Name: Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a generar virus oncolíticos de sarampión que expresan enganchadores de células T para inmunoterapia antitumoral. Este protocolo ex vivo permite diseñar vectores versátiles que facilitan la inmunomodulación dirigida en cáncer.

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Estos métodos fueron establecidos en el grupo de Viroterapia dirigido por el Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts en el centro nacional para enfermedades tumorales en Heidelberg. Estamos agradecidos a él y a todos los miembros del equipo de laboratorio, especialmente el Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler y Jessica Albert. Este trabajo fue apoyado por el Else Kröner-Fresenius-Stiftung (beca 2015_A78 a Engeland C.E.) y la Fundación de ciencia nacional alemana (DFG, conceder EN 1119/2-1 a Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel recibe un estipendio por la escuela de posgrado Helmholtz para la investigación del cáncer.

Engeland C.E. se cotizan como co-inventor de una patente con respecto a los virus ARN Immunovirotherapy de cáncer de la Universidad de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel no tiene nada que revelar.

Oncolíticos inmunoterapia (es decir., OVT en combinación con inmunomodulación) es muy prometedor para el tratamiento del cáncer, exigiendo más desarrollo y optimización de virus oncolíticos que codifican las proteínas inmunomoduladoras. Este protocolo describe métodos para generar y validar tales vectores de pruebas posteriores en modelos preclínicos relevantes y potenciales futuros traducción clínica en nuevas terapias contra el cáncer.
Numerosas plataformas de virus oncolíticos dife...

Virus oncolíticos (OVs) se están desarrollando como terapéutica contra el cáncer que específicamente replicar dentro y matar a las células del tumor dejando intactos los tejidos sanos. Ahora se ha vuelto común comprensión que viroterapia oncolíticos (OVT), en la mayoría de los casos, no depender sólo de lisis completa del tumor por la eficiente replicación y propagación del virus, pero requiere de mecanismos adicionales de acción para el éxito del tratamiento, incluyendo vascular y estromal orientación y estimulación inmune1,2,3,4. Mientras que muchos estudios tempranos de OV virus sin modificar, la investigación actual se ha beneficiado de un biológico mejor comprensión, biobancos de virus que potencialmente contienen novela OVs y las posibilidades ofrecidas por ingeniería genética para crear avanzado OV plataformas5,6,7.
Dado el reciente éxito de la inmunoterapia, los transgenes de inmunomoduladores son de particular interés con respecto a la ingeniería genética de OVs. Expresión específica de estos productos génicos por las células tumorales infectadas por OV reduce la toxicidad en comparación con la administración sistémica. Objetivo se logra mediante el uso de virus con oncoselectivity inherente o de tropismo viral8. Inmunomodulación local mejora los mecanismos antitumorales multi-faceteados de OVT. Además, esta estrategia es fundamental interrogar a la interacción entre virus, células tumorales y el sistema de inmune del anfitrión. Para ello, este protocolo proporciona un flujo de trabajo aplicable y ajustable para diseñar, clonar, rescatar, difundir y validar oncolíticos vectores de paramixovirus (específicamente el virus del sarampión) codificación tales transgenes.
Modulación de la respuesta inmune puede lograrse por una variedad de transgenes productos dirigidos a diferentes etapas del cáncer-inmunidad ciclo9, incluyendo mejorar el reconocimiento del antígeno del tumor [por ejemplo, antígenos asociados a tumor (TAAs) o inductores de complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I moléculas] sobre la maduración de células dendríticas de apoyo para la presentación de antígeno eficientes (citocinas); reclutamiento y activación de células inmunes deseadas como citotóxicas y helper T cells [quimiocinas tienen actores de la célula de T (BTE)]; dirigidos a la prevencion células tales como células T reguladoras, células supresoras mieloides derivados, tumor-asociados macrófagos y fibroblastos asociada al cáncer (anticuerpos, BTE, citocinas); y prevención de la inhibición de células efectoras y agotamiento (inhibidores de checkpoint). Por lo tanto, existe una plétora de agentes biológicos. Evaluación de tales inmunomoduladores virus-codificado en cuanto a eficacia terapéutica y posibles sinergias, así como la comprensión de los mecanismos respectivos de es necesario mejorar la terapia del cáncer.
Virus de ARN monocatenario de sentido negativo de la familia Paramyxoviridae son caracterizados por varias características propicias para su uso como vectores oncolíticos. Estos incluyen un oncotropism natural, gran capacidad genómica de transgenes (más de 5 kb)10,11, eficiente que se separa como formación de sincicios, alta inmunogenicidad12. Por lo tanto, plataformas OV basadas en virus de moquillo canino13, paperas virus14, enfermedad de Newcastle virus15, Sendai virus16,17, virus de los simios 518y Tupaia paramyxovirus19 se han desarrollado. Vivir más prominente, vacuna de virus de sarampión atenuados cepas (MV) han progresado en el desarrollo preclínico y clínico20,21. Estas cepas de virus se han utilizado por décadas para la inmunización sistemática con un récord de seguridad excelente22. Además, no hay ningún riesgo de mutagénesis de insertional debido a la replicación estrictamente citosólica de paramyxoviruses. Un sistema de genética reversa versátil basado en cDNA de la genómico que permite la inserción de transgenes en unidades adicionales de la transcripción (ATUs) está disponible de11,23,24. Vectores de MV codificación symporter del yoduro de sodio (MV-NIS) para la proyección de imagen y radioterapia o antígeno carcinoembrionario soluble (MV-CEA) como un marcador sustituto para expresión génica viral actualmente están siendo evaluados en ensayos clínicos (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 y NCT00408590). Administración segura ha sido confirmada y se han divulgado casos de la eficacia antitumoral en anteriores estudios25,26,27,28,29, 30 (revisado por Msaouel et otros.31), allanando el camino para los virus de sarampión oncolíticos adicionales que han sido desarrollados y probados preclínico. MV codificación inmunomoduladores moléculas dirigidas a diversos pasos del ciclo del cáncer-inmunidad han demostrado retrasar el crecimiento del tumor y prolongar la supervivencia en ratones, con pruebas de eficacia inmune-mediado y a largo plazo memoria inmune protectora en syngeneic modelos de ratón. Los transgenes codificada en Vector incluyen Colonia del granulocyte-macrófago estimula factor (GM-CSF)32,33, proteína activadora de neutrófilos por el H. pylori 34, checkpoint inmune inhibidores35, Interleucina-12 (IL-12)36TAAs37y BTE38, que enlazará el antígeno de superficie de un tumor con CD3 y así inducir la actividad antitumoral de células T policlonales, independientemente de la célula de T del receptor especificidad y estimulación Co ( Figura 1). Los resultados preclínicos prometedores obtienen para estas construcciones más esfuerzos traslacional demanda.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), un tipo el virus herpes simple codificación de GM-CSF, es la única oncolíticos terapéutico aprobado por la Agencia Europea de medicamentos (EMA) y alimentos y Drug Administration (FDA). El estudio de fase III conduce a aprobaciones en 2015 finales sólo no ha demostrado eficacia en el sitio de inyección intra tumoral, sino también efectos abscopal (es decir, remisiones de no lesiones) en melanoma avanzado39. T-VEC desde entonces ha entrado en ensayos adicionales para el uso en otros tumores (por ejemplo cáncer de piel no melanoma de, , NCT03458117, cáncer pancreático, NCT03086642) y para la evaluación de terapias combinadas, especialmente con control inmune inhibidores (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 y Ribas et otros.40).
Esto demuestra no sólo el potencial de inmunoterapia oncolíticos, sino también la necesidad de más investigación identificar combinaciones superiores de OVT e inmunomodulación. Diseño racional de vectores adicionales y su desarrollo para ensayos preclínicos es clave para esta empresa. Esto también avanzarán la comprensión de los mecanismos subyacentes y tiene implicaciones para la progresión hacia el tratamiento personalizado del cáncer. Para ello, esta publicación presenta la metodología para la modificación y el desarrollo de paramyxoviruses inmunoterapia de cáncer específicas y, más concretamente, de los virus de sarampión oncolíticos codificación anticuerpos participación de células T (figura 2).

<table><tbody><tr><td>Rapid DNA Dephos & Kit de ligadura</td><td>Roche Life Science, Mannheim, Alemania</td><td>4898117001</td><td></td></tr><tr><td>CloneJET Kit de clonación de PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>K1231</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>A9539-500G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN, Hilden, Alemania</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>NEB 10-beta Competente E. coli</td><td>New England Biolabs (NEB), Fráncfort del Meno, Alemania</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>LB medio después de Lennox</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>X964.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Miniprep Kit</td><td>QIAGEN, Hilden, Alemania</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción HindIII-HF</td><td>New England Biolabs (NEB), Fráncfort del Meno, Alemania</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen, Darmstadt, Alemania</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biosera, Boussens, Francia</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Promega, Mannheim, Alemania</td><td>E2311</td><td>puede ser reemplazado por el reactivo de transfección de elección</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>K0129</td><td></td></tr><tr><td>Celdas Vero</td><td>ATCC, Manassas, VA, EE. UU.</td><td>CCL81</td><td></td></tr><tr><td>B16-CD46/ B16-CD20-CD46</td><td>J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg</td><td></td><td>disponibles bajo pedido</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ, Braunschweig, Alemania</td><td>ACC 342</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (medio sin suero)</td><td>Gibco Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Célula colorimétrica Kit de viabilidad III (XTT)</td><td>PromoKine, Heidelberg, Alemania</td><td>PK-CA20-300-1000</td><td>incluye reactivo XTT</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoGibco</td> <td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Columnas de centrifugado QIAquick Ni-NTA</td><td>QIAGEN, Hilden, Alemania</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>3957.3</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10&nbsp; kDa</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Merck Milipore</td><td>71285-3</td><td></td></tr><tr><td>IgG de suero humano</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA-PE</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-092-257</td><td>RRID:</td></tr><tr><td>AB_871939 IgG1 de ratón, control de isotipo kappa, ficoeritrina conjugada, clon MOPC-21 anticuerpo</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Alemania</td><td>555749</td><td>RRID: AB_396091</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HA-biotina, clon 3F10</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>12158167001</td><td>RRID:</td></tr><tr><td>AB_390915 Microperlas anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, EE. UU</td>. <td>MB-030-0050</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Ensayo de citotoxicidad no radiactiva</td><td>Promega, Mannheim, Alemania</td><td>G1780</td><td>Incluye solución de lisis 10x, solución de sustrato (mezcla de sustrato y tampón de ensayo) y solución de parada</td></tr><tr><td>Elevador de celdas</td><td>Corning, Reynosa, México</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Platos de 10 cm</td><td>Corning, Oneonta, NY, EE. UU</td><td>. 430167</td><td></td></tr><tr><td>platos de 15 cm</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos, TPP con fondo en U</td><td>, Trasadingen, Suiza</td><td>92097</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos, fondo plano</td><td>Neolab, Heidelberg, Alemania</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos</td><td>Neolab, Heidelberg, Alemania</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placas de 12 pocillos</td><td>Neolab, Heidelberg, Alemania</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>tubos de 50 ml nerbe</td><td>plus, Winsen/Luhe, Alemania</td><td>02-572-3001</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular T175</td><td>Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot</td><td>159910</td><td></td></tr><tr><td>0.22 y micro; m filtros</td><td>Merck, Darmstadt, Alemania</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

paramyxoviruses para inmunomodulación tumor objetivo: diseño y evaluación ex vivo

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Inmunoterapia de cáncer exitoso tiene el potencial para lograr un control tumoral a largo plazo. A pesar de los éxitos clínicos recientes, sigue siendo una necesidad urgente de terapias seguras y eficaces, adaptadas a perfiles inmune individuales del tumor. Virus oncolíticos permiten la inducción de la respuesta inmune antitumoral así como expresión génica restringidos por el tumor. Este protocolo describe la generación y ex vivo análisis de vectores oncolíticos de inmunomoduladores. Centrándose en el virus de la vacuna de sarampión codificación tienen actores de células T como ejemplo, la metodología general se puede adaptar a otras especies de virus y los transgenes. El actual flujo de trabajo incluye el diseño, reproducción, rescate y propagación de virus recombinantes. Ensayos para analizar la cinética de replicación y la actividad lítica del vector, así como funcionalidad de la aislada inmunomodulador ex vivo se incluyen, facilitando la generación de nuevos agentes para el desarrollo adicional en modelos preclínicos y en última instancia traducción clínica.

La figura 1 ilustra el mecanismo de acción de los virus de sarampión oncolíticos tienen células T actores de codificación. Un diagrama de flujo que representa el flujo de trabajo de este protocolo se presenta en la figura 2. La figura 3 muestra un ejemplo de un genoma del virus del sarampión modificado oncolíticos. Esto proporciona una representación visual de los cambios específico...

Este protocolo describe un flujo de trabajo detallado para la generación y ex vivo de caracterización de virus oncolíticos para expresión de inmunomoduladores, usando virus de sarampión codificación tienen células T actores como ejemplo. Aplicación y adaptación a otras plataformas de vector y los transgenes acelerarán el desarrollo de nuevos immunovirotherapeutics para la traducción clínica.

Paramyxoviruses para inmunomodulación Tumor objetivo: diseño y evaluación Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

Este método puede ayudar a abordar los desafíos clave en el campo de la inmunoterapia contra el cáncer facilitando el desarrollo de vectores oncolíticos para la inmunomodulación dirigida. La principal ventaja del sistema genético inverso aplicado es su versatilidad;por lo tanto, los vectores se pueden adaptar para abordar diversas preguntas de investigación y apuntar tumores con diversas firmas inmunitarias. Los pasos de propagación del virus, especialmente determinar el punto de tiempo óptimo para el virus de la cosecha son difíciles de aprender de un protocolo de texto porque la formación de sincronía debe evaluarse visualmente con el tiempo.Para comenzar a diseñar y clonar vectores inmunomoduladores recombinantes como se describe en el manuscrito. Este protocolo describe pasos específicos para el desarrollo de un vector de vacuna contra el sarampión oncolítico, que codifica un captador biespecífico de células T. Para rescatar el virus del sarampión del ADNr, 24 horas antes de la transfección de las células productoras del virus del sarampión uniformemente en una placa de 6 paredes.Siembra 200.000 células en 2 mililitros DMEM que contienen 10 por ciento de FBS por pozo para logra

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Investigación

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Investigación del cáncer

Expansión ex vivo de células T tumor-reactiva por medio de la 1/Ionomycin briostatina y la formulación de la cadena gamma común de citoquinas

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

Este video muestra un ensayo de vacunación tumoral basado en células. Un ratón, inyectado por vía intradérmica con células de melanoma B16-F10 para la formación de tumores, es vacunado con células B16-F10 que secretan citocina Flt3L cerca del tumor desarrollado. El Flt3L secretado por la vacuna promueve la maduración y proliferación de las células dendríticas que luego presentan antígenos tumorales a las células T en los ganglios linfáticos, desencadenando una respuesta inmunitaria antitumoral...

Implantación tumoral e inyección de una vacuna tumoral en un modelo de ratón

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Este protocolo describe la generación quirúrgica de tumores pancreáticos ortotópicos y la rápida digestión de tumores pancreáticos murinos recién aislados. Después de la digestión, las poblaciones viables de células inmunitarias se pueden utilizar para análisis posteriores, incluida la estimulación ex vivo de las células T para la detección de citoquinas intracelulares por citometría de flujo.

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

Aquí, presentamos un protocolo de trasplante tumoral para la caracterización de linfocitos infiltrados tumorales inherentes y derivados de la periferia en un modelo de tumor de ratón. El rastreo específico de la afluencia de células inmunes derivadas del receptor con citometría de flujo revela la dinámica de los cambios fenotípicos y funcionales de estas células durante las respuestas inmunes antitumorales.

Trasplante de tumores para evaluar la dinámica de las células T CD8+ infiltrantes de tumores en ratones

Este manuscrito describe cómo evaluar la inmunogenicidad in vivo de las vesículas extracelulares (EV) derivadas de células tumorales utilizando citometría de flujo. Los EV derivados de tumores sometidos a muerte celular inmunogénica inducida por el tratamiento parecen particularmente relevantes en la inmunovigilancia tumoral. Este protocolo ejemplifica la evaluación de los EV tumorales inmunoestimulantes inducidos por oxaliplatino, pero se puede adaptar a diversos entornos.

In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

El protocolo presenta un modelo de inmunoterapia contra el cáncer utilizando la vacunación tumoral basada en células con melanoma B16-F10 que expresa Flt3L. Este protocolo demuestra los procedimientos, incluida la preparación de células tumorales cultivadas, la implantación del tumor, la irradiación celular, la medición del crecimiento tumoral, el aislamiento de las células inmunitarias intratumorales y el análisis de citometría de flujo.

Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Aprenda a generar virus oncolíticos de sarampión que expresan enganchadores de células T para inmunoterapia antitumoral. Este protocolo ex vivo permite diseñar vectores versátiles que facilitan la inmunomodulación dirigida en cáncer.

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