Name: Diferenciación de células madre de nervio por un solo Plasma atmosférico frío tratamiento In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende a diferenciar células madre neuronales usando plasma atmosférico frío in vitro. Este método de un solo paso mejora la diferenciación segura para trasplantes y ofrece potencial en el tratamiento de enfermedades neurológicas como el Parkinson.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el programa Huazhong, el fondo de innovación independiente de la Universidad Huazhong de ciencia y tecnología (Nº 2018KFYYXJJ071) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (núms. 31501099 y 51707012).

1. culturas y Predifferentiation de la célula
<ol><li>
Predifferentiation y cultivo de células madre neuronales
	<ol>
<li>Preparar el cubreobjetos de poly-D-lisina-revestida. Poner un cubreobjetos estéril (20 mm de diámetro) en una placa de 12 pozos. Capa del cubierta de vidrio con poly-D-lisina, 0.1% w/v, en el agua (Tabla de materiales) para mejorar la adherencia de la célula en el cubreobjetos siguiendo los siguientes pasos. Nota: Las condiciones óptimas se deben determinar para cada línea celular y la aplicación.<ol>
<li>Cubra asépticamente la superficie del cubreobjetos con poly-D-lisina, 0.1% w/v, en el agua. Rock suavemente para asegurar un recubrimiento uniforme de la superficie del cubreobjetos.</li>
			<li>Después de cultivo durante la noche (~ 12 h) a 37 ° C, retirar la solución de poly-D-lisina y enjuague la superficie 3 x con 1 mL de agua estéril.</li>
			<li>Secar la células por lo menos 30 min antes de sembrarlos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Predifferentiation y células neuronales murinas C17.2 (C17.2-NSC) cultura
	<ol>
<li>Incubar C17.2-NSC en un matraz de 25 cm2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 5% de suero de caballo (TA) y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 ° C y 5% CO2 para d ~ 2-3.</li>
		<li>Cuando las células alcanzan el 85% de confluencia, quitarlo del medio, lavan las células con 1 mL de PBS y añadir 1 mL de tripsina fresco (0,25%) en el matraz. Dejar durante 1 minuto; Luego, añadir 1 mL de medio de cultivo y el matraz pipeta arriba y abajo varias veces para asegurar una suspensión unicelular.</li>
		<li>Contar la densidad de las células en la suspensión usando un hemocitómetro. Calcular el volumen requerido de la suspensión celular para obtener una concentración celular final de 2 x 104 células/mL.</li>
		<li>Semilla C17.2-NSC en el cubreobjetos recubierto de la placa de 12 pozos con la densidad de 2 x 104 células por pocillo. Comprobar la densidad de células bajo un microscopio. Nota: Para un mejor resultado, la densidad celular óptima debe ser determinada antes del experimento de inmunofluorescencia.</li>
		<li>Incube las células a 37 ° C en un incubador celular durante 12 h permitir el accesorio.</li>
		<li>Después de la fijación, se lavan las células 2 x con 1 mL de PBS y cultivar las células con medio de diferenciación que consiste en DMEM/F12 con suplemento de 1% N2 48 h antes del tratamiento de plasma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Predifferentiation y cultura de célula madre neuronal primaria rata
	<ol>
<li>La suspensión primaria rata NSC en medio de crecimiento de rata NSC sin recubrimiento T25 los matraces en una densidad de 5 x 105 células de cultivo. Nota: La rata principal NSC fue aislado siguiendo el protocolo de Xie et al. 9.</li>
		<li>Compruebe la formación de neuroesferas bajo un microscopio invertido. Asegúrese de que la morfología de las neuroesferas exhibe complejos multicelulares esféricos y transparentes.</li>
		<li>Cuando las neuroesferas alcanzan un diámetro de 3 mm o más grande, transfiera la suspensión desarrolló a un tubo de centrífuga estériles de 15 mL y dejar que las neuroesferas asentarse por gravedad.</li>
		<li>Quite el sobrenadante con cuidado para dejar las neuroesferas en un volumen mínimo de medio.</li>
		<li>Enjuague las neuroesferas 1 x con 5 mL de PBS y dejar que las neuroesferas asentarse por gravedad. Quite el sobrenadante para dejar un volumen mínimo de PBS.</li>
		<li>Añadir un volumen adecuado de medio de diferenciación para ajustar la densidad celular a neuroesferas ~ 12-15 por mililitro. El medio de la diferenciación de primario rata NSCs consiste en DMEM/F12, 2% B27 y 1% FBS.</li>
		<li>Sembrar 1 mL de la suspensión de desarrolló en cada cubreobjetos recubierto de la placa de la pozo 12. Nota: Agitar la placa suavemente para asegurar que las neuroesferas se distribuyen uniformemente. Este paso es vital para un mejor resultado de la inmunofluorescencia.</li>
		<li>Coloque la placa en la incubadora y deje que se predifferentiate durante 24 h antes del tratamiento de plasma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de los chorros de Plasma
<ol><li>Elija un tubo de cuarzo de mitad-abren con un diámetro interno de 2 mm y un diámetro exterior de 4 mm. insertar un cable de alta tensión con un diámetro de 2 mm en el tubo.</li>
	<li>Inserte el tubo de cuarzo con el cable de alta tensión en una jeringa de 5 mL y utilice un soporte para montar dentro del centro de la jeringa. Ajuste la distancia entre el extremo sellado del tubo de cuarzo y la punta de la jeringa a 1 cm.</li>
	<li>Conectar un tubo de goma de silicona de 1 m (con un diámetro interior de 12 mm) con el extremo abierto de la jeringa y, a continuación, conecte a la válvula de gas y medidor de caudal en secuencia.</li>
</ol>3. adquisición de los chorros
<ol><li>Conecte el circuito como se muestra en la figura 1. Conecte el cable de salida de la fuente de alimentación para el dispositivo de chorro de plasma y, a continuación, conecte la punta de la sonda de alto voltaje con el cable de salida para detectar la tensión. Conecte el otro extremo de la sonda de alto voltaje en el osciloscopio para registrar la información de la tensión de salida. Controlar todo el circuito y que la fuente de alimentación, osciloscopio y la sonda de alto voltaje se basan.</li>
	<li>Compruebe la línea de gas. Asegúrese de que el tubo de gas se ha conectado el dispositivo de chorro de plasma; a continuación, abra la válvula de gas del helio (fracción de volumen, 99.999%) y oxígeno (fracción de volumen, 99.999%) y ajuste el flujo de gas a 1 L:0.01 L/min (: O2). Nota: Deje que el flujo de gas durante varios minutos antes de encender la fuente de alimentación por primera vez.</li>
	<li>Establecer la amplitud de pulso, la frecuencia y la anchura de pulso como 8 kV, 8 kHz y 1600 ns, respectivamente. Vuelva a comprobar el circuito y, a continuación, gire el botón de salida para crear un chorro de plasma. PRECAUCIÓN: No toque el cable de alta tensión en cualquier momento.</li>
</ol>4. plasma tratamiento de células madre neuronales
<ol><li>Establecer la distancia entre la boquilla de la jeringa y el agujero bien celular a 15 milímetros. Nota: La distancia se mide desde la parte inferior de la plataforma donde se coloca la placa de 12 pozos.</li>
	<li>Tomar la placa de 12 pozos fuera de la incubadora y cambiar el medio de las células predifferentiated a 800 μl de medio fresco de diferenciación.</li>
	<li>Las células se dividen en tres grupos: un grupo control sin tratar, una 60 s y O2 (1%) gas flujo tratamiento grupo y un grupo de tratamiento de plasma s 60. Nota: No es ninguna pérdida obvia de líquido bajo la condición de tratamiento.</li>
	<li>Coloque la placa de la pozo 12 bajo los chorros de plasma, asegúrese de que la boquilla de la jeringa se fija en el centro de cada agujero y dar el tratamiento correspondiente a los diferentes grupos mencionados en el paso 4.3. Nota: Los controles no tratados se mantuvieron en medio de la diferenciación a temperatura ambiente durante el procedimiento experimental para condiciones de tratamiento uniforme. El grupo de tratamiento y O2 (1%) gas flujo fue tratado con sólo un He y flujo de gas O2 (1%), sin generación de plasma. Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado.</li>
</ol>5. diferenciación de la célula de vástago nervios
<ol><li>Después del tratamiento, retire la cultura original y añadir 1 mL de nuevo medio de diferenciación a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar las células en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 para 6 d. cambiar el medio cada día.</li>
	<li>Comprobar el estado de diferenciación de los diferentes grupos diariamente bajo un microscopio óptico de contraste de fases invertido. Al azar seleccione por lo menos 12 campos y tomar fotos para grabar los cambios morfológicos.</li>
</ol>6. tinción de inmunofluorescencia
<ol><li>
Enjuague
	<ol>
<li>Tomar las muestras fuera de la incubadora de la célula y quitarlo del medio por la aspiración. Enjuague las células 1 x con 1 mL de PBS. Nota: Después de la diferenciación, las células son separadas fácilmente. Es necesario añadir PBS desde el lado de los pozos de la cultura para evitar el lavado de las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fijación
	<ol>
<li>Fijar las células con 500 μl de paraformaldehído al 4% por 20 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, enjuague suavemente las células de 3 x con 1 mL de PBS, 5 minutos cada uno, para eliminar lo residuos paraformaldehído al 4%. Nota: El momento óptimo para la fijación de la célula debe determinarse según los tipos de células. Después de la fijación, añadir 1 mL de PBS desde el lado de los pozos de la cultura y deja la muestra en la tabla por 5 min. No utilice un agitador de laboratorio, para asegurar una mínima pérdida de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilización
	<ol>
<li>Permeabilizar las muestras con 0.2% TritonX-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de permeabilización, enjuague las células con 1 mL de PBS para tres veces, 5 minutos cada uno. Nota: Se determinará el momento óptimo para permeabilización de células según los tipos de células. Después de permeabilización, añadir 1 mL PBS desde el lado de los pozos de la cultura, deje la muestra en la tabla por 5 min. No utilice un agitador de laboratorio para garantizar la mínima pérdida de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloqueo
	<ol>
<li>Añadir 1 mL de suero de cabra 10% en PBS a cada muestra y deja la muestra en la tabla para 1 h de bloquear las interacciones no específicas. Nota: No utilice un agitador de laboratorio, para evitar que las células de extracción de la diapositiva. Un enjuague no es necesario en este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubación con el anticuerpo primario
	<ol>
<li>Diluir el anticuerpo primario con tampón de dilución del anticuerpo primario. Nota: Para obtener resultados óptimos, debe determinarse la relación de la dilución final del anticuerpo primario por antes de la prueba. Las proporciones de dilución de nestina anti (para células madre no diferenciadas), anti-β-tubulina III (neurona), anti-O4 (de oligodendrocyte), anti-NF200 (de neuronas maduras), anti-ChAT (neuronas colinérgicas), anti-LHX3 (para las neuronas motoras), anti-GABA (para Las neuronas de GABAergic), anti-serotonina (para las neuronas serotonergic) y anti-TH (para las neuronas dopaminérgicas) son de 1: 80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 y 1: 100, respectivamente.</li>
		<li>Aplican 300 μL del diluido anticuerpos primarios a diferentes muestras.</li>
		<li>Incubar las muestras de células durante la noche a 4 ° C. Nota: Se recomienda incubar los anticuerpos primarios a 4 ° C para reducir el fondo y la tinción inespecífica.</li>
		<li>Quite los anticuerpos primarios y enjuague suavemente las células 3 x con 1 mL de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubación con el anticuerpo secundario
	<ol>
<li>Diluir los anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 o conjugados con Alexa Fluor 488 utilizando suero de cabra 3% en PBS. Nota: Para obtener resultados óptimos, la relación de la dilución final del anticuerpo secundario debe ser determinada por la prueba preliminar.</li>
		<li>Aplicar 300 μL de anticuerpos secundarios relevantes para detectar cada anticuerpo primario. Nota: Todos los pasos posteriores deban realizarse en la oscuridad para evitar la fluorescencia que apaga.</li>
		<li>Incubar la muestra de células en la oscuridad durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Quite los anticuerpos secundarios y enjuague las células con 1 mL de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción nuclear
	<ol>
<li>Aplicar 500 μl de solución de trabajo de Hoechst 33258 para sumergir la muestra de células.</li>
		<li>Incubar la muestra de células en la oscuridad durante 8 min a temperatura ambiente para los núcleos de la etiqueta.</li>
		<li>Enjuague suavemente las células de 3 x con 1 mL de PBS, 10 minutos cada uno, protegidos de la luz. Nota: Para una mínima pérdida de células, la condición de lavado óptima debe ser determinada empíricamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje
	<ol>
<li>Coloque una gota de medio de montaje en el centro de la microslide.</li>
		<li>Retirar el cubreobjetos (con muestras) con unas pinzas y con cuidado, coloque la muestra sobre el medio de montaje. Evitar las burbujas de aire.</li>
		<li>Retire cualquier medio de montaje exceso con papel absorbente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observación de la microscopia de fluorescencia
	<ol>
<li>Observar las muestras en la microscopía de fluorescencia, equipado con filtros para Hoechst 33258 y Alexa Fluor 488 Cy3. Para cada muestra, seleccionar al azar por lo menos 8-12 campo y grabar imágenes con una cámara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li>
<li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases%3A+dreams+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).</li>
<li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Physics+and+Controlled+Fusion%22%5BJournal%5D)">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).</li>
<li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+Plasma%3A+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li>
<li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure%3A+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li>
<li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Treatment+of+Onychomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plasma+Processes+and+Polymers%22%5BJournal%5D)">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li>
<li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li>
<li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huazhong+University+of+Science+and+Technology.+%5BMed+Sci%5D%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li>
<li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li>
<li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Fixatives+for+Immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

C17.2-NSC es una especie de línea de células neuronales inmortalizadas de células de la capa granular cerebelosa de ratón neonatal, desarrollado por Snyder y otros10,11. C17.2-NSC puede diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y es ampliamente utilizado en Neurociencia12. En nuestro estudio anterior, tapas podrían mejorar la diferenciación de NSCs C17.2 en neuronas. Un estudio de prueba de principio también llevó a cabo uti...

La diferenciación dirigida de NSC en un cierto linaje para el transporte de tejido es considerada uno de los más prometedores tratamientos para enfermedades de neurodegenerative y neurotraumatic1. Por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas catecolaminérgica se desean especialmente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, los métodos tradicionales para preparar las células deseadas para el transporte tienen muchos inconvenientes, tales como toxicidad química, formación de la cicatriz u otros, que dificulta en gran medida las aplicaciones de NSCs en medicina regenerativa2. Por lo tanto, es muy necesario encontrar una manera novedosa y segura para la diferenciación de la NSC.
El plasma es el cuarto estado de materia, siguiente sólido, líquido y gas, y constituye más del 95% de casos en todo el universo. Plasma es eléctricamente hilo neutro positivos o negativos y partículas neutras y normalmente es generado por una descarga de alto voltaje en el laboratorio. En las últimas dos décadas, la aplicación de plasma en biomedicina ha atraído gran atención en todo el mundo como el desarrollo de la tecnología de plasma frío la presión atmosférica. Gracias a esta técnica, plasma de baja temperatura estable se puede generar en el aire en la atmósfera sin la formación de arco y consta de diversas especies reactivas, tales como las especies reactivas del nitrógeno (RNS), especies reactivas del oxígeno (ROS), ULTRAVIOLETA (UV) radiación, electrones, iones y campo eléctrico3. Tapas tienen ventajas únicas para la inactivación de microorganismos, terapia del cáncer, de heridas, tratamiento de enfermedades de la piel, la proliferación celular y diferenciación celular4,5,6,7. En trabajos previos, hemos demostrado que chorro de plasma atmosférico frío puede mejorar la diferenciación de NSCs en células neuronales murinas C17.2 (C17.2-NSC) y las células madre neurales primarios de rata, exhibiendo un gran potencial para convertirse en una poderosa herramienta para la dirección diferenciación de NSCs8. Aunque el mecanismo de mejora de la tapa de la diferenciación del NSC no se entiende completamente sin embargo, NO generado por los casquillos ha demostrado para ser un factor clave en el proceso. En este trabajo, nuestro objetivo es proporcionar un protocolo experimental detallado del uso de un plasma de helio/oxígeno de presión atmosférica jet para el tratamiento de NSCs en vitro, preparación de la célula y tratamiento previo, observación de morfología por microscopio invertido, y observación de la microscopia de fluorescencia de la tinción de inmunofluorescencia.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>almacenado a 4 & grados; El suplemento de C</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>almacena a -20 &deg; C y proteger de la luz</td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>almacenado a -20 &deg; C y proteger de la luz</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>almacenado a -20 &deg; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>Suero de caballo donante</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td><td>torado a -20 &deg; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>de Penicilina/Estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>almacena a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>almacena a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Solución</td><td>PBS HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>almacenada a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>almacenado a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución Bloqueadora de Suero de Cabra Normal</td><td>Laboratorios Vector</td><td>S-1000-20</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td><td>almacenado a -20 &deg; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-&beta;-Tubulin III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>almacenado a -20 &deg; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-O4</td><td>R& Los sistemas D</td><td>MAB1326</td><td>almacenan a -20 &° C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-NF200</td><td>Sigma</td><td></td><td>almacenado a -20 & grados; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-ChAT</td><td>Sigma</td><td></td><td>almacenado a -20 & grados; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-LHX3</td><td>Sigma</td><td></td><td>almacenado a -20 & deg; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma</td><td></td><td>almacenado a -20 & grados; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-serotonina</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>almacenado a -20 & grados; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>anti-TH</td><td>Abcam, Cambridge, MA</td><td></td><td>almacenado a -20 & grados; C, evite la congelación y descongelación repetidas</td></tr><tr><td>Tampón de dilución de anticuerpos primarios de tinción inmunológica</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Cy3 Etiquetado Cabra Anti-Conejo IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>almacenado a -20 &deg; C y proteger de la luz</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- Etiquetado Cabra</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>almacenado a -20 &deg; C y proteger de la luz</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>matraz de 25 cm2</td><td>corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>almacenado a -20 ° C y proteger de la luz</td></tr><tr><td>Medio de montaje</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>almacenado a -20 &deg; C y proteger de la luz</td></tr><tr><td>Microscopio</td> óptico <td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía de fluorescencia</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de potencia de alto voltaje</td> Energía <td>dirigida</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de CC</td><td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>Generador de funciones</td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Tektronix DPO3034</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda de alto voltaje</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación de células madre de nervio por un solo plasma atmosférico frío tratamiento in vitro

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Como el desarrollo de la tecnología de plasma físico, frío atmosféricos plasmas (CAPs) han sido ampliamente investigados en descontaminación, tratamiento contra el cáncer, la cicatrización de heridas, tratamiento de conducto, etc., formando un nuevo campo de investigación llamado medicina del plasma. Siendo una mezcla de especies reactivas eléctricas, químicas y biológicas, casquillos han demostrado sus habilidades para mejorar la diferenciación de las células madre de nervio tanto en vitro y en vivo y se está convirtiendo en un camino prometedor para el tratamiento de la enfermedad neurológica en el futuro. La noticia más emocionante es que usando tapas de puede realizar un solo paso y dirigido con seguridad, diferenciación de las células madre neurales (NSC) para el transporte de tejido. Aquí demostramos el protocolo experimental detallado usando un dispositivo de tapa jet hecho a sí mismo para mejorar la diferenciación de la NSC en C17.2 NSCs y las células madre neurales primarios de rata, así como el destino de la célula por invertida y microscopía de fluorescencia. Con la ayuda de la inmunofluorescencia que manchaba la tecnología, encontramos tanto las NSCs mostró un ritmo acelerado de la diferencia que el grupo no tratado, y ~ 75% de las NSCs selectivamente diferenciado en neuronas, que son principalmente maduros, colinérgicos y motor neuronas.

Morfología de la célula se observó bajo el microscopio invertido cada día después del tratamiento de la tapa. La figura 2 muestra las imágenes de microscopio invertido de contraste de fase ordinaria de la diferenciación celular en ambas líneas celulares. El grupo tratado con plasma exhibe una tasa de diferenciación acelerada y una relación de alta diferenciación en comparación con el grupo de flujo de gas y control.
<p class="jove_conten...

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar pasos experimentales detallados de un tratamiento de plasma atmosférico frío sobre las células madre neurales y detección de inmunofluorescencia para la mejora de la diferenciación.

Diferenciación de células madre de nervio por un solo Plasma atmosférico frío tratamiento In Vitro

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Este método tiene el potencial de mejorar la diferenciación de las células madre neurales in vitro y contribuir al tratamiento de enfermedades neurológicas como la enfermedad de Parkinson. Las principales ventajas de esta técnica es que los plasmas atmosféricos fríos se pueden aplicar en un solo paso para la diferenciación dirigida segura de las células madre neurales para el trasplante de tejido. El plasma atmosférico frío puede mejorar la diferenciación de las células madre neurales en un corto período de tratamiento.Y con la necesidad de más daño a las células, proporcionando las células deseadas para el trasplante. Comience por sembrar unas cinco veces diez hasta la quinta célula madre neural murina en un matraz cuadrado de 25 centímetros. Contiene cinco mililitros de DMEM completo durante dos o tres días a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono.Cuando las células alcancen el 85 por ciento de confluencia, lave el cultivo con un mililitro de PBS. Antes del tratamiento, con un mililitro de 25 por ciento de trippsina durante un minuto. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con un mililitro de medio de cultivo.Y pipeta varias veces para generar una sola célula de suspensión. Después de contar, diluir las células a dos veces diez a las cuartas células por mililitro de concentración. Semilla de un mililitro de células madre en un resbalón de cubierta recubierto de poli-D-lisina por pozo en nueve pozos de una placa de cultivo celular de 12.Compruebe la densidad celular bajo un microscopio. Y devolver las células a la incubadora durante 12 horas. Cuando las células se hayan unido, lave los resbalones de la cubierta dos veces con un mililitro de PBS por lavado, y trate las células con un medio de diferenciación durante 48 horas.Para la adquisición de chorro, conecte primero el cable de salida de la fuente de alimentación al dispositivo de chorro de plasma. Y la punta de la sonda de alto voltaje con el cable de salida para detectar el voltaje. A continuación, conecte el otro extremo de la sonda de alto voltaje al osciloscopio para registrar la información de la tensión de salida.Compruebe todo el circuito para asegurarse de que la fuente de alimentación, el osciloscopio y la sonda de alto voltaje estén conectadas a tierra. Y revise la línea de gas para asegurarse de que el tubo de gas está conectado al dispositivo de chorro de plasma. A continuación, abra las válvulas de gas de helio y oxígeno y ajuste el flujo de gas a una relación de 01 litros a 01 litros por minuto de helio a oxígeno.Compruebe el circuito de nuevo y pulse el botón de salida para crear un chorro de plasma. Para tratar plasma las células madre neurales, establezca la distancia entre la boquilla de la jeringa y el primer pozo de células en 15 milímetros. Sustituya los sobrenadantes en los cultivos de células madre neurales por 800 microlitros de medio de diferenciación fresco.Y coloque la placa debajo de los chorros de plasma. Asegurarse de que la boquilla de la jeringa esté fijada sobre el centro de cada pozo. Cree tres pozos con plasma durante 60 segundos por tratamiento, y tres pozos con un uno por ciento de helio y gas de oxígeno durante 60 segundos por tratamiento.Dejando tres pozos sin tratar, como controles. A continuación, sustituya los sobrenadantes por un mililitro de medio de diferenciación fresco. Y devolver las células a la incubadora durante seis días.Compruebe el estado de diferenciación de los diferentes grupos diariamente, bajo un microscopio de luz de contraste de fase invertida. Después del tratamiento, deje que las células se equilibren completamente en el medio de la condición durante aproximadamente una hora antes de reemplazar el sobrenadante por un medio de diferenciación fresco. Para el análisis de inmunofluorescencia, fije los cultivos con 500 microlitros de paraformaldehído cuatro por ciento per pozo durante 20 minutos a temperatura ambiente.Seguido de tres suaves enjuagues de cinco minutos, con un mililitro de PBS por lavado. A continuación, permeabilizar las muestras fijas con 2 por ciento Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Seguido de suave enjuague como se demuestra.Después del último lavado, bloquee cualquier unión no específica con un mililitro de 10 por ciento de suero de cabra en PBS por muestra durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, etiquete las células en cada pozo con 300 microlitros del anticuerpo primario de interés durante la noche a cuatro grados centígrados. Seguido de tres lavados en PBS como se demuestra.Después del último lavado, etiquete las células con 300 microlitros de los anticuerpos secundarios apropiados. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente, protegida de la luz. Luego enjuague las células suavemente con un mililitro de PBS por pozo durante diez minutos a temperatura ambiente.Imagen de las células en un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros adecuados. Las células madre neurales tratadas con plasma presentan una tasa de diferenciación acelerada y una mayor relación de diferenciación en comparación con el control no tratado, y las células madre tratadas con flujo de gas. Después del tratamiento plasmático, Nestin disminuye.Beta-Tubulin III aumenta significativamente. Y O4 aumenta ligeramente, en comparación con las células madre tratadas con control y el flujo de gas. Además, después de 60 segundos de tratamiento plasmático, se observa una expresión robusta de neurona madura, neurona colinérgica, y marcadores de neuronas motoras.Con muy pocas neuronas GABAérgicas y serotonérgicas, y no se detectan neuronas dopaminérgicas. Al intentar estos procedimientos, es importante recordar, tratar las células con la dosis plasmática adecuada, porque un largo e intenso período de tratamiento plasmático inducirá apoptosis celular o necrosis. Recuerde también probar previamente la viabilidad de la célula antes de la aplicación posterior.

nerve-stem-cell-differentiation-one-step-cold-atmospheric-plasma

Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

Este video demuestra la diferenciación de células madre embrionarias humanas, o hESCs, directamente en células progenitoras neurales sin usar células alimentadoras ni ningún paso intermedio. La inhibición selectiva de la proteína morfogenética ósea o BMP y las vías de señalización del factor de crecimiento transformante beta, o TGF-β, conducen a la diferenciación de las hESC en células progenitoras neurales, o NPC.

Diferenciación de células madre embrionarias humanas en progenitores neurales

Este video presenta un método para desencadenar la diferenciación en células madre neurales mediante la utilización de plasma atmosférico frío. Esto genera radiación UV y moléculas reactivas para estimular a las células nerviosas para que produzcan proyecciones, lo que indica la diferenciación de las células neuronales.

Estimulación de la diferenciación de las células madre nerviosas mediante el tratamiento con plasma atmosférico frío

Este video demuestra el proceso de generación de células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) a partir de células madre embrionarias humanas, seguido de la maduración de OPCs a oligodendrocitos. Este proceso de generación de oligodendrocitos abre numerosas vías para mejorar la investigación y el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, incluido el Alzheimer.

Diferenciación de células madre embrionarias humanas en oligodendrocitos

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

La generación de tipos de células diferenciadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) tiene una gran promesa terapéutica, pero sigue siendo un desafío. Los PSC a menudo exhiben una incapacidad inherente para diferenciar incluso cuando se estimulan con un conjunto adecuado de señales. Aquí se describe una herramienta sencilla para mejorar la diferenciación multilínea en una variedad de líneas PSC.

Tratamiento transitorio de células madre pluripotentes humanas con DMSO para promover la diferenciación

Aquí se presenta un protocolo para la generación de un cultivo de una sola célula de células madre embrionarias humanas y su posterior diferenciación en células progenitoras neuronales. El protocolo es simple, robusto, escalable y adecuado para aplicaciones de detección de drogas y medicina regenerativa.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

Aquí, establecimos un método de bajo costo y fácil de operar que dirige la diferenciación rápida y eficiente de las células madre embrionarias a las neuronas. Este método es adecuado para la popularización entre laboratorios y puede ser una herramienta útil para la investigación neurológica.

Diferenciación neuronal de las células madre embrionarias del ratón in vitro

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Aprende a diferenciar células madre neuronales usando plasma atmosférico frío in vitro. Este método de un solo paso mejora la diferenciación segura para trasplantes y ofrece potencial en el tratamiento de enfermedades neurológicas como el Parkinson.

Diferenciación de células madre de nervio por un solo Plasma atmosférico frío tratamiento In Vitro

Explorar más videos