Name: Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a fabricar andamios descelularizados derivados de cartílago nativo para ingeniería de tejidos y regeneración articular. Este método preserva la matriz extracelular para promover la formación de cartílago in vitro e in vivo.

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Los autores desean reconocer arranque W. asistencia en la producción de los andamios. K.E.M. dobladores es apoyado por el Alexandre Suerman Stipendium de la University Medical Center. Levato R. y J. Malda son apoyados por la fundación holandesa de artritis (conceder acuerdos CO-14-1-001 y LLP-12, respectivamente).

Este protocolo, se obtuvo cartílago equino Babilla de caballos que habían muerto de otras causas de artrosis. Tejido se obtuvo con el permiso de los propietarios, conforme a las normas éticas institucionales.
Nota: Este protocolo describe la fabricación de andamios de decellularized cartílago equino, que puede utilizarse para aplicaciones tales como plataformas de cultivo de tejidos in vitro o en vivo la implantación de estrategias de la medicina regenerativa. Los pasos de tratamiento enzimático deben realizarse en el orden cronológico descrito.
1. recolección de cartílago Articular de donante (cadavérico) juntas
<ol><li>Por delante de la etapa de cosecha, preparar 1 L de cartílago solución de lavado, que consiste en tampón fosfato salina (PBS), complementada con 100 U/mL penicilina estreptomicina 100 de μg/mL y 1% (v/v) anfotericina B.</li>
	<li>Use guantes y una bata de laboratorio durante el proceso de cosechando, ya que el donante puede transportar patógenos.</li>
	<li>Obtener una articulación (cadavérico) intacta para el aislamiento del cartílago. Nota: En este punto, la piel alrededor de la articulación está aún intacta. Cartílago de rodilla equino de caballo se utilizó en el presente Protocolo, pero también se pueden utilizar otras articulaciones de otras especies.</li>
	<li>Retirar la piel que se encuentra en el área de interés mediante el uso de un bisturí y una pinza quirúrgica. Además, quitar el exceso de tejido muscular y grasa si es necesario, sin dañar la articulación subyacente. Opcionalmente, traslado al cadáver preparado a un gabinete de seguridad biológica.</li>
	<li>Para realizar una artrotomía, es decir, una separación de la articulación, primero definir el lugar donde se articula la articulación al realizar extensión y flexión de la articulación.</li>
	<li>Retire con cuidado las capas de grasa, músculos y tendones con un bisturí y pinzas quirúrgicas para abrir el área.</li>
	<li>Hacer una incisión para llegar a la cavidad articular. Nota: Se llena la cavidad articular con líquido sinovial, el cual puede gotear de la cavidad cuando se realiza una incisión correcta.</li>
	<li>Continuar abrir completamente la Junta cortando a través de los tendones que mantener la articulación unida.</li>
	<li>Inspeccione el cartílago daños macroscópicos. Nota: Si el cartílago articular no tiene un aspecto brillante y liso o si presentan ampollas evidentes, hendiduras o defectos, deseche el cartílago.</li>
	<li>Utilice un bisturí estéril para retirar el cartílago del hueso subcondral. Cortar hasta el hueso subcondral para quitar también la zona profunda del cartílago (figura 1). Para impedir que el cartílago se sequen, regularmente gotear solución de lavado en el cartílago cartílago. Nota: En este momento, no importa el tamaño de los trozos de cartílago.</li>
	<li>Recoger las láminas de cartílago en tubos de 50 mL que contiene cartílago preparado previamente lavado solución (figura 2A).</li>
	<li>Después de recoger el cartílago de todas las áreas de interés, snap congelar los trozos de cartílago en nitrógeno líquido durante 5 minutos.</li>
	<li>Transferir los trozos de cartílago en tubos de 50 mL e inmediatamente liofilizar las rebanadas del cartílago durante 24 h en una secador de la helada. Ajuste de la congelación temperatura a aproximadamente 0.090 mbar mientras el condensador de hielo es-51 ° C (figura 2B).</li>
	<li>Almacene las láminas de cartílago en un lugar seco a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Nota: Hasta el punto de formación de andamio, las soluciones y el cartílago no debe ser preparado y tratado de una manera estéril.</li>
</ol>2. creación de Decellularized las partículas de cartílago
<ol><li>Sumerja las rebanadas de cartílago liofilizado en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Directamente moler las muestras manualmente o por una fresadora. Cuando los trozos de cartílago a mano, utilizar un mortero y una Maja y moler las rodajas de aproximadamente 45 minutos hasta que estén pulverizadas (figura 2 y 2D). Cuando esmerile automáticamente, utilizar una fresadora a la velocidad preestablecida durante unos pocos segundos hasta un minuto, hasta que los trozos de cartílago congelado de snap se pulverizan. Nota: Pre-enfriar el mortero o el compartimiento de pulido de la máquina de molienda mediante la adición de nitrógeno líquido. Cuando se utiliza una máquina de la molinería, asegúrese de que todas las partículas son tierra, y que no hay partículas de alojarte en la parte inferior del compartimiento de pulido.</li>
	<li>Las partículas de cartílago para deshacerse de las piezas más grandes utilizando un tamiz con una malla de 0.71 m m del tamiz.</li>
	<li>Almacenar las partículas en un lugar seco a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. descelularización enzimática con tripsina 0.25%-EDTA
<ol><li>Preparar la solución de digestión, que consiste en 0.25% tripsina con EDTA suplementado con 100 U/mL penicilina estreptomicina 100 de μg/mL y 1% (v/v) anfotericina B. tienda la solución a 4 ° C. Nota: Trypin es una proteasa que degrada proteínas en el tejido de cartílago. Este paso enzimático se abrirá en la estructura de cartílago denso.</li>
	<li>Llenar los tubos de 50 mL con las partículas de cartílago pulverizado hasta un volumen de aproximadamente 7,5 mL por tubo.</li>
	<li>
Incubar las partículas de cartílago con la solución de digestión preparado a 37 ° C durante 24 h en total, mientras que actualizar la solución de digestión cada 4 h.
	<ol>
<li>En primer lugar, Añadir 30 mL de la solución de digestión a cada tubo de 50 mL que contiene las partículas de cartílago.</li>
		<li>A continuación, vuelva a suspender las partículas mediante un vortex o pipeta para que todas las partículas están expuestas a la solución enzimática.</li>
		<li>Incubar las muestras durante 4 h a 37 ° C en un rodillo.</li>
		<li>Para actualizar la solución de digestión, centrifugar los tubos durante 20 min a 3113 x g para causar sedimentación de las partículas de cartílago. Deseche el sobrenadante. Nota: El sobrenadante se hará más claro con cada período de incubación de la tripsina.</li>
		<li>Repita paso 3.3.1–3.3.4 hasta que las partículas han sido incubadas con la solución de digestión de 6 ciclos de 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del ciclo final, retirar el sobrenadante después de centrifugar y lavar las partículas en 30 mL de solución de lavado dos veces al cartílago. De centrífuga las partículas por 20 min a 3113 x g entre cada uno de los lavados.</li>
</ol>4. enzimática descelularización con nucleasa tratamiento
<ol><li>Preparar una solución de Tris-HCl a pH 7,5 en agua desionizada de 10 mM.</li>
	<li>Añadir 50 desoxirribonucleasa U/mL y ribonucleasa U/mL 1 al tampón Tris-HCl, para obtener la solución de la nucleasa. Nota: Este paso se realiza para degradar específicamente deoxyribonucleases y ribonucleasas.</li>
	<li>Para quitar el cartílago lavado solución de las partículas de cartílago (paso 3.4), centrifugar durante 20 minutos a 3.113 x gy eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 30 mL de la solución de nucleasa a las partículas de cartílago y remover las partículas a través de la solución, asegurándose de que todas las partículas están expuestas a la solución de la nucleasa.</li>
	<li>Incubar las muestras en un rodillo de 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Retirar la solución de nucleasa por centrifugación las partículas del cartílago por 20 min a 3.113 x g y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar las muestras añadiendo 30 mL de 10 mM Tris-HCl solución sin la desoxirribonucleasa y la ribonucleasa A las partículas de cartílago. Resuspender las partículas y dejar las muestras en un rodillo de 20 h a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. detergente descelularización
<ol><li>Que la solución detergente disolviendo 1% (v/v) octoxinol-1 en PBS.</li>
	<li>Retire la solución de Tris-HCl de las partículas de cartílago por centrifugación durante 20 min a 3.113 x g y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 30 mL de la solución preparada de detergente de 1% a las partículas de cartílago. Resuspender las partículas de cartílago suavemente para evitar formación de espuma de la solución. Nota: Este paso se rompe las membranas celulares.</li>
	<li>Incubar las muestras en un rodillo durante 24 h a temperatura ambiente en un rodillo.</li>
	<li>Eliminar la solución detergente por centrifugación durante 20 min a 3.113 x g y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>
Para quitar todos los restos de las soluciones de descelularización, lavar las partículas de cartílago en 6 ciclos de 8 h en 30 mL de solución de lavado de cartílago. Realizar el lavado en un rodillo a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Para cambiar al siguiente lavado, centrifugar la suspensión por 20 min a 3.113 x g, deseche el sobrenadante y añadir cartílago fresca solución de lavado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deje el último lavado en los tubos y almacenar las partículas de cartílago decellularized a-80 ° C.</li>
</ol>6. creación de matrices de soporte de las partículas Decellularized
<ol><li>Si las partículas se han guardado a-80 ° C, descongelar los tubos cerrados que contienen las partículas de cartílago en agua tibia antes de crear las matrices de soporte.</li>
	<li>Transferencia de las partículas de cartílago con un cucharón pequeño a un molde cilíndrico, por ejemplo, un frasco de plástico con un diámetro de 8 mm y una altura de 2 cm.</li>
	<li>Al colocar las partículas de cartílago en el molde de plástico, presiona todas las burbujas de aire hacia fuera para evitar las caries en el andamio y llenar el molde hasta el borde. Nota: Será más difícil tomar los andamios de un molde de metal después de la formación del andamio, que puede conducir a fisuras en el andamio.</li>
	<li>Congelar los moldes con las partículas de cartílago durante 10 min a-20 ° C.</li>
	<li>Liofilizar los andamios de cartílago en sus moldes durante 24 h en una secador de la helada.</li>
	<li>Después de la liofilización, el andamio de molde (figura 3) y reaccione con ultravioleta (UV) luz en distancia de 30 cm y 365 nm durante la noche.</li>
	<li>Para poder utilizar las matrices de soporte para cultivo celular in vitro o in vivo implantación, esterilizar los andamios con, por ejemplo, gas de etileno (EtO) de óxido. Nota: Esterilización de EtO se realiza por la parte externa.</li>
</ol>7. Caracterización de los andamios Decellularized con los Stainings histológicos
Nota: Para garantizar completa descelularización y visualizar el carácter natural restante del cartílago, realizar varios stainings histológicos antes de usar las matrices de soporte en cualquier experimento, incluyendo la hematoxilina y eosina (H & E) tinción para asegurar descelularización, Safranina O de tinción para visualizar la presencia residual de GAG, colágeno tipo I inmunohistoquímica para diferenciar entre contenido en colágeno y colágeno tipo II inmunohistoquímica para diferenciar entre el contenido de colágeno.
<ol><li>Corte los andamios en rebanadas de aproximadamente 3 mm con un bisturí. Nota: Si los andamios se cortan en tamaños más grandes o más pequeñas, las duraciones de los ciclos de deshidratación necesitan adaptarse.</li>
	<li>Incrustar los andamios en una caída de 4% (p/v) de alginato e inducir reticulación mediante la adición de un volumen similar de 3,7% formol no tamponado que contiene 20 mM CaCl2. Nota: Incrustación de alginato hace las rebanadas de andamio más rígida en comparación con los pasos de lavado antes de la inclusión en parafina. En caso de que los andamios han sido células semilla en vivo implantado, incrustación de alginato no es necesario, ya que la composición de los andamios serán suficientemente resistente debido a la incorporación de ECM por las células.</li>
	<li>Deshidratan las muestras colocándolas en una serie gradual de etanol, a partir de ciclos de una hora de 70%, 96%, etanol 96% y 100% 100%, seguido de dos ciclos de 1 h de xileno y terminando con dos ciclos de 1 h de parafina a 60 ° C.</li>
	<li>Después de la deshidratación, las muestras de parafina incrustar en un molde y enfriar las muestras.</li>
	<li>Corte las muestras con un micrótomo en trozos de 5 μm de espesor.</li>
	<li>Antes de la tinción, rehidratar las muestras colocándolas en una serie de etanol graduado devuelto. Comience con dos lavados de xileno durante 5 min, seguido de 2 lavados de etanol 100%, 95% y 70% por 3 min por lavado. Por último, lavar las muestras 3 veces en agua durante 2 minutos. Nota: En caso de utilizar alginato para procesar muestras para inclusión de parafina, asegúrese de lavar el alginato con 10 mM ácido cítrico antes de rehidratación de las secciones de parafina.</li>
	<li>Teñir las muestras con hematoxilina y eosina, Safranina O, colágeno I y colágeno II como descrito anterior11.</li>
</ol>8. Caracterización de los andamios Decellularized con análisis cuantitativos
<ol><li>Obtener resúmenes de papaína de los andamios como se describió anteriormente11.</li>
	<li>Realizar un ensayo con un kit de cuantificación ADN basado en fluorescencia para medir el contenido de ADN de doble cadena de los andamios para descelularización completa. Seguir el protocolo proporcionado por el fabricante. Expresar la cantidad de ADN por peso seco del andamio.</li>
	<li>Realizar un ensayo de dimethylmethylene azul para cuantificar el resto de las garantías en el andamio, como se describió anteriormente11. Expresar la cantidad de GAG por ADN.</li>
</ol>9. siembra de los andamios Decellularized
<ol><li>Corte esterilizados andamios de paso 6.7 mm 3 rodajas.</li>
	<li>La transferencia de los andamios en pocillos distintos de una placa de 6 pozos.</li>
	<li>Rehidratar los andamios con medio de cultivo celular por Pipetear 1 mL de medio en la parte superior del andamio y déjelo remojar durante 30 minutos utilizar condrocitos o medio de expansión de células madre mesenquimales (MSC). Nota: Utilice el mismo medio para la rehidratación de andamio en cuanto a cultura de célula de las células que serán sembradas. Medio de expansión de condrocitos consiste en medio modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 10 ng/mL del factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2). Medio de expansión de MSC consiste en mínimo esencial alfa media (un-MEM) con 10% FBS, 0,2 mM 2-fosfato ácido L-ascórbico, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL y 10 ng/mL FGF-2 inactivadas por calor.</li>
	<li>Preparar 3 x 106 células en 100 μL de medio, que es el volumen requerido para cada soporte con un diámetro de 8 mm y 3 mm de altura. Nota: Múltiples tipos de células de especies diferentes pueden utilizarse para la siembra. Cuando utilizando condrocitos o células estromales mesenquimales, aislar las células como se describió anteriormente11. Cuando utilizando condrocitos, asegúrese de que no se han ampliado más allá del paso P1 para reducir al mínimo el número de condrocitos dedifferentiated. Cuando se utilizan células estromales mesenquimales, debe probarse en su capacidad de diferenciación multilineal, como se describió anteriormente14.</li>
	<li>Extraiga con pipeta 50 μL de preparada la suspensión de células en la parte superior del andamio previamente remojo e incubar el andamio por 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Cuidadosamente gire el andamio al revés abajo, pipetee los restantes 50 μL de la suspensión celular en este lado del andamio e incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Después de la incubación, añadir 3 mL de medio a los pozos y la cultura de los andamios de células sembradas a 37 ° C. Manejar la placa de cultivo con cuidado para evitar el desprendimiento de las células.</li>
	<li>Las matrices de soporte de la cultura para el período de tiempo necesario para el experimento y cambiar el medio de 2 – 3 veces a la semana. Pipeta lentamente y hasta lejos del andamio como sea posible.</li>
	<li>Después de cultivo del andamio celular-sembrado, corte los andamios por la mitad y proceso para análisis bioquímicos y la histología.</li>
</ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

El ECM del cartílago articular es muy densa y bastante resistente a diversos tratamientos enzimáticos. El protocolo de la descelularización de varios pasos descrito en este artículo aborda de esa resistencia y con éxito genera matrices decellularized. Para ello, el proceso se extiende durante varios días. Muchos procesos de descelularización han sido propuestos para los diferentes tipos de tejidos18, y este artículo describe un protocolo adecuado para la descelularización de cartílago. En este pro...

Defectos del cartílago articular de la rodilla causada por eventos traumáticos pueden conducir a molestias y sobre todo pueden tener un gran impacto en la vida de la población joven y activa1,2,3. Por otra parte, daño del cartílago en una edad joven puede llevar a un inicio más rápido de la osteoartritis más adelante en vida4. Actualmente, la única terapia de salvamento para la osteoartritis generalizada de la rodilla es la cirugía de reemplazo articular. Como el cartílago es un tejido avascular, hipocelulares y aneural, su capacidad de regeneración está severamente limitada. Por lo tanto, enfoques de la medicina regenerativa son buscados para ayudar y estimular la capacidad regenerativa del tejido nativo. Para ello, los andamios están diseñados y utilizados como un celular-portador o como un material inductivo que incita a la diferenciación y regeneración de los tejidos del cuerpo las células nativas5.
Decellularized andamios han sido estudiados ampliamente en la medicina regenerativa6. Ha tenido cierto éxito, por ejemplo, ayudar en la regeneración de la piel7, estructuras abdominales8y tendones9. La ventaja de utilizar andamios decellularized es su origen natural y su capacidad para retener señales bioactivos que tanto atraen e inducen la diferenciación celular en el linaje apropiado requerido para la reparación de tejido6,10. Por otra parte, como matriz extracelular (ECM) es un biomaterial natural y descelularización previene una posible respuesta inmune mediante la eliminación de contenido celular o genético, se superan problemas con respecto a la biocompatibilidad y biodegradabilidad.
Derivados de cartílago matriz (MDL) andamios han demostrado gran condrogénica posibles en experimentos in vitro cuando sembrado con células estromales mesenquimales11. Además, estos andamios han demostrado el potencial de tejido óseo de forma a través de la osificación endocondral en localizaciones ectópicas en configuración en vivo12. Como MDL andamios guían la formación de ambos huesos y tejido cartilaginoso, estos andamios pueden tener potenciales para la reparación de defectos osteocondrales además de reparación de cartílago.
Este artículo describe un protocolo adaptado de Yang et al (2010)13 para la producción de andamios decellularized de CDM de equinos sofocar cartílago. Estos andamios son ricos en colágeno de tipo II y desprovisto de células y no contienen ningún glicosaminoglicanos (GAGs) después de descelularización. Experimentos in vitro e in vivo sobre la reparación del defecto condral (osteo) pueden realizarse con estos andamios.

<table><tbody><tr>Articulación <td></td><td></td><td>cadavérica</td><td>: Se puede obtener como material de descanso en la carnicería o centro veterinario local.</td></tr><tr><td>Solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Thermo Fischer Scientific 15290026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenol</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasa A del páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Alginato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>180947</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esterilización por óxido de etileno</td><td>Synergy Health, Venlo, Países Bajos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Las células estromales multipotentes</td><td></td><td></td>/condrocitos de donantes equinos <td>Las MSC y los condrocitos se pueden aislar de las articulaciones del donante que son material de reposo, procedente de la carnicería o centro veterinario local.</td></tr><tr><td>MEM alfa</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22561</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina inactivada por calor</td><td>Sigma-Aldrich 10735086001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2)</td><td>R & Kit</td> de cuantificación <td>de ADN D Systems 233-FB</td><td></td></tr><tr><td>(Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>Azul de 1,9-dimetil-metileno cloruro de zinc doble sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>liofilizador</td><td>SALMENKIPP ALPHA</td><td>1-2 LD plus</td><td></td></tr><tr><td>Molino analítico</td><td>IKA</td><td>A 11 mortero básico</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Haldenwanger 55/0A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plato de rodillo</td><td>CAT</td><td>RM5</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (para tubos de 50 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Cápsula (molde cilíndrico)</td><td>TAAB</td><td>8 mm plano</td><td></td></tr><tr><td>Superlite S UV</td><td>Lumatec</td><td>2001AV</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td> incubadora</tr><tr><td>Tamiz (tamaño de malla 0,71 mm)</td><td>Bisturí</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 34111229 VWR <tr><td>Soporte para</td><td></td><td></td><td></td>bisturí</tr><tr><td>Cucharón</td><td></td><td></td><td></td> pequeño</tr></tbody></table>

fabricación de andamios de decellularized derivados de cartílago matriz

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Los defectos osteocondrales carecen de suficiente capacidad de reparación intrínseca a regenerar el tejido óseo y cartílago funcionalmente sano. En este sentido, investigación de cartílago se ha centrado en el desarrollo de andamios regenerativos. Este artículo describe el desarrollo de andamios completamente derivadas de la matriz extracelular del cartílago natural, procedente de un donante de equino. Posibles aplicaciones de las matrices de soporte incluyen producción de aloinjertos para reparación de cartílago, que sirve como un andamio para tejido osteocondral ingeniería y proporcionando modelos in vitro para estudiar la formación del tejido. Por decellularizing el tejido, las células del donante se retiran, pero muchas de las señales naturales bioactivas se piensan para ser retenido. La principal ventaja de utilizar un andamio tan natural en comparación con un andamio sintético producido es que ninguna otra funcionalización de polímeros se requiere para regeneración de tejido osteocondral en coche. Los andamios derivados de cartílago matriz pueden utilizarse para la regeneración de tejido óseo y cartílago en entornos tanto in vivo como in vitro.

Descelularización de MDL andamios siempre debe ser confirmada usando los stainings histológicos, así como uso de cuantificación de ADN para medir la cantidad de restos de ADN. Descelularización insuficiente puede llevar a respuestas inmunológicas no deseadas que influyen en los resultados en entornos en vivo15,16,17. Para este método específico descelularización, ADN fue por debajo del rango de d...

Decellularized andamios derivados de cartílago pueden utilizarse como un andamio para reparación de cartílago de guía y como medio para regenerar tejido osteocondral. Este documento describe el proceso de descelularización en detalle y ofrece sugerencias para utilizar estos andamios en configuración in vitro.

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Este método presenta una manera de crear andamios derivados del tejido nativo que se puede utilizar para la regeneración del cartílago. La principal ventaja de esta técnica es que los componentes del cartílago nativo se conservan en los andamios que pueden promover la formación y regeneración del cartílago in vitro e in vivo. Aunque este método utiliza cartílago de las articulaciones de la asfixia equina, el cartílago de cualquier otra articulación se puede utilizar también.Para comenzar, obtener una articulación cadavérica intacta para el aislamiento del cartílago y eliminar el exceso de grasa de la piel y el tejido muscular como se describe en el protocolo de texto que lo acompaña. A continuación, defina la ubicación donde se articula la articulación realizando la inflexión de extensión de la articulación. Haga una incisión horizontal para llegar a la cavidad articular.A continuación, haga una incisión vertical para abrir el área de la articulación. La cavidad articular está llena de líquido sinovial que probablemente gotea de la cavidad al realizar la incisión correcta. Continúe abriendo la articulación por completo mediante la eliminación de grasa excesiva, músculos y tendones, y cortando a través de los tendones que mantienen la articulación unida.Inspeccione cuidadosamente el cartílago en busca de cualquier daño macroscópico. Si el cartílago articular no tiene un aspecto liso más brillante o si hay evidencia, ampollas, hendiduras o defectos, deseche el cartílago y comience de nuevo. Usa un bisturí estéril para extraer el cartílago del hueso.Corte todo el camino hasta el hueso subcondral para eliminar el cartílago de la zona profunda. Recoger las rodajas de cartílago retiradas en tubos de 50 mililitros que contienen solución de lavado de cartílago previamente preparada. Mientras se procesa, gotee regularmente la solución de lavado de cartílago en el cartílago para evitar que el cartílago se seque.Después de recoger el cartílago de todas las áreas de interés, congela las rodajas de cartílago en nitrógeno líquido durante cinco minutos. Luego transfiera las rodajas de cartílago en tubos de 50 mililitros e inmediatamente coloque las rodajas congeladas en un secador de congelación. Liofilizar las rodajas de cartílago durante 24 horas con el secador de congelación.Cuando haya terminado, guarde las rodajas de cartílago liofilización en un lugar seco a temperatura ambiente. Para el procesamiento manual, precalar un mortero y peste con nitrógeno líquido, luego coloque las rodajas de cartílago liofilizado en el mortero y sumerjalas y nitrógeno líquido. Moler directamente las muestras a mano durante aproximadamente 45 minutos hasta que estén suficientemente pulverizadas.Alternativamente, para moler las muestras automáticamente utilizando una fresadora, comience por preenfriar el compartimiento de molienda de la fresadora mediante la adición de nitrógeno líquido. A continuación, agregue las rodajas de cartílago liofilizado y mida la muestra a su velocidad preestablecida durante unos segundos hasta un minuto. Asegúrese de que todas las partículas estén molidas y de que no haya partículas en la parte inferior del compartimiento de molienda.Por último, siga la técnica de descelularización descrita en el protocolo de texto adjunto antes de formar andamios. Transfiera las partículas de cartílago con una pequeña etiqueta a un molde de plástico cilíndrico. Presione todas las burbujas de aire hacia fuera para evitar las cavidades en el andamio y llenar el molde por completo.Para evitar caries en los andamios, asegúrese de que las burbujas de aire se presionan hacia fuera mientras llena el molde con partículas de cartílago. Después de la formación, congelar el molde durante 10 minutos a menos 20 grados Centígrados. Luego liofilizar los andamios de cartílago dentro del molde durante 24 horas en un secador de congelación.Después de la liofilización, retire cuidadosamente el andamio del molde. Coloque el andamio debajo de una luz UV de longitud de onda de 365 nanómetros y úntelo durante la noche. Forme discos de andamios cortando andamios esterilizados en rodajas de tres milímetros de espesor.A continuación, transfiera los andamios a pozos separados de una placa de seis pozos. Añadir un mililitro de Chondrocyte Expansion Medium en la parte superior de los andamios y dejar que se rehidraten durante 30 minutos. Mientras los andamios se rehidratan, prepare las células y la pipeta 50 microlitros de la suspensión celular preparada en la parte superior del andamio pre remojo.Luego incuba el andamio durante una hora a 37 grados Centígrados. Cuando utilice condrocitos, asegúrese de que no se han expandido más allá del primer pasaje para minimizar el número de células diferenciadas. Después de una hora, devuelva la placa a la campana de cultivo y gire cuidadosamente el andamio.Pipetear los 50 microlitros restantes de suspensión celular en el andamio e incubar durante otra hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, añadir tres mililitros de medio a los pocósitos con andamios. Evite pipetear el medio directamente sobre los andamios y manipule la placa de cultivo suavemente para evitar el desprendimiento de las células.Devuelva la placa a la incubadora y a los andamios cedidos de células de cultivo a 37 grados centígrados. Se ha utilizado una combinación de tinción historlógica y cuantificación del ADN para demostrar que los métodos presentados en este artículo dan como resultado una descelularización suficiente del andamio del cartílago. Se encontró que los andamios resultantes no contenían células junto con niveles indetectables de ADN.También carecen de glicosaminoglicanos y son ricos en colágeno II.Aquí, la formación de neo matriz se observa en el andamio cedido con células madre mesenquimales que se cultivaron durante cuatro semanas. La formación de glicosaminoglicanos es abundante después de cuatro semanas. Después de intentar este procedimiento, es importante examinar si la descelularización se ha realizado correctamente, antes de usarla en cualquier aplicación.Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis bioquímico adicional como el analizador de manchas occidentales para responder preguntas específicas sobre la presencia de otros componentes como factores de crecimiento. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos exploraran estrategias para la regeneración del cartílago utilizando tejido descelularizado de fuentes alogénicas y singéneas. Siempre se deben tomar precauciones como el uso de una bata de laboratorio y guantes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video muestra el procedimiento de fabricación de microportadores derivados de matriz extracelular por electroaspersión. Estos microportadores simulan el microambiente específico del tejido nativo y son estables en modelos de cultivo celular in vitro en 3D a largo plazo.

Fabricación de bioandamios por electropulverización: una técnica para generar andamios de microportadores derivados de la matriz extracelular de tejido descelularizado

La reparación del cartílago representa un desafío médico no resuelto y los enfoques basados en células para diseñar el cartílago articular humano son una solución prometedora. Aquí, describimos los hidrogeles biomiméticos tridimensionales (3D) como una herramienta ideal para la expansión y maduración de los condrocitos articulares humanos.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

La matriz extracelular específica del tejido (ECM) es un mediador clave de la función celular. Este artículo describe métodos para la síntesis de espumas y microportadores que son estables en cultivo sin la necesidad de reticulación química para aplicaciones en 3D avanzados en modelos de cultivo celular in vitro o como matrices biodegradables pro-regenerativas puros ECM-derivado.

La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

Aquí presentamos, y protocolos de contraste dos utilizan para decellularize los tejidos de la planta: un enfoque de base de detergente y un libre de detergente. Ambos métodos dejan la matriz extracelular de los tejidos de la planta utilizada, que luego puede ser utilizada como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Este protocolo describe la producción de filamento de policaprolactona (PCL) con microesferas de ácido (PLA) de poliláctico incrustados que contienen matrices decellularized (DM) para la impresión 3D de ingeniería construcciones de tejidos estructurales.

Novedoso proceso para la impresión 3D Decellularized Matrices

El objetivo de este protocolo es la producción de fibras de la matriz extracelular todo destinados a la reparación de la herida que son adecuados para la evaluación preclínica como parte de un implante de andamio regenerativa. Estas fibras se producen por la cultura de los fibroblastos en las membranas de fibra hueca y extraídas por disolución de las membranas.

Producción de fibras de la matriz extracelular mediante cultivo de células de membrana de fibra hueca sacrificio

Este protocolo describe el ensamblaje de un andamio de nanomatriz de base Janus (JBNm) capa por capa agregando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 y factor de crecimiento transformante beta-1 (TGF-β1) secuencialmente. El JBNm fue fabricado y caracterizado; Además, mostró una excelente bioactividad, fomentando funciones celulares como la adhesión, proliferación y diferenciación.

Fabricación y caracterización de la nanomatriz base Janus capa por capa para promover la regeneración del cartílago

En este trabajo se presenta un nuevo método para la síntesis de hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado (DC-ECM). Los hidrogeles DC-ECM tienen una excelente biocompatibilidad y proporcionan un microambiente superior para el crecimiento celular. Por lo tanto, pueden ser andamios celulares ideales y sistemas de administración biológica.

Síntesis de hidrogeles de matriz extracelular de cartílago descelularizado

La matriz de bazo descelularizada (DSM) tiene aplicaciones prometedoras en el campo de la ingeniería de tejidos hepáticos. Este protocolo describe el procedimiento para preparar el DSM de rata, que incluye la recolección de bazo de rata, la descelularización de los mismos mediante perfusión y la evaluación del DSM resultante para confirmar sus características.

Fabricación de matriz de bazo descelularizada derivada de ratas

Este protocolo describe la fabricación de construcciones óseas 3D utilizando osteocitos humanos incrustados en hidrogelatinas metacriladas (GelMA) suplementadas con matriz extracelular descelularizada. El método es de bajo coste, escalable y compatible con equipos básicos de laboratorio, proporcionando una plataforma traslacional para estudiar los procesos de enfermedad musculoesquelética.

Una plataforma de cultivo óseo 3D que utiliza osteocitos humanos y matriz extracelular descelularizada para modelar enfermedades musculoesqueléticas

Aprende a fabricar andamios descelularizados derivados de cartílago nativo para ingeniería de tejidos y regeneración articular. Este método preserva la matriz extracelular para promover la formación de cartílago in vitro e in vivo.

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

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