Name: qKAT: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぼう qKAT法によるKIR遺伝子の定量的半自動化入力法。リアルタイムPCRとコピー数解析で、免疫遺伝学や集団遺伝学研究におけるNK細胞受容体遺伝学を効率的に解明できます。

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医療研究評議会 (MRC)、欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム (グラント契約号 695551) の下で欧州研究会議 (ERC)、国立衛生研究所 (NIH) ケンブリッジからの資金援助を受けたプロジェクト生物医学の研究センターと NIH 研究血液・移植研究ユニット (NIHR BTRU) 臓器提供とケンブリッジ大学の移植および NHS の血および移植 (NHSBT) とのパートナーシップ。見解では、これらの者とは必ずしもこれらの NHS、NIHR、保健省や、NHSBT。

1. 準備と DNA からめっき
<ol><li>吸光光度または蛍光器具を使用して gDNA 濃度を正確に測定します。</li>
	<li>DNA を深井戸 96 ウェル プレートの 4 ng/μ L に希釈します。知られているコピー数と少なくとも 1 つの gDNA サンプルおよび 1 つの非テンプレート コントロールが含まれます。</li>
	<li>2 分の 450 x gで 96 ウェルのプレートを遠心します。</li>
	<li>各ウェルに 10、qPCR 384 ウェル プレートに 4 連の各サンプルを調剤リキッドハンド リング装置を用いて DNA の ng (2.5 μ L/ウェル)。少なくとも 10 の 384 ウェル プレートを各 qKAT の反作用のための 1 つを準備します。</li>
	<li>GDNA は 1 つ以上の 96 ウェル プレートから調剤されて場合は、2% の漂白剤と純水 gDNA サンプルの各 96 ウェル プレート間のシステムの処理液の針をきれいにフル ボリューム洗浄を実行します。</li>
	<li>少なくとも 24 時間室温で清潔で 384 ウェル プレートの孵化によって DNA を風乾します。</li>
</ol>2. プライマーおよびプローブの準備
注: qKAT は 10 の多重反応で構成されています。各反応には、プライマーの 3 つのペアと 2 つのKIR遺伝子と 1 つの参照の遺伝子を増幅する具体的には 3 つの蛍光標識プローブが含まれています。江ら27に掲載されたプローブは、オリゴヌクレオチドが今付けられて ATTO 色素改善光安定性と長い信号の有効期間を提供するので、変更されました。前検体プライマーの組み合わせは、市販 (材料の表を参照してください)。
<ol><li>表1 希釈に従って各反作用のためのプライマー組み合わせを準備します。</li>
	<li>表 1に従って各反作用のためのプローブの組み合わせを準備します。組み合わせを行う前に各それぞれのプローブをテストします。</li>
</ol>3. マスター ミックスの準備
メモ下記のボリュームは、10 x 384 ウェル プレートのセットに qKAT 反応の 1 つを実行するため。
<ol><li>384 ウェル プレートにメッキ gDNA サンプルが完全に乾燥を確認します。氷の上のすべての手順を行い、蛍光標識プローブが写真と熱敏感なので可能な限り、光への暴露から覆われて試薬を維持します。</li>
	<li>QPCR バッファー、プライマーおよびプローブ 4 ° C で因数を解凍します。</li>
	<li>氷の上 18.86 mL 純水 20 mL、qPCR バッファー、作り置きのプライマー組み合わせの 1,000 μ L 作り置きプローブの組み合わせ (表 2) の 180 μ L を追加することによって 10 x 384 ウェル プレート用マスター ミックスを調製します。</li>
	<li>415 μ L を分注を各ウェルに、マルチ チャンネル ピペットを使用して深い 96 well プレートにマスター ミックスを均等に分散します。このプレートを光から覆われているアイス ボックスにしてください。</li>
	<li>液体処理機器を使用して、乾燥された gDNA を 384 ウェル プレートの各ウェルにマスター ミックスの 9.5 μ L を調剤します。箔押しの入ったプレートをシール、すぐに 4 ° C で液体処理システムの針が各プレートの間に水で洗っていることを確認、残りの板は、このプロセスを繰り返します。</li>
	<li>3 分の 450 x g で 384 ウェル プレートを遠心し、4 ° c 夜間、または 6-12 h に DNA を再懸濁します、空気の泡を放散する間、それらを孵化させなさい。</li>
</ol>4. qPCR 測定
<ol><li>一晩インキュベート後残り空気の泡を放散する 3 分の 450 × gで遠心分離機します。</li>
	<li>自動化のために、qPCR マシン (例えば、LightCycler 480) をマイクロ プレート ハンドラーに接続 (材料の表を参照してください)。プログラムは、光から保護冷却貯蔵ドックから qPCR マシンにプレートを配置するマイクロ プレート ハンドラー。 注 法、理論的で動作するはず他の qPCR のマシンに互換性のある光設定。</li>
	<li>次のサイクリング条件を使用: 95 ° C、5 分が 95 ° C の 40 のサイクルが続く 15 s の 66 ° C、50 秒、66 ° C でデータ収集を</li>
	<li>実行が完了したら、一度、qPCR マシンからプレートを収集し、破棄ドックのロボットを持っています。</li>
</ol>5. 実行後の分析
<ol><li>増幅後 qPCR マシンのソフトウェアで、2 番目の派生最大メソッドまたはフィット点メソッドを使用して定量化サイクル (Cq) 値を計算 (材料の表を参照)、以下の手順します。</li>
	<li>QPCR ソフトウェアを開き、1 つのプレートの保存された反応実験ファイルナビゲーターのタブで開きます。</li>
	<li>
2 番目の派生最大法を用いた解析、[分析] タブを選択し、Abs Quant/Second 誘導体 Max メソッドを使用して新しい分析を作成します。
	<ol>
<li>作成新しい解析] ウィンドウで、[解析タイプを選択: Abs Quant/Second 誘導体 Max メソッドサブセット:すべてのサンプルプログラム:増幅名前: Rx DFO ( xは反応数)。</li>
		<li>フィルター櫛とヴィック/六角/Yellow555 (533-580)を選択します。これにより、 STAT6で収集されたデータが選択されています。</li>
		<li>VIC/HEX/Yellow555(533-580)のカラー補正を選択します。計算をクリックします。ファム (465-510) と Cy5/Cy5.5(618-660) のため、この手順を繰り返します。ファイルを保存をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フィット点法を用いた解析、解析タブで Abs クオンツ/フィット点を選択します。
	<ol>
<li>作成新しい解析] ウィンドウで、[解析タイプを選択: Abs クオンツ/フィット点法サブセット:すべてのサンプルプログラム:増幅名前: RxF DFO ( xは反応数)。</li>
		<li>適切なフィルターとSTAT6と各KIR遺伝子 (ファム/cy5 の組合せ) のカラー補正を選択します。[ Noiseband ] タブでバック グラウンド ノイズを除外するノイズ ・ バンドを設定します。</li>
		<li>[分析] タブで、フィット点を3に設定し、ショーのフィット点を選択します。計算をクリックします。ファイルを保存をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 結果のエクスポート
<ol><li>QPCR ソフトウェアでナビゲーターを開きます結果バッチ書き出し」タブを選択します。</li>
	<li>実験ファイルが保存、ウィンドウの右側にあるセクションに、ファイルを転送するフォルダーを開きます。[次へ] をクリックします。名前とエクスポート ファイルの場所を選択します。</li>
	<li>Abs Quant/Second 誘導体 Max メソッドまたはAbs クオンツ/フィット点の解析タイプを選択します。[次へ] をクリックします。ファイル、エクスポート フォルダー、および解析のタイプの名前が正しいことと、次のエクスポート プロセスを開始するをクリックを確認します。</li>
	<li>エクスポートのステータス]が[ok]になるまで待ちます。画面は、次のステップに自動的に移動します。選択したすべてのファイルが正常にエクスポートされましたを確認して失敗したファイルの数 = 0。完了をクリックします。</li>
	<li>各プレートの個々 の反作用にエクスポートされた板を分割するのにスクリプト split_file.pl と roche2sds.pl を使用します。 注 スクリプトが要求/GitHub 上で提供されます。</li>
</ol>7. コピー数の計算
<ol><li>コピー数解析ソフトウェア (例えば、CopyCaller) を開きます。リアルタイム PCR の結果ファイルのインポートを選択し、 roche2sds.plで作成したテキスト ファイルをロードします。</li>
	<li>分析を選択し、いずれか選択する知られているコピー数と校正サンプルまたは最も頻繁にコピーの番号を選択して、分析を実施します。通常ヨーロッパ起源の集団で観察されたKIR遺伝子の最も頻繁なコピー数の表 5を参照してください。</li>
</ol>8. データの品質をチェックします。
<ol><li>R スクリプトKIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 を使用します。Rすべての板からコピー数データをスプレッドシートに結合します。 注 スクリプトが要求/GitHub 上で提供されます。</li>
	<li>KIR遺伝子 (表 6) 知られている連鎖不平衡 (LD) に準拠していないサンプルのコピー数解析ソフトウェア上の raw データを再確認します。</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li>
<li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+%2B+HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li>
<li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+%28HLA%29+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+%28KIR%29+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+%28KIR%29+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li>
<li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-4-44">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li>
<li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A%2A11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li>
<li>Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li>
<li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li>
<li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li>
<li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li>
<li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li>
<li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li>
<li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS1%2C+2DS5%2C+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li>
<li>Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li>
<li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li>
<li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+locus+polymorphisms%3A+genotyping+and+disease+association+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li>
<li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+%28KIR%29+gene+sequence+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li>
<li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202301912629">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li>
<li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection%3A+Evidence+for+discrete+immunological+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li>
<li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2DL1%2C+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qKAT%3A+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li>
</ol>

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KIR遺伝子.のコピー数の入力を容易にする qKAT と呼ばれる新規半自動化されたハイスループット法について述べるメソッドは、低スループットおよびこれらの非常に多型の遺伝子の有無を示すことができますのみ SSP PCR のような従来の方法と比べて改善。
得られた数値データをコピーの精度が品質と gDNA サンプルおよび試薬の品質の均一性の濃度を含む複数の要因に依存しています。品質とプレート間で gDNA サンプルの精度は、プレート間の濃度の変化は、コピー数の計算でエラーが発生するので非常に重要です。以来、法は、ヨーロッパ起源のサンプル セットを使用して検証された、世界の他の部分からのコホートからデータはより徹底的にチェックを必要です。これは、対立遺伝子ドロップ アウトまたは非特異的プライマー ・ プローブ バインディングのインスタンスが誤ってコピー数変異として解釈されないことを確保するためです。
法は、設計され、高スループットとして実行するために最適化された、間は、以下のサンプルを実行する変更できます。少ないサンプルを分析する際、コピー数解析ソフトウェアで信頼の指標が影響を受けるが、プレートに知られているKIR遺伝子コピー数と制御ゲノム DNA のサンプルが含まれ、その他のサンプルの複製がある場合、これは向上させることが含まれています。
液体/プレート-ハンドリング ロボットなし所マルチ チャンネル ピペットの使用のマスターの組合せを分配することができます、プレートは qPCR 測定器に手動で読み込むことができます。
QKAT の開発の後ろの主な目的は、メソッドを作成する単純な高スループット、高解像度、およびコスト効率の高い遺伝子KIRs病協会研究。QKAT は、感染症、自己免疫疾患、妊娠障害4,の範囲を含むいくつかの大きい疾患関連研究におけるキールの役割の調査に採用されているので、これは正常に達成されました。24,25,26。

人間、キラー免疫グロブリン様受容体の(キール)、白血球受容体複合体 (LRC) 内 19 番染色体の長腕に遺伝子座が割り当てられています。この軌跡は、長さ約 150 kb で 15 KIR遺伝子配置頭にテールが含まれています。現在知られているKIRの遺伝子座がKIR2DL1、 KIR2DL2/KIR2DL3、 KIR2DL4、 KIR2DL5A、 KIR2DL5B KIR2DS1 5、 KIR3DL1/KIR3DS1 KIR3DL2-32 つの的偽遺伝子、 KIR2DP1 、 KIR3DP1。KIR遺伝子は二次元 (2 D) のエンコードと短い (S; 活性化) と 3次元 (3 D) 免疫グロブリン様ドメイン受容体または長い (L; 抑制) 細胞質尾、ナチュラル キラー (NK) 細胞と T のサブセットで表されるセルです。コピー数変異キール軌跡フォーム内で変数遺伝子コンテンツ1多様なハプロタイプを展示しました。近くに頭-尾の遺伝子配列と高い相同によって促進される非対立遺伝子相同組換え (NAHR) は、haplotypic 変動を担当する提案メカニズムです。100 以上の異なるハプロタイプは、人口世界中1,2,3,4で報告されています。すべてのこれらのハプロタイプは、2 つの主要なグループに分けることができる: A と B のハプロタイプ。A ハプロタイプには 7 KIRの遺伝子が含まれています: KIR3DL3、 KIR2DL1、 KIR2DL3、 KIR2DL4、 KIR3DL1、 KIR3DL2、抑制のKIR遺伝子と活性化キール遺伝子KIR2DS4。ただしをキールのホモは、ヨーロッパ起源の人の 70% にハプロタイプは専ら運ぶKIR2DS45,6の非機能的な「削除」フォーム。すべての他のKIRの遺伝子の組み合わせを形成グループ B ハプロタイプ、特定のKIR遺伝子KIR2DS1の少なくとも 1 つを含むKIR2DS2、 KIR2DS3、 KIR2DS5、 KIR3DS1、 KIR2DL2、KIR2DL5と通常 2 つ以上の活性化KIR遺伝子が含まれます。
HLA のクラス I の分子特定抑制性受容体 (KIR2DL1、 KIR2DL2、 KIR2DL3とKIR3DL1) 活性化受容体 (KIR2DS1、 KIR2DS2、 KIR2DS4の配位子として識別されています。KIR2DS5、およびKIR3DS1)、 KIR2DL4は他の抑制のキールの受容器のような長い細胞質尾が含まれていますが、共通である細胞外ドメインに近い正荷電残基がありますユニークなキールとその他の活性化のキールの受容体の機能。KIR 遺伝子と HLA 遺伝子の変異の組み合わせは、その図形潜在的な NK 細胞応答性個々 レベル7、8時を受容体リガンド相互作用に影響します。遺伝的関連研究からの証拠はキールが (例えば.、ひと免疫不全ウイルス [HIV]9 C 型肝炎ウイルス [c 型肝炎]10) ウイルスの抵抗の役割を果たしていることを示しているの移植の成功11、妊娠障害と繁殖成功12,13、同種造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植)14,15後、再発に対する保護のリスク 16、および癌の17のリスク。
高配列相同性の対立遺伝子の組み合わせと haplotypic の多様性は、正確なジェノタイピングKIRの遺伝子の作業の課題を提示。KIR遺伝子を入力する従来の方法は、シーケンス特定のプライマー (SSP) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)18,19、20、シーケンス固有オリゴヌクレオチド プローブ (SSOP) PCR21とマトリックス支援レーザ脱イオン化-時間の飛行質量分析法 (MALDI-TOF MS)22。これらの手法の欠点は、一方、実行する骨の折れるだけ個人の遺伝子型に部分的な洞察力を提供すること。最近特にキール軌跡を入力する次世代シーケンサー (NGS) が適用されています。このメソッドは非常に強力なそれは、実行する高価なことができます、詳細な解析やデータのチェックを行う時間がかかる。
qKAT は、高スループットの定量的 PCR 法です。従来の方法は手間と時間のかかる、このメソッドは 5 日間で約 1,000 のゲノム DNA (gDNA) のサンプルを実行することが可能になり、 KIR遺伝子と同様の遺伝子コピー数を与えます。qKAT から成っているそれぞれの目標 2 つのキール座位 10 の多重反応と、 KIRの遺伝子の相対的な定量化のため使用されるゲノム (STAT6) の固定コピー数の 1 つの参照の遺伝子コピー数23。この試金は遺伝的提供し同様、人口パネルや 1 型糖尿病のような自己免疫疾患、c 型肝炎などの感染症、妊娠中毒症などの妊娠障害疾患コホート研究で正常に使用されていますNK ・細胞機能1,4,24,25,26を理解することを目的とした研究を支えます。

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Sigma</td><td>カスタムオーダー</td><td>配列: 表4に記載</td></tr><tr><td>ATTO色素でラベル付けされたプローブ</td><td>Sigma</td><td>カスタムオーダー</td><td>配列: 表3に記載</td></tr><tr><td>SensiFAST Probe No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-86020</td><td>&minus;</td></tr><tr><td>ミリクウォーター</td><td>&マイナス;</td><td>&マイナス;</td><td>&マイナス;</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター付き遠心分離機</td><td>Eppendorf(または同等品)</td><td>Eppendorf 5810Rまたは同等のシステム</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuBit Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>マトリックス Hydra</td><td>Thermo Scientific</td><td>109611</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 II Instrument 384-well</td><td>Roche</td><td>05015243001</td><td></td></tr><tr><td>Twister II Microplate Handler with M&eacute;クールサーマルプレートスタッカー(M&eacute;Cour)</td><td>キャリパーライフサイエンス</td><td>204135</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ミキサーBiosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>シングルチャンネルピペット(容量範囲:0.5&ndash;10 &micro;L、2&ndash;20 &micro;L、20&ndash;200 &micro;L、200&ndash;1,000 & マイクロ;L;1-10 mL)</td><td>Gilson(または同等品)</td><td>F144801、F123600、F123615、F123602、F161201</td><td></td></tr><tr><td>RNaseおよびDNaseフリーのピペットチップをろ過(10 &micro;L、20 &micro;L、200 &micro;L、1,000 &micro;L, 10 mL)</td><td>Starlab (または同等品)</td><td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td><td></td></tr><tr><td>StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tube</td><td>STARLAB</td><td>E1450-0200</td><td></td></tr><tr><td>96-well deep well plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>12194162</td><td></td></tr><tr><td>LC480 384 Multi-well plates</td><td>Roche</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480シーリングホイル</td><td>ロシュ</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler480ソフトウェアv1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td></tr><tr><td>KIR ハプロタイプ識別子</td><td></td><td></td><td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td></tr></tbody></table>

qkat: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

キラー細胞免疫グロブリン様受容体 (KIRs)、ナチュラル キラー (NK) と 19 番染色体上の遺伝子の多形クラスターによって符号化される T 細胞の抑制、活性化の免疫受容体のセットです。最も特徴付けられるリガンドは染色体 6 の主要な組織適合性の複雑な (MHC) 軌跡内にエンコードされている人間の白血球の抗原 (HLA) 分子。免疫・再生・移植、遺伝子型を正確にできる技術を持っている重要なことで重要な役割を果たしているという相当な証拠があるそれら。ただし、高配列相同性と同様、対立およびコピー数変化を難しく正確にすることができます設計手法と効率的に遺伝子型すべてKIRの遺伝子。従来の方法は、得られたデータの解像度、スループット、費用対効果、およびセットアップと実験の実行に要する時間通常制限されます。定量的なキール半自動入力 (qKAT) と呼ばれる手法について述べるキール軌跡のすべての遺伝子の遺伝子のコピー数を決定することができます高速多重リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応法であります。qKAT は、データを提供できる高解像度キールコピー数、それらを包含構造多型のハプロタイプの変化を推論するさらに使用できる単純な高スループット方法です。このコピーの数とハプロタイプのデータを式とキールとHLAとの間の機能的相互作用に関する調査と同様に大規模病協会、集団遺伝学の研究のために有益にすることができます。

定量のキラー細胞免疫グロブリン様受容体 (KIR) 半自動入力 (qKAT) は、人口と病気の関連研究での応用数型KIRの遺伝子をコピーする簡単な高スループット、およびコスト効率の高い方法です。

qKAT: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

この方法は、ハプロタイプの多様性やこれが病気にどのように関連しているのかといったNK細胞受容体遺伝学に関する重要な質問に答えることができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、自動化プロセスやデータ分析を含む、研究室でプロトコルを設定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の方法とは異なり、定量的KIR自動タイピングの略であるqKATは高スループットであり、遺伝子コピー数を提供することです。qKATは疾患関連に関する洞察を提供することができる。この技術の意味合いは、HIVやC型肝炎などのウイルス感染、癌、幹細胞移植、および妊娠障害の治療に有用であり得る。qKATは、集団遺伝学の研究や、KIRとHLA分子間の発現および機能的相互作用の探索にも適用できます。qKATは、2つのKIR遺伝子と1つの参照遺伝子のエキソンを特異的に標的とする10の多重反応からなる。このプロトコルでは、特定のプライマーは、与えられた遺伝子の対立遺伝子を検出するように設計されており、PCRは短いアンプリコンで結果を得る。この後、デュアル標識された特異的加水分解プローブを使用して、リアルタイムでPCR増幅を監視します。コピー数解析は、標的KIR遺伝子を基準遺伝子に対して相対的に定量することを用いた。qKAT は、ハイスループット技術として設計およびセットアップされています。したがって、各反応は1,000サンプルの下で行うことができます。以下のステップは、各96ウェルDNAプレートの調製およびめっきに関与するステップを示す。まず、DNAを定量化した後、DNAを96ウェル深層プレートで希釈します。既知のコピー番号とテンプレート以外のコントロールを 1 つ含むコントロール サンプルを少なくとも 1 つ含めます。プレートを450 gsで2分間遠心分離します。次に、各サンプルを4倍にして384ウェルqPCRプレートに分配します。この後、室温でクリーンな場所で24時間空気乾燥したDNA。10個の384ウェルプレートに対して1つのqKAT反応を設定するには、まず、qPCRバッファー、プライマー、プローブアリコートを摂氏4度で解凍します。テキストプロトコルに従って氷の上にマスターミックスを準備します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルのディープウェルプレートにマスターミックスを均等に分配します。9.5マイクロリットルのマスターを乾燥したgDNAサンプルと共にプレートの各ウェルに混ぜます。この後、ホイルでプレートを密封し、すぐに摂氏4度で保存します。塗布マスターが複数の384ウェルDNAプレートに混入する場合は、液体ハンドリングシステムの針をきれいにするために短い水洗浄を行うことを忘れないでください。450 gsのgDNAサンプルを用いてプレートを3分間遠心分離する。その後、プレートを摂氏4度でインキュベートし、DNAを再懸濁し、気泡を放散します。プレートを一晩インキュベートした後、遠心分離を繰り返して気泡を放散します。次に、冷却された貯蔵ドックにプレートを置きます。qPCR マシンをマイクロプレートハンドラに接続します。次に、テキストプロトコルに従ってマイクロプレートハンドラをプログラムします。実行が完了したら、ロボットにqPCRマシンからプレートを集め、廃棄ドックに入れさせます。増幅が完了したら、qPCR ソフトウェアを開きます。「ナビゲータ」タブで、プレートの保存された反応実験ファイルを開きます。次に、[新しい解析の作成]ウィンドウを開き、2番目の微分最大値法に適切な設定を選択します。次に、[フィルターコーム]を選択し、STAT6 用に収集されたデータが選択されていることを確認します。適切な色補正を選択します。[計算] をクリックし、[ファイルの保存] をクリックします。[ポイントのフィット]方法を使用してデータを解析するには、[新規解析を作成]ウィンドウを開き、[フィット点]方法に適切な設定を選択します。次に、STAT6 の正しいフィルターとカラー補正を選択します。ノイズバンドを設定して、バックグラウンドノイズを除外します。その後、[解析]タブを開き、フィット点を 3 に設定し、[フィット点を表示]を選択します。変更を保存し、KIR 遺伝子のフィット点および 2nd 微分解析の適切な設定で手順を繰り返します。qPCR ソフトウェアで「ナビゲーター」タブを開き、「結果バッチ・エクスポート」を選択します。次に、実験ファイルを含むフォルダを開き、ウィンドウの右側に転送します。[次へ] をクリックし、エクスポート ファイルの名前と場所を選択します。その後、対象の解析タイプを選択し、[次へ]をクリックします。エクスポートプロセスを開始するには、[次へ] をクリックする前に、ファイルの名前、エクスポート フォルダ、および分析タイプが正しいことを確認してください。エクスポートの状態が [OK] に変わると、画面は自動的に次のステップに移動します。選択したすべてのファイルが正常にエクスポートされたことを確認し、[完了] をクリックします。次に、テキストプロトコルのスクリプトを使用して、エクスポートされたプレートを個々の反応に分割し、コピー番号解析ソフトウェアで読み取り可能なソフトウェアにファイルを変換します。次に、コピー番号分析ソフトウェアを開き、[リアルタイム PCR 結果ファイルのインポート] を選択して、スクリプトで作成されたテキスト ファイルを読み込みます。最後に、[分析]を選択し、[最も頻繁なサンプルコピー番号]を選択して分析を実行します。このプロトコルでは、半自動タイピング(qKAT)を使用して、数値型KIR遺伝子をコピーしました。KIR2DL4 のコピー番号が最も多かったのは 2 部でしたが、KIR3DS1 のコピー番号は最も多かったのがゼロでした。この手順を試みる間、DNAが正確に定量化されていることを確認し、氷上のすべてのステップを実行し、試薬が光から覆われていることを確認することが非常に重要です。また、KIR遺伝子の既知のLD規則に準拠していないサンプルの生データを徹底的にチェックすることも重要です。この手順に従って、シーケンスのような他の方法は、追加の質問、例えば、融合遺伝子の存在、または新規対立遺伝子の同定に答えるために行うことができる。この方法は、開発後、NK細胞生物学、疾患耐性、ヒト生殖におけるKIRの役割を探求する免疫遺伝学の研究者への道を開いた。

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Research

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Genetics

遺伝学

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学ぼう qKAT法によるKIR遺伝子の定量的半自動化入力法。リアルタイムPCRとコピー数解析で、免疫遺伝学や集団遺伝学研究におけるNK細胞受容体遺伝学を効率的に解明できます。

qKAT: キラー細胞免疫グロブリン様受容体遺伝子の定量的半自動化された入力

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