Un sistema reportero BW para el estudio de las interacciones Receptor-ligando
7 de enero de 2019
Este protocolo describe cómo establecer un sistema de reportero que puede utilizarse para identificar y cuantificar las interacciones receptor-ligando.
Shalom.The BW Reporter System permite estudiar las interacciones receptor-ligand. Es extremadamente útil en casos donde el ligando de un receptor específico es desconocido o en casos donde los experimentos con el ligando endógeno son técnicamente difíciles. Este método es sensible y específico para un receptor individual, fácil de operar y reproducible.
Demostrando el procedimiento estará Shira Kahlon, un postdoctorado para mi laboratorio. El día antes de la transfección, placa 10 placas con 10 mililitros de 100, 000 células BW5147, y complementar una RPMI. A continuación, coloque 100 microgramos del plásmido pcDNA3 en un tubo.
Añadir acetato de sodio a pH 5.3 al tubo. Después de esto, añadir 2,5 volúmenes de 100% etanol a la mezcla de plásmido. Luego incubar la mezcla de plásmido durante la noche a menos 20 grados centígrados.
24 horas después de enchapar las células BW, recoger las células en dos tubos de 50 mililitros. Luego centrifuga las células a 515 g durante cinco minutos, y deseche el sobrenadante. Resuspender la RPMI del pelotón sin adiciones y repetir la centrifugación.
Resuspender el pellet resultante en 1 mililitro de RPMI sin adiciones. Transfiera el pellet resuspendido a una cubeta de 4 centímetros sobre hielo. Centrifugar el plásmido que sufrió precipitación de etanol.
A continuación, lave el plásmido con un mililitro de 70% de etanol. Y repite la centrifugación por otros 20 minutos. Retire todo el etanol y deje que el pellet se seque parcialmente.
A continuación, resuspender el pellet en 100 microlitros de RPMI precalentado, sin adiciones. Después de esto, agregue el plásmido resuspendido a las células en la cubeta. Incubar las células sobre hielo durante cinco minutos.
A continuación, electropogrape las células. Luego transfiera las células electroporadas a un tubo de 50 mililitros. Añadir 50 mililitros de medio completo al tubo y centrifugar durante cinco minutos, a 515 g.
Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 50 mililitros de medio completo. Luego plato las células en platos de cultivo de 24 pozos, e incubar las células durante 48 horas. Después de esto, añadir un mililitro de medio completo, complementado con 10 miligramos por mililitro de G418 a cada pozo.
48 horas más tarde, deseche un mililitro del volumen superior de cada pozo. A continuación, añadir un mililitro de medio completo complementado con cinco miligramos por mililitro de G418 a cada pozo. Utilice 50.000 células BW transfectados con sus objetivos deseados, en un solo pozo de una placa de 96 pozos.
Incubar el plato durante 48 horas. A continuación, congele la placa a menos 20 grados centígrados. Recubrir una placa ELISA con anticuerpos antiratón IL-2.
Coloque 05 microgramos de IL-ratón antiratón, en un volumen de 50 microlitros de PBS en cada pozo. Incubar la placa recubierta durante la noche a cuatro grados centígrados. Utilice un breve período de incubación a 37 grados centígrados para descongelar las células BW congeladas, que previamente fueron incubadas con sus objetivos.
A continuación, centrifugar la placa, y transferir 100 microlitros del sobrenadante de cada pozo a la placa ELISA pre-recubierta. Y incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de esto añadir biotina anti-ratón IL-2 a la placa ELISA.
Después de la incubación y el lavado, agregue la estreptavidina conjugada con HRP al plato. Después de la incubación y lavado, añadir 100 microlitros de la solución de sustrato TMB, a cada pocillo de la placa ELISA. Finalmente lea la placa ELISA a 650 nanómetros.
En este ejemplo, las células CLL se pre-incubaron con diferentes anticuerpos anti-CD20. Y luego co-incubado con células BW transfectadas que expresan los receptores Fc CD16, antes de ser analizado con ELISA. Después del análisis con ELISA se cuantificaron los resultados.
Los niveles de densidad óptica, se convirtieron en concentraciones il-2 de ratón, basados en la curva estándar. En un experimento adicional, se pre-incubaron diferentes dosis de anticuerpos anti-CD20 con células CLL. Y luego incubado con las células BW transfectadas.
La partícula contiene cuatro partes principales. Clonación, transfección de células BW, activación y ELISA. Cada una de las piezas debe verificarse de forma independiente.
Después de este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales con células que expresan los receptores endógenos, como matar ácidos con células NK para estudiar las interacciones con receptores de células NK. Hemos utilizado este sistema para descubrir nuevos ligandos de receptores celulares NK. Por ejemplo, la hemaglutinina es un ligando de NKp46, y PVL es un ligando de TG.
Descripción general
Este artículo describe el Sistema BW Reporter, un método sensible y específico para estudiar las interacciones receptor-ligando, particularmente cuando el ligando es desconocido o difícil de manipular. El sistema utiliza células mouse BW5147 transfectadas con un constructo de receptor quimérico, lo que permite cuantificar la activación del receptor mediante la secreción de interleucina-2 (IL-2) detectada por ELISA. Este enfoque facilita el análisis de la activación del receptor por diversos ligandos, incluyendo anticuerpos y moléculas de superficie celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología Celular
- Biología Molecular
Antecedentes
- Las interacciones receptor-ligando son fundamentales para muchos procesos biológicos.
- Los experimentos directos con receptores y ligandos nativos pueden ser difíciles debido a ligandos desconocidos o dificultades técnicas.
- Los sistemas de reportero pueden proporcionar una detección sensible y específica de la activación del receptor.
- Se necesitan ensayos cuantitativos para medir los niveles de activación del receptor.
Objetivo del estudio
- Desarrollar y demostrar un sistema de marcadores para detectar interacciones receptor-ligando.
- Permitir la cuantificación de la activación del receptor incluso cuando el ligando es desconocido.
- Proporcionar un método reproducible y de fácil operación para estudios de receptores.
Métodos Utilizados
- Clonación del dominio extracelular de un receptor específico fusionado al CD3ζ de ratón.
- Transfección de células BW5147 de ratón con el constructo del receptor quimérico mediante electroforesis.
- Selección de células transfectadas con el antibiótico G418.
- Incubación de células BW transfectadas con células diana o anticuerpos.
- Medición del IL-2 murino secretado mediante ELISA como indicador de la activación del receptor.
Resultados principales
- El sistema de reportero detecta con éxito la activación de receptores específicos por diversos ligandos.
- La medición cuantitativa de la secreción de IL-2 se correlaciona con los niveles de activación del receptor.
- El sistema se utilizó para estudiar la activación de receptores Fcγ humanos por anticuerpos anti-CD20 en células de LLC.
- Los resultados pueden estandarizarse utilizando la densidad óptica para la conversión a concentración de IL-2 mediante curvas estándar.
Conclusiones
- El Sistema Repórtor BW es una herramienta robusta para analizar las interacciones receptor-ligando.
- Es aplicable incluso cuando el ligando es desconocido o difícil de usar experimentalmente.
- El método es sensible, específico y permite el análisis cuantitativo de la activación del receptor.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El Sistema Repórtor BW permite una interrogación sensible y cuantitativa de las interacciones receptor-ligando, incluso cuando el ligando es desconocido o técnicamente difícil de manejar. Esta capacidad aborda un cuello de botella crítico en el descubrimiento temprano y la validación de dianas al proporcionar una plataforma reproducible y escalable para estudios funcionales de activación de receptores. El sistema apoya la reducción de riesgos en toda la cartera y acelera la confianza mecanicista en puntos clave de inflexión del desarrollo de biológicos y anticuerpos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la validación funcional de la activación del receptor por diversos ligandos, incluidos los desconocidos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aislar eventos de activación específicos del receptor.
- Facilita la triage rápida de objetivos candidatos basada en perfiles cuantitativos de activación.
- Proporciona una lectura estandarizada para la interrogación de vías guiada por hipótesis.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona un resultado cuantitativo y reproducible basado en ELISA para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Facilita la estandarización del ensayo y la reproducibilidad entre laboratorios en estudios de receptores y ligandos.
- Permite la evaluación escalable de anticuerpos o candidatos a ligandos basados en células.
- Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos con alta confianza.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los datos de activación del receptor con terapias con anticuerpos o células relevantes para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica del acoplamiento funcional del receptor.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de candidatos biológicos basado en umbrales cuantitativos de activación.
- Permite el desarrollo de biomarcadores traslacionales cuando la activación del receptor es un punto final clave.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este sistema de reportero es adecuado desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de fármacos líderes y la validación preclínica, proporcionando una plataforma reutilizable para la interrogación funcional de receptores y ligandos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la reducción del riesgo mecanicista mediante la cuantificación de la activación del receptor en respuesta a ligandos candidatos.
- Selección: Ofrece resultados cuantitativos estandarizados de ELISA para comparar la eficacia y especificidad de los ligandos.
- Análisis: Permite convertir la densidad óptica en concentración de IL-2 para realizar análisis estadísticos sólidos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traductiva: Conecta los estudios de descubrimiento con los preclínicos al validar el acoplamiento funcional de los objetivos terapéuticos.
- Reutilización Empresarial: Proporciona un sistema modular y adaptable para diversos estudios de receptores y ligandos en múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona ensayos estandarizados, reproducibles y escalables de activación de receptores.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar/no continuar y la eficiencia del capital al permitir cribado funcional temprano.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de candidatos biológicos y anticuerpos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en clonación molecular y transfección celular para la generación de receptores quiméricos.
- Necesita acceso a instrumentación de ELISA e infraestructura analítica para lecturas cuantitativas.
- Exige la estandarización entre equipos de las condiciones del ensayo y de las líneas de análisis de datos.
- Adaptable a diversos tipos de receptores y fuentes de ligandos, incluyendo anticuerpos y moléculas de la superficie celular.
- Depende de la verificación independiente de cada componente del flujo de trabajo para obtener resultados robustos.
