Name: Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprende a localizar el locus coeruleus en cerebro de ratón mediante inmunohistoquímica y análisis de metales. Este protocolo permite estudiar la expresión de proteínas y la homeostasis de cobre en esta región neuronal crítica.

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Agradecemos a Abigael Muchenditsi para el mantenimiento de la colonia de ratón. Uso de la fuente de fotones avanzado en el Laboratorio Nacional Argonne fue apoyado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de energía ciencias básicas, con el número de contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova y Dr. Stefan Vogt para soporte a usuarios y asistencia en la fuente avanzada de fotones. Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de salud beca 2R01GM101502 a SL.

Estudios de los animales fue aprobado por la Johns Hopkins University Animal cuidado y número de protocolo de uso (ACUC) M017M385.
1. cerebro de corte
<ol><li>Para inmovilizar, anestesiar ratones por la aplicación del 3% de isoflurano.<ol>
<li>Remoje una bola de algodón con gotas de isoflurano y colocar en un tubo de microcentrífuga de 15 mL. Colocar la nariz del animal en el tubo y deje que se inhale el isoflurano. Compruebe que la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta a la pizca del dedo del pie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar el animal sobre su espalda e inmovilizar por fijar sus extremidades hacia abajo con un alfiler T teniendo acceso a su abdomen.</li>
	<li>Cortar los animales con tijeras quirúrgicas haciendo un recorte de la piel abdominal y cortar a través de la piel en la región del tórax. Precisar la piel usando las clavijas T. Entonces se rompe la membrana peritoneal hasta el tórax. Exponer el corazón se agrieta la cavidad torácica y el diafragma.</li>
	<li>Corte de la aurícula derecha para permitir que la sangre fluya fuera del animal. Inserte una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 25 en el ventrículo izquierdo y perfusión con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Nota: Esto permite que la solución fluya a través de la circulación sistémica y la salida a través de la aurícula derecha.</li>
	<li>Retire la jeringa de 10 mL e inserte una aguja calibre 25 a la jeringa de 60 mL. Perfusión a través del ventrículo izquierdo con 50 mL de paraformaldehído al 4% hielo frío (PFA).<ol>
<li>Preparar hielo frío 4% PFA solución diluyendo 10% solución PFA en H2O y enfriar la solución final de PFA 4% a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislar la cabeza del ratón y extraer el cerebro del cráneo.<ol>
<li>Cortar la piel del cuello y luego corta hacia los ojos para exponer el cráneo. Romper el cráneo desde el cuello a la nariz y luego desde un globo a otro. Pelar el cráneo hacia fuera y suprimir todo el cerebro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar el cerebro en el 4% PFA por 24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el cerebro con pinzas en un tubo cónico de 50 mL con 25 mL de solución de sacarosa al 30%. Mantenerla a 4 ° C durante 48-72 h hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo del tubo.</li>
	<li>Cortar el cerebro con una máquina de cortar de cerebro de ratón adulto coronal de la matriz a través del mesencéfalo (~ 3 mm posterior de bregma). Mantenga la sección del cerebro que contiene el médula oblonga. Nota: Esto dará lugar a dos secciones del cerebro – que contiene más de corteza (anterior del corte) y uno que contiene el tronco cerebral-cerebelo (parte posterior del corte). Utilice la sección del tronco encefálico para los siguientes pasos.</li>
	<li>Incorporar la sección del tronco encefálico con la superficie de corte colocada en la parte inferior de un molde de empotrar, rodeado por la temperatura de corte óptimo compuesto (octubre); mover el cerebro incrustado a un congelador de-80 ° C y congelación durante al menos 12 h – hasta su uso posterior.</li>
	<li>Corte en el criostato: lugar la fijación del molde que contiene el cerebro de OCT en el criostato; Incubar en el criostato durante varias horas ajustar la temperatura del bloque del cerebro al de criostato.</li>
	<li>Retire el molde de inclusión para exponer el bloque de OCT que contiene el cerebro.</li>
	<li>Utilice hojas de afeitar para quitar exceso de OCT de la superficie del bloque sin tocar el cerebro.</li>
	<li>Monte el bloque de OCT en el mandril del criostato, exponer la superficie de corte del cerebro hacia el frente.</li>
	<li>Ajustar la superficie de corte del cerebro de manera que se orienta en paralelo a las razorblades de criostato.</li>
	<li>Recorte del cerebro que comienza en la médula, corte 100 μm secciones rostral.</li>
	<li>Borde rostral hasta el cerebelo y el tronco encefálico cortan como un segmento continuo. Comenzar a colectar rebanadas a 50 μm de grosor. Nota: Como uno recorta rostral de la médula, el tronco encefálico y el cerebelo se cortan como dos secciones separadas. En secciones rostrales, el tronco encefálico y el cerebelo se fusionarán eventualmente a nivel del ventrículo 4th . Una vez que los bordes laterales del ventrículo 4th son bien formados, a continuación, el cerebelo y el tronco encefálico va a salir como un segmento continuo.<ol>
<li>Recoger la rebanada del cerebro rodeado de OCT con pinzas y colocar en un pozo de una placa de 24 pocillos con PBS (Figura 2a). La LC será más prominente cuando el cerebelo y el colículo inferior resuelven uno otro en ~-5.52 mm posterior de bregma (Figura 1b). Nota: La parte más anterior de la LC va a desaparecer una vez que el cerebelo ha sido seccionado totalmente y ya no rodea el colliculus inferior en ~-5.34 mm posterior de bregma (figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. inmunohistoquímica para dopamina β-hidroxilasa o la tirosina hidroxilasa (Figura 2)
<ol><li>Día 1<ol>
<li>Lavar las rodajas de las tres veces durante 5 minutos en PBS.</li>
		<li>Permeabilizar por 24 h en 0.5% de tampón fosfato salino con detergente (PBSD) a 4 ° C.<ol>
<li>Diluir 125 μl de detergente en 25 mL de PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 2<ol>
<li>Lavar rebanadas tres veces durante 5 min en 0.5% PBSD.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo primario, anti-DAP o anti-TH de 18 h a una dilución de 1: 500 en 0.5% PBSD a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Día 3<ol>
<li>Lavar rebanadas tres veces durante 10 min en 0.5% PBSD.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo secundario deseado (488 burro anti-conejo para fluorescencia verde) a una dilución de 1: 1000 en 0.5% PBSD durante 16 horas.</li>
		<li>Envolver la placa bien 24 en aluminio y de 4 ° C.</li>
		<li>Lavar rebanadas tres veces durante 5 min en 0.5% PBSD.</li>
		<li>Lavar durante 5 minutos en PBS.</li>
		<li>Transferencia de rebanadas con un pincel de lápiz en un recipiente de agua.</li>
		<li>Coloque rodajas flotando en el agua en las diapositivas cargadas.</li>
		<li>Secciones de cubreobjetos con medios de montaje observó (sin DAPI).</li>
		<li>Secar las secciones de la cerebral montado durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rebanadas de cerebro de imagen en un microscopio confocal o fluorescente con configuración para detectar la señal de longitud de onda de fluoróforo anticuerpo secundario apropiado.</li>
		<li>Ajuste del microscopio para el plano focal de la rebanada del cerebro y tomar una sola imagen con 10 aumentos.</li>
		<li>Para localizar una posible región de LC en la rebanada del cerebro, utilizar el ventrículoth 4 para la orientación; el cerebelo se encuentra por encima del ventrículo, puente de Varolio y tronco encefálico se encuentran por debajo de30.</li>
		<li>Para localizar la LC, se centran en los bordes laterales del ventrículo 4th ; la LC se origina de los bordes de los 4 puntos hacia el puente de Varolio y ventrículoth / región del tronco encefálico (figura 2b, 2C).</li>
		<li>Tras la proyección de imagen y la localización de la LC en ciertos sectores del cerebro, almacenar diapositivas que contiene rebanadas de cerebro a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. detección de la LC en rebanadas de cerebro
<ol><li>Para localizar la sección del cerebro que contiene la LC, la rebanada del cerebro de ratón como se describe anteriormente y recoger las secciones en PBS llena 24 platos bien, como se muestra en la Figura 2a.<ol>
<li>Coloque una sección del cerebro por pozo para permitir la correcta localización de la LC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger un total de 48 rebanadas de cerebro que immunostained por cerebro. Nota: Todos los pozos de los dos platos que se muestra en la Figura 2a contienen rebanadas de cerebro de un animal.</li>
	<li>Immunostain cada rebanada de tercera a quinta para DAP, o TH Preferiblemente, realizar inmunohistoquímica de las rebanadas de cerebro que son adyacentes a las que se analizan más (a través de microscopía de fluorescencia de rayos x, XFM). Nota: Este procedimiento permite la localización exacta de la LC en los cortes de ensayo final (Figura 2a; etiquetados con números entre los pozos).</li>
	<li>Ajustar el número de rebanadas de cerebro que immunostained dependiendo de la aplicación, por ejemplo, si requiere la ubicación exacta del centro y el borde de la LC, o solamente una aproximación áspera.</li>
	<li>Después de immunohistochemistry, detectar rebanadas de cerebro que contiene LC a través de un patrón característico de la expresión en ambos lados del 4 ventrículoth (figura 2b, 2C). Aumento de la señal de DAP en la LC de rebanadas cerebrales consecutivos se muestra en la Figura 2d, 2e; la imagen magnificada de la LC que se tiñe de TH se muestra en la figura 2f.
</li>
	<li>Utilice las secciones adyacentes a los LC que contiene estudios adicionales - en este caso para XFM para cuantificar niveles de metal (figura 3).</li>
	<li>Para realizar el XFM, recoger rebanadas de cerebro coronales fino 10-30 μm (dependiendo de la configuración) en la fina película polimérica con la que pueden ser montados sobre portamuestras y reflejadas en el sincrotrón.</li>
	<li>Rebanadas de cerebro de tienda que se preparan en delgada película polimérica para XFM a temperatura ambiente y realizan XFM.</li>
</ol>4. metal proyección de imagen en la LC a través de XFM
<ol><li>Cortar el cerebro de ratón de ejemplo como se describe anteriormente, determinar LC y medir los niveles de metal a través de XFM de estas rebanadas de cerebro que contiene la LC.</li>
	<li>Distribuciones elementales de imagen en línea 2-ID-E en el origen del fotón avanzado (Laboratorio Nacional de Argonne, Argonne IL).</li>
	<li>Registrar datos 'sobre la marcha' como se describe anteriormente31.</li>
	<li>Determinar las concentraciones elementales en rebanadas de cerebro que contiene la LC con el programa mapas32,33.</li>
</ol>

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Orientar adecuadamente la muestra es un paso crucial en el presente Protocolo. Porque estamos usando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC (límite entre cerebelo y colículo inferior), es importante alinear correctamente las secciones. Esto requiere cuidado en fijar adecuadamente el cerebro en la matriz de máquina de cortar de cerebro de ratón. Recomendamos cortar ~ 500 μm más tejido anterior y posterior al LC para evitar la falta del núcleo. El error más común es cortar seccione...

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Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

El locus coeruleus (LC) es una región importante en el médula oblonga y un sitio importante de producción de norepinefrina (NE)1. La LC envía proyecciones a lo largo de los2 del cerebro a la corteza, el hipocampo y el cerebelo3 y regula procesos fisiológicos importantes, incluyendo el ritmo circadiano4,5, atención y memoria6, tensión de7,8de procesos cognitivos y emoción9,10. Disfunción de la LC ha sido implicada en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos11, incluyendo Parkinson enfermedad12,13,14, enfermedad de Alzheimer14, depresión15 ,16,17y18,de trastorno bipolar19ansiedad20,21,22,23, 24. teniendo en cuenta estas funciones, análisis de LC es fundamental para estudiar su función y disfunción.
Ratones son ampliamente utilizados para estudios de procesos fisiológicos y patofisiológicos. Debido a su pequeño tamaño, el ratón LC tiene un diámetro promedio de ~ 300 μm, conduciendo a la dificultad para ubicar la estructura. Durante secciones de la cerebral, la LC puede perderse fácilmente en secciones coronales o sagitales. Descripción identificación de LC en los animales los estudios disponibles no ofrecen un protocolo paso a paso que un no experto puede seguir1,25. Así, para ofrecer una orientación para la localización de la LC, se describe un protocolo que hemos desarrollado para localizar la región en el cerebro de ratón para aplicaciones varias (figura 1, figura 2, figura 3). El protocolo aplica a detección de seccionamiento e immunohistochemical cerebro cuidadosamente controladas de DAP26,27, o alternativamente TH24, ambas enzimas altamente enriquecidos en el LC28. Una vez que la LC se encuentra por immunohistochemistry, rebanadas del cerebro adyacente pueden utilizarse para otros estudios, los análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios imagenológicos metal por rayos x fluorescencia microscopía (XFM)29. Describimos XFM como ejemplo en este protocolo (figura 3).

<table><tbody><tr><td>Matriz cortadora de cerebro de ratón adulto</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo, Alexa Fluor 488 (fuente - burro)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio cargados</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de corte Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>Scissors Mini, 9,5 cm</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de dopamina y beta;-hidroxilasa (DBH) - producción propia (fuente - conejo)</td><td>B. Eipper</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de dopamina y beta;-hidroxilasa (DBH) - disponible comercialmente (fuente - conejo)</td><td>Señalización celular</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon, 50ml</td><td>EE. UU. Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Forano (isofluorano)</td><td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Hardset Medios de montaje</td><td>EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>placas multipocillo, 24 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Temperatura óptima de corte compuesto (OCT)</td><td>VWR/ tissue tech</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)/formalina 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de inclusión desechables Peel-A-Way</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr>Pincel <td></td><td></td><td></td>para<td>lápices</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar Amazon</td><td></td><td>ASIN:</td> B000CMFJZ2 <td></td></tr><tr><td>Espátulas</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T</td><td>pines Office Depot</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>El cerebro del ratón en coordenadas estereotáxicas, Paxinos y Franklin, 3ª Edición</td><td>Amazon</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (para preparar PBSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de tirosina hidroxilasa (TH) (fuente - conejo)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Película delgada de ultralene para XRF</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente de campo amplio</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

localización del locus coeruleus en el cerebro de ratón

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

El locus coeruleus (LC) es un importante centro de norepinefrina produciendo neuronas que modulan varias funciones fisiológicas. Anormalidades estructurales o funcionales de LC afectan varias regiones del cerebro incluyendo la corteza, hipocampo y cerebelo y pueden contribuir a la depresión, trastorno bipolar, ansiedad, así como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Estos trastornos a menudo se asocian a misbalance metal, pero el papel de los metales en LC se entiende solamente parcialmente. Estudios morfológicos y funcionales de LC son necesarios para comprender mejor las patologías humanas y la contribución de metales. Los ratones son un modelo experimental utilizado, pero el ratón LC es pequeño (~0.3 mm de diámetro) y difíciles de identificar para un no experto. Aquí, describimos un protocolo de inmunohistoquímica-base paso a paso para localizar la LC en el cerebro de ratón. Dopamina-β-hidroxilasa (DBH) y alternativamente, la tirosina hidroxilasa (TH), ambas enzimas altamente expresadas en la LC, se utilizan como marcadores inmunohistoquímicos en rebanadas de cerebro. Secciones adyacentes a las secciones que contiene la LC pueden utilizarse para su posterior análisis, incluyendo histología para estudios morfológicos, pruebas metabólicas, así como la proyección de imagen de metal por microscopía de fluorescencia de rayos x (XFM).

Cambios en la homeostasis de metales (tales como Cu, Fe, Zn y Mn) a menudo se observan en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en la LC34,35. Así, determinar los niveles de metales en el cerebro es necesario para la comprensión de los mecanismos de la enfermedad. Las secciones de la cerebral generadas utilizando el protocolo descrito pueden utilizarse para cuantificar los niveles de Cu y otros metales en la LC y compararlos...

Locus coeruleus es un pequeño grupo de neuronas implicadas en una variedad de procesos fisiológicos. Aquí, describimos un protocolo para preparar secciones de cerebro de ratón para estudios de proteínas y metales en este núcleo.

Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

Disfunción de locus coeruleus se ha implicado en trastornos neurológicos y neuropsiquiátricos, incluyendo la enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Alzheimer, depresión, trastorno bipolar, y ansiedad. Dadas estas funciones, el análisis de locus coeruleus es crucial para estudiar su función y disfunción. Durante la sección del cerebro del ratón, el locus coeruleus se puede perder fácilmente en secciones coronales o sagitales debido a su pequeño tamaño.Así, para ofrecer orientación para la localización de locus coeruleus, describimos un protocolo que desarrollamos para localizar esta región en el cerebro del ratón para varias aplicaciones. Comience colocando el cerebro recién aislado de un ratón anestesiado y luego perfundido en 4%PFA en un tubo de 50 mililitros. Incuba el cerebro durante 24 horas a cuatro grados centígrados.Utilice fórceps para transferir el cerebro a un tubo cónico de 50 mililitros lleno de 25 mililitros de 30% de solución de sacarosa. Incubarlo a cuatro grados centígrados durante 48 a 72 horas hasta que el cerebro se hunda hasta el fondo del tubo. Para incrustar la sección del tronco encefálica, coloque su superficie de corte en la parte inferior de un molde de incrustación y agregue un compuesto de temperatura de corte óptimo para rodear el tronco encefálica.Congele el cerebro incrustado en un congelador de menos 80 grados Celsius durante al menos 12 horas hasta su uso posterior. Coloque el molde con el cerebro en el criostato e inciba durante varias horas para ajustar su temperatura a la del criostato. Para exponer el bloque OCT que contiene el cerebro, utilice una cuchilla de afeitar para cortar los cuatro bordes del molde hasta la parte inferior, y luego despegue el molde incrustado de él.Usa cuchillas de afeitar para eliminar el exceso de OCT de la superficie del bloque, asegurándote de no tocar el cerebro. A continuación, monte el bloque OCT en el mandril del criostato, exponiendo la superficie de corte del cerebro hacia el frente. Para ajustar el cerebro, oriente la superficie de corte paralela a las cuchillas de afeitar del criostato.Orientar correctamente la muestra es un paso crucial en este protocolo. Debido a que estamos utilizando características anatómicas de la superficie dorsal del cerebro para localizar LC, como el límite entre el cerebelo y el colliículo inferior, es importante que las secciones se alineen correctamente. Esto requiere cuidado en establecer correctamente el cerebro en la matriz de la cortadora de cerebro del ratón.Recortar el cerebro comenzando en la médula, cortando secciones de 100 micrómetros rostralmente. Una vez que el cerebelo y el tronco encefálica comiencen a cortar como una rebanada continua a nivel del cuarto ventrículo, comience a recolectar rodajas con un grosor de 50 micrómetros. Use fórceps para recoger cada rebanada de cerebro y colóquela en un pozo de un plato de 24 pocillos lleno de PBS.El locus coeruleus será más notable en una rebanada donde el cerebelo y el colliículo inferior se encuentran unos con otros a unos 5,52 milímetros posteriores de bregma. El primer día, lave las rodajas cerebrales en la placa de 24 pozos tres veces durante cinco minutos cada una en PBS. A continuación, añadir 0.5%PBS con detergente y permeabilizarlos a cuatro grados Celsius durante 24 horas.Al día siguiente, lave las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una con 0.5%PBSD. Luego agregue el anticuerpo primario a una dilución de uno a 500 en 0.5%PBSD e incubar a cuatro grados Celsius durante 18 horas. Al tercer día, lave las rodajas tres veces durante 10 minutos cada una con 0.5%PBSD, luego agregue el anticuerpo secundario en una dilución de uno a 1000 en 0.5%PBSD.Envuelva la placa con papel de aluminio e incubar a cuatro grados Centígrados durante 16 horas. Después de la incubación, lave las rodajas tres veces durante cinco minutos cada una con 0.5%PBSD, y luego durante cinco minutos en PBS. Cubra las secciones utilizando un medio de montaje duro sin DAPI.Cubra con una cubierta de vidrio y séquela durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice un microscopio confocal con ajustes para detectar la señal de la longitud de onda de fluorescencia adecuada a las rebanadas cerebrales de imagen. Después de ajustar el microscopio al plano focal de la rebanada cerebral, utilice un aumento de 10 veces para tomar una sola imagen.Utilice el cuarto ventrículo situado debajo del cerebelo y por encima de pons y tronco encefálico para localizar una posible región LC en la rebanada cerebral. Concéntrese en los bordes laterales del cuarto ventrículo y la LC se ubicará comenzando desde los bordes del cuarto ventrículo y apuntando hacia la región del tronco cerebral. La distribución intracelular de la dopamina beta-hidroxilasa, una proteína expresada en la LC, se evaluó utilizando este protocolo con el fin de estudiar la morfología LC y la densidad neuronal.Otra proteína expresada en la LC, la tirosina hidroxilasa, también mostró una fuerte señal fluorescente verde en las rebanadas cerebrales que contienen la LC.Los cambios en la homeostasis metálica se observan a menudo en trastornos neurológicos, incluyendo cambios en el LC.In este ejemplo, cuando una rebanada cerebral cortada a través de la LC se midió para fosfato, potasio, zinc y cobre, sólo el cobre mostró un aumento específico de la señal. Recomendamos cortar alrededor de 500 micras más de tejido anterior y posterior a LC para evitar perder el núcleo, y cortar más secciones de las necesarias, especialmente si la primera vez realiza este protocolo. El estudio cuidadoso de las imágenes del atlas cerebral antes de la tinción es muy útil.Una vez que la LC se encuentra mediante inmunohistoquímica, las rebanadas cerebrales adyacentes se pueden utilizar para estudios adicionales, incluyendo análisis morfológicos y metabólicos, así como estudios de imágenes metálicas a través de microscopía de fluorescencia de rayos X. Las secciones cerebrales generadas utilizando el protocolo descrito se pueden utilizar para cuantificar los niveles de cobre y otros metales en la LC y compararlos con los niveles en regiones fuera de la LC, que es necesario para la comprensión del mecanismo de la enfermedad. Otras posibles aplicaciones de este protocolo incluyen la detección de abundancia y distribución intracelular de la dopamina beta-hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, y otras proteínas expresadas en la LC individualmente, o en los ensayos de co-tinción, estudios de morfología LC y densidad neuronal.

localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describe un protocolo para la perfusión transcardiaca de los ratones, la eliminación y la sección del cerebro, así como la tinción con inmunoperoxidasa, la incrustación de resina, y ultrafinas de seccionamiento de las secciones del cerebro. Al término de estos procedimientos, el material immunostained está listo para el examen con microscopio electrónico de transmisión.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Fuente: Xavier, A. L. R., et al. Implantación de cánula en la cisterna magna de roedores. J. Vis. Exp. (2018)Este video muestra el procedimiento para implantar una cánula en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La técnica consiste en guiar una cánula montada con aguja a través de la duramadre hacia la cisterna magna triangular invertida y asegurarla para su administración dirigida al líquido cefalorraquídeo.

Implantación de cánula en la cisterna magna en un modelo de ratón

Este video muestra el registro in vivo del potencial de campo local (LFP) de áreas M2 bilaterales del cerebro del ratón. Se asegura un ratón anestesiado y se prepara para el procedimiento. Para registrar los LFP, inserte microelectrodos en las coordenadas objetivo de las áreas M2 bilaterales, que son responsables de movimientos motores complejos.

Registro del potencial de campo local de ambos hemisferios del cerebro del ratón

Este protocolo describe el uso de la inmunohistoquímica para identificar regiones del locus coeruleus en secciones del cerebro de ratón. Al dirigirse a la dopamina β-hidroxilasa con anticuerpos marcados con fluoróforos verdes, las neuronas productoras de norepinefrina se visualizan como fluorescencia verde bajo un microscopio.

Inmunohistoquímica para la identificación de la región del locus coeruleus en secciones de cerebro de ratón

Este video demuestra la tinción inmunohistoquímica de fibras colinérgicas en el núcleo basal de la región de Meynert de secciones de cerebro de ratón. Las secciones se bloquean y se tratan con anticuerpos primarios contra la colina acetiltransferasa, seguidos de anticuerpos secundarios biotinilados. Se añaden complejos avidina-biotina-peroxidasa, que se unen a los anticuerpos secundarios, seguidos del sustrato cromogénico. A continuación, las secciones se deshidratan y se montan antes de...

Tinción inmunohistoquímica de fibras nerviosas en el núcleo basal de Meyner del cerebro de ratón

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

Presentamos un registro electrofisiológico in vivo del potencial de campo local (LFP) en la corteza motora secundaria bilateral (M2) de ratones, que se puede aplicar para evaluar la lateralización del hemisferio. El estudio reveló niveles alterados de sincronización entre la izquierda y la derecha M2 en ratones APP/PS1 en comparación con los controles WT.

Evaluación de la lateralización del hemisferio con registro de potencial de campo local bilateral en corteza motora secundaria de ratones

Para verificar si los efectos trigéminos sobre el rendimiento cognitivo implican actividad de locus coeruleus, se presentan dos protocolos que tienen como objetivo evaluar posibles correlaciones entre el rendimiento y los cambios en el tamaño de la pupila relacionados con la tarea inducidos por la masticación. Estos protocolos pueden aplicarse a condiciones en las que se sospeche la contribución de locus coeruleus.

Evaluación de los cambios vinculados a los alumnos en La estimulación trigéminal mediada por Locus Coeruleus

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

La cirugía estereotáxica para atacar los sitios cerebrales en ratones comúnmente implica el acceso a través de los huesos del cráneo y es guiada por puntos de referencia del cráneo. Aquí describimos un enfoque estereotáxico alternativo para apuntar al tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la cisterna magna que se basa en la visualización directa de los puntos de referencia del tronco encefálico.

Abordaje quirúrgico estereotáxico para microinyectar el tronco encefálico caudal y la médula espinal cervical superior a través de la Cisterna Magna en ratones

Este protocolo detalla el procedimiento para obtener imágenes de las respuestas de calcio en el colículo superior (SC) de ratones despiertos, incluida la obtención de imágenes de la actividad de una sola neurona con microscopía de dos fotones mientras se deja la corteza intacta en ratones de tipo salvaje, y la obtención de imágenes de todo el SC con microscopía de campo amplio en ratones mutantes de corteza parcial.

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

Aprende a localizar el locus coeruleus en cerebro de ratón mediante inmunohistoquímica y análisis de metales. Este protocolo permite estudiar la expresión de proteínas y la homeostasis de cobre en esta región neuronal crítica.

Localización del Locus Coeruleus en el cerebro de ratón

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