podemos utilizar para la inmunoterapia de una manera que antes no podíamos. El método que hemos desarrollado, este E plus E, puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología básica sobre la presencia de neoepitopes.¿Qué son los neoepitopes? Esos son los epítopos personalizados que sabemos que ahora son muy importantes en términos de inmunoterapia contra el cáncer y también dinámicas específicas de antígenos y cómo estos factores afectan a los estados de la enfermedad y para la terapia celular eficaz. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia, ya que la célula que presenta antígenos artificiales de nanopartículas podría ser un producto listo para usar que se adapta fácilmente a la

enrich-expand-rare-antigen-specific-t-cells-with-magnetic

Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

Aquí se describe un método para activar y expandir las células NKT de granel poblaciones de células T usando células artificiales presentadoras de antígenos (AAPC). El uso de CD1d basado AAPC proporciona un método estandarizado para la generación de un número elevado de células NKT funcionales.

Antígeno Artificial célula presentadora (AAPC) La activación mediada y expansión de linfocitos T citolíticos naturales

Este protocolo describe el uso de péptido: MHC tetrámeros y microperlas magnéticas para aislar poblaciones de baja frecuencia de células T específicos para el epítopo y analizarlas por citometría de flujo. Este método permite el estudio directo de sus propias poblaciones de células T de interés...

Péptido: MHC tetrámero basado en el enriquecimiento de células T específicos para el epítopo

Este video describe el enriquecimiento de células T del bazo de un ratón mediante selección negativa utilizando un separador magnético. La técnica consiste en dirigirse a las otras células de la muestra para su agotamiento mediante el uso de anticuerpos o ligandos dirigidos contra antígenos específicos de la superficie celular.

Enriquecimiento de células T: una técnica para aislar células T de una población de células mixtas mediante separación magnética

Este video describe un protocolo para aislar células T CD8+ específicas de antígenos raros utilizando células presentadoras de antígenos artificiales (aAPCs) basadas en nanopartículas magnéticas funcionalizadas con MHC-Igs cargadas de péptidos antigénicos y anticuerpos anti-CD28. La interacción de las aAPC con los linfocitos T CD8+ que expresan específicamente los receptores de linfocitos T dirigidos a péptidos antigénicos, seguida de su expansión in vitro, da como resultado el enriquecimiento...

Enriquecimiento y expansión basados en nanopartículas de linfocitos T CD8+ específicos de antígenos

Aquí se describe un protocolo para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con un fuerte momento magnético y un fuerte en el infrarrojo cercano (NIR) absorbancia. El protocolo también incluye conjugación de anticuerpos a las nanopartículas a través de la fracción Fc para diversas aplicaciones biomédicas que requieren orientación específica molecular.

Nanoclusters Síntesis de Immunotargeted Magneto-plasmónica

Aquí presentamos un protocolo adaptado que se puede utilizar para generar un gran número de células T asesinas naturales invariantes murinas a partir del bazo de ratón. El protocolo describe un enfoque mediante el cual las células iNKT esplénicas pueden enriquecerse, aislarse y expandirse in vitro utilizando un número limitado de animales y reactivos.

Un método optimizado para aislar y expandir Invariante Natural Killer células T de ratón Bazo

Se presenta un protocolo para la síntesis y cationización de magnetoferritina dopada con cobalto, así como un método para magnetizar rápidamente células madre con magnetoferritina catiónica.

Síntesis de cationizada Magnetoferritin para la magnetización ultra-rápido de las células

Un método simple y efectivo que emplea nanopartículas magnéticas para detectar y enriquecer células B reactivas al antígeno para el análisis funcional y fenotípica se describe.

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

Describimos un protocolo rápido y robusto para enriquecer células T asesinas naturales invariantes (iNKT) del bazo de ratón y expandirlas in vitro a números adecuados para estudios in vitro e in vivo.

Purificación y expansión de células T asesinas naturales invariantes de ratón para estudios in vitro e in vivo

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

Aprende el método E plus E para enriquecer y expandir células T específicas de antígeno raro mediante nanopartículas magnéticas. Esta técnica avanza la inmunoterapia personalizada y la investigación oncológica.

Enriquecer y ampliar las células T específicas de antígeno raro con nanopartículas magnéticas

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