Name: Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Aprenda a aislar células de cáncer de mama apoptóticas mediante FACS y citometría de flujo para estudiar la transición a células similares a células madre tras la reversión de la apoptosis.

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Este trabajo fue apoyado por la innovadora tecnología fondo de innovación tecnología de la Comisión: financiamiento de apoyo desde el estado clave de laboratorio de Agrobiotecnología (CUHK), el fondo de investigación biomédica de Lo Kwee-Seong y Lee Hysan Fundación. YX fue apoyado por la beca de postgrado de la CUHK.

1. preparación de mama las células cancerosas no madre
<ol><li>Cultura MCF-7 y MDA-MB-231 células en 10 mL de rojo de fenol libre Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) en un plato de 100 mm. Cultura T47D en 10 mL de rojo de fenol libre RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, 10% inactivado con calor FBS y 1% v/v penicilina-estreptomicina (PS) en un plato de 100 mm. Células en cultivo a 37 ° C en un incubador 95% aire célula cultura de 5% CO2. Nota: Rojo de fenol afecta la detección basada en fluorescencia pero también tiene una influencia potencial sobre el crecimiento de las células de cáncer de mama debido a sus efectos similares al estrógeno31. Por ejemplo, rojo de fenol puede estimular el receptor de la progesterona y el crecimiento de las células de MCF-731. También podría estimular el crecimiento de las células de T47D31.</li>
	<li>Células de lavado con 2 mL de fosfato tampón salino (PBS) dos veces. Añadir 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA MCF-7 y MDA-MB-231 o 2 mL de 0.25% tripsina-EDTA a las células T47D. Nota: La concentración de tripsina-EDTA necesaria para la separación de las células entre tipos de células de cáncer de mama diferentes varían mientras que una concentración inadecuada puede afectar el patrón de expresión de algunos marcadores de superficie celular como CD44 y CD2432.</li>
	<li>La cultura los platos por 5 min a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire. Comprobar con frecuencia el desprendimiento de las células bajo el microscopio para evitar que las células del exceso de digestión con tripsina-EDTA.</li>
	<li>Cuando más del 90% células separarla, añadir 5 mL de Medio RPMI completo en el plato y pipeta sobre la superficie de la capa de celular varias veces.</li>
	<li>Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 300 x g y 4 ° C durante 5 minutos. Nota: Generalmente, alrededor de 6 x 106 células pueden obtenerse de un plato de 100 mm, cuando la confluencia alcanza el 70%.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender las pelotillas en 106 células/100 μL de tampón FACS (PBS con 0,5% BSA y 0.1% de azida sódica) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Las células se dividen en varios tubos. Para las células MCF-7, se dividen las células en 4 tubos: isotipo dos controles, uno para CD24 solo manchas como control positivo CD24 y uno para la doble tinción.</li>
	<li>Para las células T47D, dividir las células en 3 tubos: dos controles de isotipo y uno para la doble tinción.</li>
	<li>Para las células MDA-MB-231, dividir las células en 4 tubos: isotipo dos controles, uno para CD44 solo manchas como control positivo de CD44 y uno para la doble tinción.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 300 x g y 4 ° C por 5 min deseche el sobrenadante y luego añadir bloque Fc diluido 1:50 en tampón FACS.</li>
	<li>Incubar las muestras en hielo por 20 min en la oscuridad antes de la centrifugación a 300 x g y 4 ° C por 5 min descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir conjugado con fluorocromo anticuerpos monoclonal contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE) en diluciones de 1:40 y 1:10 (en tampón FACS) en la doble tinción grupos. Para los controles positivos, añadir CD44 (PerCP-Cy5.5) a MDA-MB-231 y CD24 (PE) las células MCF-7 en la misma concentración, respectivamente. Nota: La combinación de CD44 y C24 se ha utilizado comúnmente en el pecho CSC estudio26,27,28,29,30.</li>
	<li>Para los grupos de control de isotipo, añadir PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ en un 1:40 dilución como control de isotipo de anticuerpos de CD44 y PE IgG2a de ratón, κ en un 1:10 dilución como control de isotipo de anticuerpos CD24 en 106 células/100 μL. Nota: Isotipo de anticuerpos de interés se recomienda utilizar como controles negativos33.</li>
	<li>Incubar las muestras (de pasos 1.12 y 1.13) a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos centrifugar a 300 x g y 4 ° C por 5 min descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar el pellet dos veces con 500 μL de PBS y centrifugar a 300 x g y 4 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 0,5 mL de PBS y el filtro a través de una malla de nylon de 40 μm antes de ejecutar en un clasificador de células activado por fluorescencia.</li>
	<li>Fines de control y compensación, mancha las células MCF-7 con los anticuerpos anti-CD24 conjugado con PE y mancha las células MDA-MB-231 con anticuerpos anti-CD44 conjugado con PerCP-Cy5.5 como controles positivos. Uso de células teñidas con isotipo controles como controles negativos (figura 1).</li>
	<li>Recoger las células con CD44–/CD24+ marcadores en tubos fondo redondo poliestireno 12 x 75 mm con 1 mL de medio de colección (sin rojo de fenol RPMI 1640 suplementado con 20% inactivado con calor FBS y 2% v/v PS). Centrifugar los tubos a 300 x g y RT por 5 min y descarte el sobrenadante. Nota: CSC-como las células en células de cáncer de mama se definición como CD44+/CD24– células26,27,28,29,30y no tallo las células de cáncer de mama se definen como CD44–/CD24+ células18 (figura 1).</li>
	<li>Las células de vástago no cáncer de mama ordenados en la placa de cultivo que contiene medio de colección fresca para seguir cultivándolos a 37 ° C en incubadora cultura 5% CO2 célula de la placa.</li>
</ol>2. apoptosis inducción y detección
<ol><li>Preparar 1 mM estaurosporina12,34 en DMSO. Para el grupo tratado de MCF-7, añadir 25 μL de estaurosporina de 1 mM al medio terminado de células MCF-7 hacer hasta 10 mL de volumen final (2,5 μM staurosporina) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las células, las células con 2 mL de PBS la colada una vez. Luego añadir 10 mL de medio con 2,5 μM estaurosporina células MCF-7 de 6 h inducir apoptosis, cuando la densidad celular llega a confluencia de 70%.</li>
	<li>Preparar 1 mM paclitaxel35,36 en DMSO. Para el grupo tratado de T47D, añadir 12,5 μL de paclitaxel de 1 mM al medio terminado de T47D células que conforman a un volumen final de 10 mL (5 μM paclitaxel) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las células y lavar una vez las células con 2 mL de PBS. Luego añadir 10 mL de medio con 5 μM paclitaxel a las células de T47D para 10 h inducir apoptosis, cuando la densidad celular llega a confluencia de 70%. Nota: El tiempo de inducción y la concentración de los inductores que inducen la apoptosis deben optimizarse cada vez que una nueva línea celular se utiliza por primera vez.</li>
	<li>Para el grupo de MCF-7 Tratado de solvente, añadir 25 μL de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) al medio completo de las células MCF-7 para hacer hasta un volumen final de 10 mL (es decir, 0.25% v/v DMSO) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las células de MCF-7 tratadas solvente, lavar una vez con 2 mL de PBS. Luego añadir 10 mL de medio con 0.25% v/v DMSO durante 6 h como el control de solvente para STS.</li>
	<li>Para el grupo de T47D tratados con solvente, añadir 5 μL de DMSO estéril al medio terminado de T47D células que conforman a volumen final de 10 mL (es decir, 0.05% v/v DMSO) en un tubo cónico de 15 mL. Pipeta para mezclar uniformemente el contenido.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de las células tratadas solvente de T47D, lavar una vez con 2 mL de PBS. Luego, añada los 10 mL de medio con 0.05% v/v DMSO para 10 h como el control de solvente para paclitaxel.</li>
	<li>Observar los cambios morfológicos de las células tratadas, teñir células con 50 nM Mitotracker Red CMXRos y 250 ng/mL Hoechst 33342 e incubar durante otros 20 minutos a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire. Observar la morfología de la célula apoptótica típicas bajo un 60 x láser confocal de barrido microscopio (figura 2). Nota: Morfología de la apoptosis típico incluye blebbing de membrana, contracción celular y condensación nuclear, fragmentación de las mitocondrias con la membrana celular intacta12,13,14,15 ,18,37.</li>
</ol>3. aislamiento de células apoptóticas y procedimiento de revocación de Apoptosis
<ol><li>Mancha tanto la apoptosis inductor solventes tratados y MCF-7 o T47D celdas con tinte verde detección de caspasa-3/7 de 3 μM en la concentración celular de 106/ml en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire.</li>
	<li>Filtro de las células a través de una malla de nylon de 40 μm antes de ejecutar en el clasificador para ordenar.</li>
	<li>Para fines de sincronización, primero la población principal (R1) de la puerta y excluir los desechos trazando el gráfico de puntos con dispersión hacia delante y dispersión lateral (figura 3).</li>
	<li>Utilice las células no tratadas sin añadir el colorante verde de caspasa-3/7 detección como un control negativo para la región negativa (R2) de la puerta (Figura 3A).</li>
	<li>Utilice las células tratadas con staurosporina12,18,34 por 24 h y teñidas con el tinte como control positivo para la región positiva (R3) la puerta (figura 3B).</li>
	<li>Recoger las células positivas (R3) de los grupos tratados con inductor de tubos fondo redondo poliestireno 12 x 75 mm con 1 mL de medio de colección (igual que el medio de colección en paso 1.18) (figuras 3C-3D). Centrifugar los tubos a 300 x g y RT por 5 min y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Recoger las células negativas (R2) de los grupos tratados con solvente en tubos de poliestireno fondo redondo 12 × 75 mm con 1 mL de medio de colección como en el paso 3.6 (figuras 3E-3F). Nota: Una pequeña porción de células (como las 10.000 células) puede ser recopilada y vuelva a ejecutar en el clasificador para verificar el patrón del marcador activa caspasas. Si sobre el 90% de células tratadas con solvente ordenadas se muestran en la región de caspasa-negativo o más 90% de células tratadas con inductor seleccionadas se muestran en la región de caspasa-positivo, estas células colectadas se creen para ser relativamente puro (figuras 3C-3F). De lo contrario, debe restablecerse la región clasificación o clasificador.</li>
	<li>Resuspender las células ordenadas en medio de la colección fresca y semilla les en placas de cultivo de tejidos de 12 pozos y cultivo a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% CO295% aire durante 7 días para la reversión de la apoptosis.</li>
</ol>4. confirmación de la Apoptosis en caspasa activa las células
<ol><li>Mezcla 10 mM HEPES, 140 mM NaCl y CaCl2 de 2,5 mM para preparar el enlace de anexina tampón (pH 7.4). Almacenar el buffer a 4 ° C y evitar el buffer para exponer a la luz.</li>
	<li>Prepare una solución de trabajo de 100 μg/mL de yoduro de propidio (PI) por dilución 5 μl de 1 mg/mL solución en 45 μl de tampón de annexin-enlace PI. La solución a 4 ° C y evitar que la solución para exponer a la luz. Nota: PI es un mutágeno potencial y debe ser manejado con cuidado.</li>
	<li>Preparar las células tratadas con inductor como en los pasos 2.1 y 2.5.</li>
	<li>Recoger el tratamiento inductor de la MCF-7 o T47D células mediante pipeteo el medio sobre la capa de células de 3-5 veces para separar las células. Transferir las células a un tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g y RT por 5 min, descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células con medio completo en la concentración celular de 106/ml en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mancha las células 3 μM caspasas 3/7 detección de verde medio de contraste en la oscuridad durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g y RT para 5 min descartar los sobrenadantes.</li>
	<li>Lavar las células con 1 mL de PBS y centrifugar a 300 x g de helado y 4 ° C por 5 min descartar los sobrenadantes.</li>
	<li>Resuspender las células en 100 μL de tampón de Unión anexina con el añadir 5 μL del conjugado anexina V y 1 μl de 100 μg/mL PI trabajo solución cada 100 μL de suspensión celular e incubar las células durante 15 min a temperatura ambiente. Nota: Anexina V y PI se utilizan juntos para etiquetar las células apoptotic en el flujo cytometry38,39,40.</li>
	<li>Añadir 400 μL de tampón de Unión anexina, mezcla suavemente. Mantener las muestras en hielo antes de ejecutar en un citómetro de flujo.</li>
</ol>5. medición de mama CSC-como las células mediante citometría de flujo
<ol><li>Cosecha el MCF-7 invertida en ambos grupos tratados con inductor o solvente con 0.05% tripsina-EDTA. Cosecha de células T47D en ambos grupos tratados con inductor o solvente o con 0.25% tripsina-EDTA como en los pasos 1.2 a 1.5.</li>
	<li>Teñir las células con los anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 humano (PerCP-Cy5.5) y CD24 (PE) como en el paso 1.12. Mientras tanto, preparar los controles de isotipo en los pasos 1.13.</li>
	<li>Las células en un citómetro de flujo y detectar el porcentaje de células con CD44+/CD24– marcadores.</li>
</ol>

<ol><li>McGuire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Cancer+Report+2014.+Geneva%2C+Switzerland%3A+World+Health+Organization%2C+International+Agency+for+Research+on+Cancer%2C+WHO+Press%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015.</a> Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).</li>
<li>Slamon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chemotherapy+plus+a+monoclonal+antibody+against+HER2+for+metastatic+breast+cancer+that+overexpresses+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2.</a> New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).</li>
<li>Geyer, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lapatinib+plus+capecitabine+for+HER2-positive+advanced+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).</li>
<li>Cameron, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+III+randomized+comparison+of+lapatinib+plus+capecitabine+versus+capecitabine+alone+in+women+with+advanced+breast+cancer+that+has+progressedon+trastuzumab%3A+updatedefficacy+andbiomarker+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).</li>
<li>Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topoisomerase+poisons+as+antitumor+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs.</a> Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).</li>
<li>Hertel, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+antitumor+activity+of+gemcitabine+%282%27%2C2%27-difluoro-2%27-deoxycytidine%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine).</a> Cancer Research. 50 (14), 4417-4422 (1990).</li>
<li>Ni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NF-kappa+B%29+in+multiple+myeloma%3A+downregulation+of+NF-kappa+B+induces+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis.</a> British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).</li>
<li>Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bortezomib%3A+proteasome+inhibition+as+an+effective+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy.</a> Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Pirozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+cancer+stem+cells%2C+epithelial-mesenchymal+transition+and+circulating+tumor+cells+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer.</a> Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).</li>
<li>Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Reversibility of apoptosis in cancer cells.</a> British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Tang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+survival%2C+DNA+damage%2C+and+oncogenic+transformation+after+a+transient+and+reversible+apoptotic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).</li>
<li>Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genistein+promotes+cell+death+of+ethanol-stressed+HeLa+cells+through+the+continuation+of+apoptosis+or+secondary+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis.</a> Cancer Cell International. 13 (1), 63(2013).</li>
<li>Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepG2+cells+recovered+from+apoptosis+show+altered+drug+responses+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+%26+Pancreatic+Diseases+International%22%5BJournal%5D)">HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness.</a> Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CaspaseTracker+biosensor+system+for+detecting+anastasis+and+non-apoptotic+caspase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity.</a> Scientific Reports. 5, 9015(2015).</li>
<li>Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tracking+anastasis%2C+a+cell+survival+phenomenon+that+reverses+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+reversal+promotes+cancer+stem+cell-like+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation.</a> Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).</li>
<li>Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+anastasis+in+vivo+by+CaspaseTracker+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li>
<li>Li, J., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+apoptosis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Caspases in apoptosis and beyond.</a> Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).</li>
<li>Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+point+of+no+return%3A+mitochondria%2C+caspases%2C+and+the+commitment+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).</li>
<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Research. 63 (18), 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ricci-Vitiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+human+colon-cancer-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells.</a> Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).</li>
<li>O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+colon+cancer+cell+capable+of+initiating+tumour+growth+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice.</a> Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).</li>
<li>Cioffi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+distinct+population+of+CD133%28%2B%29+CXCR4%28%2B%29+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Scientific Reports. 5, 10357(2015).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+stem+cells+transition+between+epithelial+and+mesenchymal+states+reflective+of+their+normal+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).</li>
<li>Sheridan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44%2B%2FCD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties%3A+an+early+step+necessary+for+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (5), R59(2006).</li>
<li>Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+CD24%28-%2Flow%29%2FCD44%2B+breast+cancer-initiating+cells+to+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).</li>
<li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+phenol+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of phenol red.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Different+Cell-Detaching+Methods+on+the+Viability+and+Cell+Surface+Antigen+Expression+of+Synovial+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staurosporine+induces+apoptosis+through+both+caspase-dependent+and+caspase-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms.</a> Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).</li>
<li>Saunders, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+in+MCF-7+breast-cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells.</a> International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).</li>
<li>Miller, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-induced+apoptosis+is+BAK-dependent%2C+but+BAX+and+BIM-independent+in+breast+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor.</a> PLoS One. 8 (4), e60685(2013).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).</li>
<li>Ng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+voltage-gated+potassium+channels+in+the+fate+determination+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).</li>
<li>Lo, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV3+channel+negatively+regulates+cell+cycle+progression+and+safeguards+the+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).</li>
<li>Talanian, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+caspase+family+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of caspase family proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activity+defines+colon+cancer+stem+cells+and+is+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Desiderio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fucosylation+has+a+pivotal+role+in+invasive+and+metastatic+properties+of+head+and+neck+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells.</a> Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).</li>
<li>Gupta, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+State+Transitions+Give+Rise+to+Phenotypic+Equilibrium+in+Populations+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells.</a> Cell. 146 (4), 633-644 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe una manera directa y clara para la detección de la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama CSC-como las células como resultado de la revocación de la apoptosis. Confirmación de las propiedades de la CSC de estas células invertidas podría ser asistido usando n vitro mammosphere formación ensayo y en vivo xenograft trasplante en ratones inmunodeficientes18,24,26 ,<...

Cáncer ha sido la principal causa de muerte, haciendo que la pesada carga a los países a nivel mundial1. El cáncer de mama es alta tanto en términos de incidencia y mortalidad en pacientes femeninos entre todos los tipos de cáncer1. Debido a la heterogeneidad del cáncer, una combinación de fármacos se utiliza generalmente en la quimioterapia para lograr cáncer célula muerte2,3,4. Sin embargo, puesto que los medicamentos quimioterapéuticos comunes a menudo destino ADN5,6, proteína síntesis7,8 o microtúbulos dinámica9, las células de rápido crecimiento son afectados la mayoría mientras que células quiescentes como cáncer células madre (CSC) s son generalmente menos afectados10. CSCs son, por lo tanto, más posibilidades de sobrevivir después del tratamiento, que más adelante conduce a resistencia a los medicamentos y el cáncer recidiva10,11. Por lo tanto, eliminación del CSC se ha convertido en un tema importante para el tratamiento del cáncer y estudio del origen de las CMC es necesario.
Se han realizado más estudios sobre el fenómeno de la reversión de la apoptosis en la última década12,13,14,15,16,17,18 , 19. antes de la aparición de este concepto, ha sido ampliamente aceptado que las células irreversiblemente sufrirá apoptosis después de la activación de caspasas. Caspasas son una familia de enzimas de proteína que desempeñan papeles claves en las etapas de iniciación y ejecución de la apoptosis, incluyendo la formación de la apoptosis complejas y la división de downstream sustratos20. Activación de las caspasas verdugo como caspasa 7 caspasa 3 ha sido considerada como el "punto de no retorno" para apoptosis21. Sin embargo, los investigadores observaron recientemente que apoptosis revocación ocurre in vitro y en vivo, en que las células pueden recuperar de apoptosis incluso después de la activación de caspasa12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. por otra parte, de características agresivas tales como mayor resistencia a la original inductor de apoptosis y mayor invasividad se detectan en el cáncer invertido células15. Por lo tanto, se propuso que el porcentaje de CSC-como las células sería mayor en la población invertida en comparación con las células sin tratar, eventualmente contribuir a las características más malas después de apoptosis revocación18.
Anteriormente, muchos esfuerzos se hicieron un seguimiento de la inversión de apoptosis in vitro y lo más importante, en vivo, que de gran ayuda para confirmar la universalidad de este proceso16,17,19. Sin embargo, carece de un estudio sistémico sobre las consecuencias de las células invertidas debido al aislamiento insuficiente de las células que han sufrido realmente apoptosis revocación. Hay que adquirir las células apoptotic puro y recuperarlos para un estudio más profundo. Por lo tanto, utilizamos el marcador bien aceptado tradicionalmente de la activación de caspasas verdugo como el marcador del "punto de no retorno"21 para apoptosis y utilizar celular activado por fluorescencia (FACS) para discriminar caspase-activado Células teñidas de clasificación con colorante verde detección de caspasa-3/7. El tinte es covalente a una secuencia corta de aminoácidos, DEVD, que puede ser reconocido y hendida por activa caspasas 3/7. El escote ayuda a liberar el tinte, que se translocan desde el citosol al núcleo donde se une al ADN y emite fluorescencia fuerte. Este procedimiento evita el uso de una población de células a granel en la que algunas células pueden no han experimentado apoptosis.
CSC o células iniciadoras del tumor se han identificado en muchos tumores sólidos con una sola o una combinación de varios marcador superficial y muy pocos números de estas células son suficientes para los tumores en ratones inmunodeficientes,22,23, forma 24,25,26,27. Una combinación de CD44 y CD24 se ha utilizado comúnmente en estudios de mama CSC y CD44+/CD24– las células han sido definidas como la mama CSC26,27,28,29 , 30. recientemente, hemos realizado una serie de experimentos para confirmar la relación propuesta entre la revocación de la apoptosis y las CMC y demostrar que las células de cáncer de mama invertida ganaron mayor capacidad de formación de tumor in vitro e in vivo con un elevado porcentaje de células con marcadores de CSC18. Aunque no podríamos excluir la posibilidad de que mama CSCs sobreviven mejores y así conseguirán enriquecidos después de la revocación de la apoptosis, cuando aislamos las células cancerosas no madre y sujeto a revocación del apoptosis, CSC surgirá en el originalmente no-vástago de población de células de cáncer, lo que sugiere que no tallo cáncer de las células pueden contribuir al aumento en el porcentaje de CSC durante apoptosis revocación.
Este artículo pretende demostrar la transición de las células de cáncer no madre mama a Mama CSC-como las células después de la revocación de la apoptosis y detectar esta transición mediante citometría de flujo. Las células de vástago no cáncer de mama se preparan inicialmente aislando CD44–/CD24+ de mama las células cancerosas por FACS. Entonces, apoptosis es inducida y confirmado por cambios morfológicos bajo el microscopio. Luego, las células apoptotic positivamente marcado por el tinte verde detección de caspasas 3/7 son aisladas por FACS y más cultivadas en ausencia de inductores de apoptosis apoptosis inversión. Las células invertidas luego se tiñen con marcadores de CSC después de 7 días de recuperación para el análisis cytometric del flujo. Células con CD44+/CD24– marcadores vuelve a aparecerán en la población invertida, sugiriendo que la transición de las células cancerosas no madre a CSC-como las células ha sufrido durante apoptosis revocación.
Revocación de apoptosis se ha observado en el cáncer de varias líneas celulares como las células normales de primaria tratados con estímulos apoptóticos diferentes en vitro12,13. Este proceso también ha sido trazado en Drosophila en vivo16,17,19del modelo. Toda la información sobre el mecanismo subyacente de la recaída del cáncer en modelos de enfermedad de cáncer diferentes y el origen de las CMC puede obtenerse mediante el uso de la técnica como se describe en este manuscrito.

<table><tbody><tr><td>MCF-7 Colección de</td><td>Cultivos Tipo Americanos (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>Colección de Cultivos Tipo Americanos (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Reactivo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.05% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 anexina V conjugada</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspasa-3/7 colorante fluorescente verde</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fc block</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td> HEPES <td>inactivado por calor</td></tr><tr><td>USB</td><td></td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpos monoclonales contra CD24</td><td>humano BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE Clone:ML5 Lote:5049759 RRID:AB_395822</td></tr> anticuerpos <tr><td>monoclonales contra CD44</td><td>humano BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Clon:G44-26 Lote:7230770 RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón IgG2a, &kappa; Control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>clon:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 Ratón IgG2b, &kappa; Control de isotipos</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clon: 27-35 RRID:AB_647257</td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>yoduro de propidio</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medio</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>fénol azida sódica</td> sin rojo <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>estaurosporina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>plato de cultivo Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr> placas <tr><td>de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &mu; m malla de nylon</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de software FACSuite v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal FluoView FV1000 Olympus</td><td></td><td>IX81</td><td>60X objetivo</td></tr><tr><td>FV10-ASW Software de visualización Ver.4.2b</td><td>Olympus-poliestireno</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de fondo redondo 12 y tiempos; Tubos de 75 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador S3e</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

detección del flujo cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la apoptosis

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

La recurrencia del cáncer durante mucho tiempo ha sido estudiada por oncólogos mientras que los mecanismos subyacentes siguen siendo confusos. Recientemente, nosotros y otros encontraron que un fenómeno llamado inversión de apoptosis conduce a mayor colonización en varios modelos de celular bajo diferentes estímulos. Estudios previos se han centrado en el seguimiento de este proceso in vitro e in vivo; sin embargo, el aislamiento de células real invertidas tiene todavía ser alcanzado, que limita nuestro entendimiento sobre las consecuencias de la revocación de la apoptosis. Aquí, aprovechamos un tinte verde detección de caspasa-3/7 a las células de etiqueta con caspasas activadas después de la inducción de apoptosis. Células con señales positivas se clasifican más lejos hacia fuera por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para la recuperación. Examen bajo microscopia confocal ayuda a confirmar el estado de apoptosis antes de FACS. Un aumento en la colonización se puede atribuir a menudo a la elevación en el porcentaje de células madre de cáncer (CSC)-como las células. Además, dada la heterogeneidad del cáncer de mama, identificando el origen de estas células de CSC-como sería fundamental para el tratamiento del cáncer. Así, preparamos las células de cáncer no madre mama antes de accionar apoptosis, aislar células caspasa activa y realizar el procedimiento de revocación de la apoptosis. Análisis de citometría de flujo revela que mama CSC-como las células vuelve a aparecerán en el grupo inverso, indicando mama CSC-como las células se transitó de las células de cáncer no madre mama durante apoptosis revocación. En Resumen, este protocolo incluye el aislamiento de apoptotic células de cáncer de mama y la detección de cambios en porcentaje de CSC en células invertidas por citometría de flujo.

Para observar la transición del pecho no tallo las células cancerosas de mama CSC-como las células, una primera clasificación de CD44–/CD24+ se necesitan las células de cáncer de mama. Para la línea de células MCF-7, que alrededor del 0.15% células con marcadores de CSC en la población original (figura 1), este paso contribuyó a excluir la posibilidad de enriquecimiento del CSC durante apoptosis revocación. Por el contrario, si hay no ha...

Aquí, presentamos un protocolo para aislar células de cáncer de mama apoptóticas clasificación celular activado por fluorescencia y más detectar la transición no potencia el cáncer de células de mama a Mama cáncer células madre células después de la revocación de la apoptosis por citometría de flujo.

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Los aislamientos de poblaciones genuinas de células de inversión apoptóticas han sido un problema anteriormente, lo que limita en gran medida nuestra comprensión sobre las consecuencias de la reversión de la apoptosis. Este protocolo nos permite generar poblaciones más puras de células de inversión apoptóticas. La principal ventaja de esta técnica es que los materiales y equipos utilizados están ampliamente disponibles en diferentes instituciones.Esta técnica es fácilmente aplicable para aislar a una población más pura de células que han sufrido la reversión de la apoptosis. Como se informó anteriormente, las células normales también pueden pasar a ser reescrones de apoptosis, que aparte de las células de cáncer de mama, diferentes células quimio, así como las células normales, se pueden iniciar y los diversos estímulos apoptóticos se pueden utilizar. Debido a que la célula de reversión ha pasado por la apoptosis y la clasificación rápida, la tasa de recuperación suele ser baja.Un número de celda inicial más grande es recombinante para aumentar el rendimiento final. Para empezar, haga referencia a las celdas MCF-7, MDA-MB-231, Para comenzar, haga referencia a la cultura MCF-7, MDA-MB-231 y T47D, según el protocolo de texto. Después de esto, lavar las células con PBS dos veces, luego añadir dos mililitros de 0.05 por ciento de trippsina-EDTA de 0.05 por ciento de trippsina-EDTA al MCF-7, y células MDA-MB-231, a las células MCF-7 y MDA-MB-231, y dos mililitros de 0.25 por ciento de trippsina-EDTA y dos mililitros de 0.25 por ciento trypsin-EDTA a las células T47D.a las células T47D. Cultivo de las células durante cinco minutos a 37 grados Celsius, en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono cinco por ciento. Mientras las células incuban, compruebe el desprendimiento de las células con un microscopio para prevenir la sobre-digestión por la trippsina-EDTA.Cuando más del 90 por ciento de las células se separan, agregue cinco mililitros de medio RPMI completado al plato y pipetearlo sobre la superficie de la capa celular varias veces. Luego, transfiera las células a tubos cónicos de 15 mililitros y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets con tampón FACS en tubos de micro centrífuga de 1,5 mililitros.Luego, divida las células en varios tubos. Centrifugar los tubos una vez más, y desechar el sobrenadante. A continuación, agregue el bloque Fc diluido a las muestras.Incubar las muestras sobre hielo en la oscuridad durante 20 minutos, antes de centrifugar las muestras de nuevo. Después de esto, deseche el sobrenadante. A continuación, añada anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 humano, y CD24, contra CD44 humanos, y CD24, en uno a 40, y de uno a 10 diluciones, respectivamente, a los grupos de doble tinción.Para los controles positivos, agregue anticuerpos CD44 Para los controles positivos, agregue anticuerpos CD44 a las células MDA-MB-231, a las células MDA-MB-231, y anticuerpos CD24 a las células MCF-7 y anticuerpos CD24 a las células MCF-7 en una a 40, y a una a 10 diluciones, respectivamente. Añadir PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Añadir PerCP-Cy5.5 Ratón IgG2b Kappa, diluido en una proporción de uno a 40 a las células como un control de isótopos para anticuerpos CD44. Luego, agregue PE Mouse IgG2a Kappa, Then, agregue PE Mouse IgG2a Kappa, diluido en una proporción de uno a 10 a las células como control de isótopos para anticuerpos CD24.Incubar las muestras a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante 30 minutos. Luego, centrifugar las muestras a 300 g's Then, centrifugar las muestras a 300 g y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces en 500 micro litros de PBS.A continuación, repita la centrifugación como se describió anteriormente. Vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de PBS y filtre la suspensión a través de una malla de nylon de 40 micrómetros. A continuación, ejecute la suspensión a través de un clasificador de células activado por fluorescencia.Recoger las células con CD44 negativo, y marcadores positivos CD24 en tubos de fondo redondo que contienen un mililitro de medio de recolección. Luego, centrifuga los tubos, y deseche el sobrenadante. A continuación, plancha las células cancerosas de mama no madre ordenadas en un plato de cultivo que contenga un medio de recolección fresco para un mayor cultivo.En primer lugar, utilizar una estaurosporina milimolar en DMSO, Para preparar 2,5 micromolares estaurosporina en medio, de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, elimine el medio de cultivo de las celdas. Lavar las células con dos mililitros de PBS una vez, después de esto, añadir 10 mililitros del medio de estaurosporina a las células MSF-7 durante seis horas, para inducir apoptosis, cuando las células son 70 por ciento confluentes.A continuación, prepare un paclitaxel mililar en DMSO. Luego, agregue 12,5 micro litros Luego, agregue 12,5 micro litros del paclitaxel 1 milimolar al medio completo de las células T47D para hacer un volumen final de 10 mililitros en un tubo cónico de 15 mililitros. Retire el medio de cultivo de las células y lave las células con 2 mililitros de PBS.Luego, agrega el medio paclitaxel a las células durante 10 horas para inducir apoptosis durante 10 horas para inducir apoptosis cuando las células alcanzan el 70 por ciento de confluencia. Después de esto, retire el medio del grupo MCF-7 tratado con disolvente y lávelos con dos mililitros de PBS. A continuación, añadir 10 mililitros de 0.25 por ciento dmSO medio Entonces, añadir 10 mililitros de 0.25 por ciento DMSO medio durante seis horas como el control de disolvente para estaurosporina.Retire el medio de cultivo del grupo T47D tratado con disolvente y lave las células con dos mililitros de PBS. A continuación, agregue 10 mililitros de 0,05 por ciento de medio DMSO Entonces, agregue 10 mililitros de 0,05 por ciento de DMSO medio durante 10 horas como control de disolvente para paclitaxel. A continuación, manchar la célula y incubarla durante 20 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del cinco por ciento.Utilice un microscopio de escaneo láser confocal 60 veces para observar los cambios morfológicos de las células tratadas. Mancha tanto el inductor apoptótico como las células MCF-7 y T47D tratadas con disolvente y las células MCF-7 y T47D tratadas con disolvente en la oscuridad durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del cinco por ciento. Usando el clasificador de células activado por fluorescencia, recoja las células positivas de los grupos tratados con el inductor en tubos inferiores redondos que contengan un mililitro de medio de recolección.A continuación, centrifugar los tubos como se describió anteriormente, y deseche el sobrenadante. Recoger las células negativas de los grupos tratados con disolvente en tubos de fondo redondo con un mililitro de medio de recolección. Centrifugar los tubos y desechar el sobrenadante.Después de esto, vuelva a suspender las celdas ordenadas en el medio de recolección fresco. Siembra las células en placas de cultivo de tejido de 12 pozos, y cultiva durante siete días para la reversión de la apoptosis. Cosecha el MCF-7 invertido en grupos inductores y tratados con disolvente con 0.05 por ciento de trippsina-EDTA.con 0.05 por ciento de trippsina-EDTA. Luego, cosechar las células T47D en ambos inductores Entonces, cosechar las células T47D en grupos inductores y tratados con disolvente con 0.25 por ciento de trippsina-EDTA. Manche las células con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo contra CD44 y CD24 humanos.Mientras las células se manchan, prepare los controles de isotipo como se ha demostrado anteriormente. Finalmente, ejecute las células en un citómetro de flujo y detecte el porcentaje de células con marcadores CD44 positivos y CD24 negativos. En este protocolo, se observó la transición de las células cancerosas mamarias no madre a las células similares a las CSC de mama.El aislamiento de las células cancerosas no madres se realizó por primera vez en células MCF-7. Se observaron cambios morfológicos típicos después de agregar inductores apoptóticos, y las células se recuperaron de la apoptosis con morfología similar después de la retirada del fármaco. Las células activadas por el caspace fueron etiquetadas y ordenadas en función de su intensidad de fluorescensa más alta que las células sin activación del caspace.Durante el proceso de inducción apoptótica, se utilizó solvente para excluir la posibilidad de que el procedimiento hecho, o el disolvente en sí, fuera la causa de la transición. Se encontró que las células activadas por Caspace en los grupos de tratamiento de inductores apoptóticos eran una nexina cinco positivas y PI negativas, lo que sugiere que eran células apoptóticas. Las células apoptóticas fueron recolectadas y cultivadas para su recuperación, en comparación con los grupos tratados con disolventes, el análisis citométrico de flujo mostró que había células que aparecían en el cuadrante positivo CD44 y CD24 negativo en la población de células cancerosas no madres invertidas originalmente.La medición es importante en el análisis de flujo y la clasificación celular, que se debe preparar un control suficiente en los laboratorios. Dado que este procedimiento de reversión de apoptosis in vitro aísla las células cancerosas apoptóticas puras, se pueden llevar a cabo experimentos como los activos de la tumorigenesis in vivo para comprender las consecuencias de revertir las células. Esta técnica arroja luz sobre la causa de la recaída del cáncer, por lo tanto, se puede investigar para prevenir potencialmente la reaparia en pacientes con cáncer.Recuerde protegerse adecuadamente al realizar experimentos de cultivo celular de acuerdo con las regulaciones de nivel de bioseguro en su institución.

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