Evaluación de la interacción entre el complemento proteína C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular
15 de junio de 2019
El componente de complemento C1q es una molécula proinflamatoria altamente expresada en el microambiente tisular que puede interactuar con la matriz extracelular. Aquí, describimos un método para probar cómo C1q unido al ácido hialurónico afecta la adhesión celular.
Un procedimiento integral para evaluar la interacción entre la proteína de complemento C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular. Recientemente hemos definido que el componente de complemento C1q una molécula del sistema inmunitario innato está muy expresada en el microambiente tumoral y placenta y es capaz de interactuar con el componente de la matriz extracelular. En este caso, ácido hialurónico.
Proponemos un método para estudiar las funciones biológicas de las proteínas en todo el entorno ecronómico. Con el fin de investigar la capacidad de estas moléculas para dar forma a las propiedades de división celular de los factores de matriz extracelular. Con el fin de estudiar cómo esta interacción puede ser detectada por las células presentes en el tejido del medio ambiente, configuramos este método fácil en el que las células binarias derivadas de los tejidos humanos se les permitió adherirse a C1q unido a la matriz extracelular, en este caso ácido hialurónico.
Para el procedimiento de recubrimiento el primer paso es la unión de ácido hialurónico de alto peso molecular a 96 microplacas bien recubiertas de tejido. Para el recubrimiento, el ácido hialurónico se diluye en 0,1 mole buffer de carbono PH 9.6 a una concentración de 15 microgramos por mililitro. Y la tubería suave es requited para lograr una solución homogénea.
Se utilizan 100 microlitros de la solución para recubrir los pozos. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente aspira el vacío de los pozos tratados.
Lavar una vez con dPBS. Agregue C1q o BSA en los pozos correspondientes. C1q está actualmente disponible comercialmente a una concentración de un miligramo por mililitro y se diluye a una concentración de 25 microgramos por mililitro.
Y dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles calcio y magnesio y cationes divalentes. BSA LPS free se utiliza a la concentración de 0.5% y fecha PBF. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche.
Las interacciones dependientes de la dosis C1q con ácido hialurónico inmovilizado se determinan mediante inmuno SA vinculado a enzimas. Etiquetado de células con DiI rápido. El trazador lipofílico diI rápido se utiliza para etiquetar las células de interés. Las células resuspendidas en dPBS se utilizan a la concentración de un millón de células por mililitro.
DiI rápido se diluye de uno a 100 directamente en la suspensión celular. La suspensión celular se mezcla manualmente y se transfiere a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de cinco minutos de incubación, mezcle la suspensión celular y repita esta operación dos veces más.
Para eliminar el exceso de DiI rápido, agregue 10 mililitros de dPBS. Gire suavemente hacia arriba y hacia abajo y centrifugar a 250 g durante siete minutos. Resuspender el gránulo celular en un mililitro de medio libre de suero endofilo humano en presencia de 0.1%BSA.
Adhesión de células en matrices C1q de ácido hialurónico. Aspirar al vacío el dPBS de los pozos recubiertos. Distribuya 100 microlitros de suspensión celular etiquetada a los pozos recubiertos.
200 microlitros de células etiquetadas se desmontan en un tubo de ependure que se utilizará para la generación de curvas estándar. Incubar la placa durante 35 minutos a 37 grados centígrados. Saque el plato de la incubadora.
Aspirar suavemente las células desequilibradas. Lavar una vez con dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles de calcio y magnesio. Lys las células adherentes mediante la adición de 200 microlitros de tampón de lelisis.
Al mismo tiempo, prepare la curva estándar sobre una o dos diluciones en serie de las células etiquetadas en el búfer de lelisis. Realice la lectura de la señal de florescencia en el infinito instrumento F 200 T-can utilizando 544 nanómetros como longitud de onda de excitación y 590 nanómetros como longitud de onda de emisión. Resultados representativos.
Como muestran los resultados representativos, es evidente que la adhesión celular en el ácido hialurónico encontró C1q como fuertemente mejorado en comparación con HA solo o HA unido BSA. El porcentaje de celdas adherentes en cada matriz se calcula sobre la base de la curva estándar. Conclusiones. En nuestros experimentos primero evaluamos la capacidad del componente de complemento C12 para unir la matriz extracelular en este caso el ácido hialurónico utilizando un metal arisal.
En segundo lugar analizamos la capacidad de las células primarias humanas manchadas con tinte fluorescente para perseguir el ácido hialurónico unido. El modelo que propusimos en este estudio es un método más fácil y barato en alternativa al modelo 3D de andamios de matriz extracelular para la evaluación de esta respuesta celular a una combinación de estímulos.
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Visión general
Este estudio explora la interacción entre el componente del complemento C1q y el ácido hialurónico, centrándose en cómo esta interacción influye en la adhesión celular. C1q, una molécula proinflamatoria, se expresa significativamente en los microambientes tumorales y de la placenta.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Fundamentos
- C1q es parte del sistema inmune innato.
- Está altamente expresado en microambientes de tejidos específicos.
- C1q interactúa con componentes de la matriz extracelular.
- El ácido hialurónico es un componente clave de la matriz extracelular.
Propósito del estudio
- Evaluar el papel de C1q en la adhesión celular.
- Investigar cómo el C1q unido al ácido hialurónico afecta el comportamiento celular.
- Desarrollar un método para estudiar interacciones de proteínas en el entorno extracelular.
Métodos utilizados
- Se utilizaron células binarias derivadas de tejidos humanos.
- Se permitió que las células se adhierieran al C1q unido al ácido hialurónico.
- Se estableció un procedimiento integral para la evaluación.
- Se evaluaron las funciones biológicas de las proteínas en el contexto de la matriz extracelular.
Resultados principales
- La interacción entre C1q y el ácido hialurónico promueve la adhesión celular.
- Las células responden a la presencia de C1q en la matriz extracelular.
- Este método proporciona información sobre las propiedades de división celular influenciadas por factores extracelulares.
- Los hallazgos pueden tener implicaciones para la comprensión de las respuestas inmunes en entornos tisulares.
Conclusiones
- C1q juega un papel significativo en la adhesión celular a través de su interacción con el ácido hialurónico.
- El método desarrollado puede aplicarse para estudiar más a fondo las interacciones de proteínas.
- Comprender estas interacciones puede mejorar el conocimiento de las funciones del sistema inmune en varios tejidos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
