Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino
November 21st, 2018
Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.
El medido que se utiliza para realizar la secuenciación eficiente de ChIP de proteínas ésteres y no éster en el tejido lípido marrón aislado de ratón. La principal ventaja de la técnica es que el protocolo se ha optimizado para la inmunoprecipitación eficiente del complejo asociado a la cromatina desde el tejido lipídico. Antes de la incisión, rocíe el ratón eutanizado con 70%etanol.
Coloque el ratón con la espalda hacia arriba, luego haga una incisión a lo largo del cuello. A continuación, se encuentra BAT directamente debajo de la piel entre los hombros y eliminar cuidadosamente la fina capa de grasa blanca. Enlace cruzado de cada almohadilla BAT en 10 mililitros de PBS que contiene 1%formaldehído durante 15 minutos a 150 RPM a temperatura ambiente.
Después de 15 minutos, aprieta la reticulación mediante la adición de 2,5 glicina molar al BAT, lo que resulta en una concentración final de 125 milimolar. Colóquelo en una coctelera durante cinco minutos, girando a 150 RPM a temperatura ambiente. Posteriormente, transfiera la almohadilla BAT a 500 microlitros de tampón de lysis hipotónica y agregue dos perlas de acero inoxidable para cada almohadilla BAT.
Luego, usa un homogeneizador de tejido a base de cuentas para triturar el tejido. Comience con cinco minutos a máxima potencia. Si es necesario, extienda el tiempo hasta que el tejido se homogeneice y se separen las células individuales.
Transfiera la muestra a un tubo nuevo y centrifugar a cuatro grados centígrados a 16.000 G durante 10 minutos. Después de 10 minutos, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y mantenga el pellet celular sobre hielo. Centrifugar el sobrenadante a cuatro grados centígrados a 16.000 G durante 10 minutos para evitar la pérdida de células flotantes.
Luego, deseche el sobrenadante final y vuelva a suspender ambos pellets celulares juntos en 300 microlitros de tampón de lelisis SDS con un inhibidor de la proteasa una vez. Incubar sobre hielo durante 10 minutos. A continuación, sonicar los lysates para generar fragmentos de ADN de 200 a 500 pares base de largo.
Después de la sonicación, retire los escombros por centrifugación durante 10 minutos a 16.000 G a cuatro grados centígrados. Para realizar la inmunoprecipitación, mantenga el 1% de la solución de cromatina a un lado como la entrada ChIP y mantenga las entradas durante la noche en cuatro grados centígrados. A continuación, añada el anticuerpo ChIP a un mililitro de solución de cromatina y realice inmunoprecipitación paralela con el Correspondiente IgG preinmune o IgG normal de la misma especie.
Alternativamente, guarde un mililitro de solución de cromatina para un control sin anticuerpos. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con rotación. Para recoger los complejos inmunológicos, añadir 50 microlitros de proteína A agarosa 50% lodo a los complejos inmunológicos e incubar durante una hora a cuatro grados Celsius con rotación a 150 RPM.
Después de una hora, peleciar las perlas por centrifugación durante un minuto a 1000 veces G a cuatro grados centígrados. Realice lavados secuenciales de las perlas en columnas de filtro centrífugo PVDF de 0,45 micrómetros con tampones de creciente rigurosidad transfiriendo primero las perlas en las columnas con 500 microlitros de tampón de lavado con bajo contenido de sal. A continuación, pelete las perlas en las columnas durante tres minutos a 2500 G.Deseche el flujo a través.
Repita el lavado con tampón de lavado con alto contenido de sal de acuerdo con los procedimientos de lavado con bajo contenido de sal. A continuación, repita los procedimientos con cloruro de litio y finalmente con una de las DOS. Una vez completados los lavados, eluía los complejos inmunes añadiendo 300 microlitros de tampón de elución a las perlas peletadas en las columnas. Incubarlos a temperatura ambiente durante 30 minutos en una coctelera a 400 RPM.
Posteriormente, recoger el elute girando hacia abajo las columnas durante tres minutos a 2500 G en un tubo fresco. Invierta los enlaces cruzados incubando el eluido y los insumos recogidos a 65 grados centígrados durante la noche. Para recuperar el ADN, agregue 300 microlitros de fenol cloroformo IAA al eluido y entradas en una relación uno a uno y vórtice durante 10 segundos.
A continuación, gire a 21.000 G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Conservar el pellet y desechar el sobrenadante. Lavar el pellet con un mililitro de etanol frío al 70%.
Luego gira a 21.000 G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet. Vuelva a suspender el pellet en 70 microlitros de agua libre de DNAse para procedimientos adicionales.
Aquí está un ejemplo de ChIP Q PCR usando BAT aislado de ratón wildtype o GPS2-A knockout. Dado que se ha descubierto que el GPS2 es necesario para la expresión de genes mitocondriales codificados nuclearmente en diferentes líneas celulares, el reclutamiento de GPS2 se probó en dos genes mitocondriales codificados nuclearmente específicos. NDUFV1 y TOMM20 en BAT de ratones como los ejemplos de un tejido altamente enriquecido en las mitocondrias.
La ocupación del promotor gps2 se comparó en ratones nocaut GPS2-A y compañeros de letras de tipo salvaje. Se observó una disminución esperada en la unión GPS2 a genes selectivos en el BAT de ratones noqueados GPS2-A. Usando el protocolo descrito aquí, una mayor unión de ARN polimerasa dos y la marca de histona represiva, H3K9ME3, se registró en el BAT GPS2-A knockout ratones en comparación con las compañeras de letras de tipo salvaje.
Estos resultados confirman el reclutamiento de GPS2 en determinados genes mitocondriales codificados nuclearmente y muestran que el GPS2 es necesario para prevenir la acumulación de H3K9ME3 y, por lo tanto, se requiere para detener la actividad de la transcripción del polo dos en los promotores objetivo. El protocolo descrito aquí, incluso si está específicamente optimizado para el tejido adiposo marrón, representa una herramienta valorada para realizar ChIP de otro tejido murino y humano. No olvide que trabajar con fenocloroformo puede ser extremadamente peligroso.
Por lo tanto, es extremadamente importante operar siempre bajo la campana de humos mientras se utiliza este reactivo.
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Visión general
Este artículo describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) eficiente seguida de secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) del tejido adiposo marrón (TAM) aislado de ratones. El método está optimizado para la inmunoprecipitación de complejos asociados a la cromatina, permitiendo el estudio de modificaciones de histonas y proteínas no histonas in vivo.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genómica
- Biología celular
Antecedentes
- La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una técnica utilizada para estudiar las interacciones proteína-ADN.
- La secuenciación de alto rendimiento permite el análisis a nivel genómico de estas interacciones.
- El tejido adiposo marrón juega un papel crucial en la termogénesis y el metabolismo energético.
- Entender la localización de proteínas en el TAM puede proporcionar información sobre los procesos metabólicos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para ChIP-seq en tejido adiposo marrón.
- Facilitar el mapeo de modificaciones de histonas.
- Investigar la localización de proteínas no histonas in vivo.
Métodos utilizados
- Aislamiento de tejido adiposo marrón de ratones eutanasiados.
- Unión cruzada de las almohadillas de TAM con formaldehído.
- Inmunoprecipitación de complejos asociados a la cromatina.
- Secuenciación de ADN de alto rendimiento para el análisis.
Resultados principales
- El protocolo captura exitosamente las proteínas asociadas a la cromatina del TAM.
- Las modificaciones de histonas se mapearon efectivamente en todo el genoma.
- Se analizó la localización de proteínas no histonas in vivo.
- El método demuestra alta eficiencia y reproducibilidad.
Conclusiones
- Este protocolo optimizado de ChIP-seq es una herramienta valiosa para estudiar el TAM.
- Mejora nuestra comprensión de la regulación metabólica en el tejido adiposo.
- Los hallazgos pueden tener implicaciones para la obesidad y los trastornos metabólicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Studying transcriptional regulation in physiologically relevant tissues like brown adipose tissue enables mechanistic de-risking of targets involved in metabolic pathways. This ChIP-seq protocol provides predictive confidence by mapping protein-DNA interactions in a disease-relevant system, supporting target validation and biomarker discovery in obesity and metabolic disorders. The approach enhances translational continuity from discovery to preclinical research by delivering quantitative, reproducible epigenomic data.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulators like GPS2 in brown adipose tissue to validate targets controlling mitochondrial gene expression.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess transcription factor binding and histone modifications in primary tissue.
- Strategic Value: Supports target de-risking by confirming functional occupancy at promoters of nuclear-encoded mitochondrial genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates genome-wide binding profiles of histone marks and transcription factors for epigenetic screening campaigns.
- Operational Value: Delivers standardized ChIP-seq workflow with quantitative DNA recovery for assay consistency.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness for screening compounds that modulate chromatin states in metabolic tissues.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links chromatin states to metabolic phenotypes by analyzing H3K9ME3 and RNA polymerase II occupancy in BAT.
- Operational Value: Enables cross-genotype comparison (wildtype vs. knockout) to assess target modulation effects.
- Strategic Value: Supports preclinical validation of mechanistic hypotheses in a physiologically relevant adipose depot.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing epigenomic readouts that inform target engagement and pathway modulation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transcriptional regulators in brown adipose tissue through direct protein-DNA interaction mapping.
- Screening: Produces quantitative ChIP-seq data enabling comparison of compound effects on chromatin states in primary tissue.
- Analytics: Yields genome-wide localization data and quantitative PCR validation for assessing target engagement and epigenetic changes.
- Translational Research: Connects epigenetic modifications in BAT to mitochondrial function and thermogenesis, relevant to metabolic disease progression.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable ChIP-seq platform applicable across murine and human tissues for metabolic target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct measurement of transcription factor binding and repressive histone marks in vivo.
- Operational Value: Standardized tissue processing and immunoprecipitation workflow ensuring reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in transcriptional regulation of metabolic genes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on chromatin occupancy and functional validation in disease-relevant tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology, tissue handling, and next-generation sequencing library preparation.
- Needs instrumentation for tissue homogenization, sonication, immunoprecipitation, and high-throughput DNA sequencing.
- Demands cross-team standardization for tissue collection, cross-linking, and antibody validation to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different tissue types due to variability in chromatin accessibility and cellularity.
- Includes practical limitations such as hazardous reagent handling (phenol-chloroform) and input tissue yield from murine brown adipose tissue.
