Name: Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a procesar ARN codificante y no codificante de sangre entera porcina mediante reducción de globina. Este protocolo optimizado facilita el estudio de interacciones huésped-patógeno en genómica.

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Este trabajo fue apoyado principalmente por el por el USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 y en parte por el USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Este estudio fue apoyado en parte por una cita a la agrícola servicio investigación participación programa de investigación administrado por el Instituto Oak Ridge para la ciencia y educación (ORISE) a través de un acuerdo interagencial entre el Departamento de energía ( DOE) y el Departamento de agricultura de Estados Unidos. ORISE es administrada por Oak Ridge Associated universidades bajo contrato DOE no. DE-AC05-06OR2310.
Nos gustaría dar las gracias a Dr. Kay Faaberg para los clones infecciosos HP-PRRS, el Dr. Susan Brockmeier por su ayuda con los animales involucrados en el experimento y Sue Ohlendorf para asistencia secretarial en la preparación del manuscrito.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.
Mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o aprobación por el Departamento de agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades y el empleador.

El primer paso crítico en el protocolo que ha optimizado incluye los pasos de agotamiento de la globina añadido, que permite obtener lecturas de calidad de muestras de sangre entera. Una de las más grandes limitaciones sobre el uso de sangre entera en los estudios de secuenciación son los altos números de Lee en la muestra que se asignan a las moléculas de globina y reducirá la lee que puede asignar a otras moléculas de interés18. Por lo tanto, optimizar el protocolo para nuestro tipo de muestra, ...

Secuencia de la generación siguiente (NGS) ha surgido como una poderosa herramienta para la investigación de los cambios que ocurren a nivel genómico de organismos biológicos. Preparación de muestras para métodos NGS puede variar dependiendo del organismo, tipo de tejido, y lo más importante las preguntas de los investigadores están deseosos de dirección. Muchos estudios han recurrido a NGS como medio de estudiar las diferencias en la expresión génica entre Estados como individuos sanos y enfermos1,2,3,4. La secuencia coloque sobre una base de todo el genoma y permite a un investigador capturar la mayoría, si no todos, de la información genómica para un determinado marcador genético a la vez el punto.
Los marcadores más comunes de expresión observados son el Mensajero RNAs (mRNAs). Los procedimientos más utilizados para preparar las bibliotecas para RNA-seq se optimizan para la recuperación de las moléculas de mRNA mediante el uso de una serie de purificaciones, fragmentaciones y trompas5,6. Sin embargo, la decisión sobre cómo un protocolo debe realizarse depende en gran medida el tipo de muestra y las preguntas sobre dicha muestra. En la mayoría de los casos se extrajo ARN total; sin embargo, no todas las moléculas de ARN son de interés y en casos como los estudios de expresión de mRNA excesivamente abundantes especies de RNA, como el ARN ribosómico (ARNr) necesitan ser removidas para aumentar el número de transcripciones perceptibles asociados con los mRNAs. El método más popular y ampliamente utilizado para eliminar las abundantes moléculas de rRNA es la reducción de las transcripciones de cofia RNA conocido como polyA agotamiento7. Este enfoque funciona bien para el análisis de la expresión de mRNA como no afecta a los transcritos de ARNm. Sin embargo, en estudios que están interesados en RNAs no codificantes o virales, agotamiento de polyA también elimina estas moléculas.
Muchos estudios deciden centrarse en la preparación de biblioteca de secuencia de RNA para examinar cualquier expresión del mRNA (codificación) o una clase determinada de ARN no codificante de pequeño o grande. Aunque hay otros procedimientos8 como la nuestra que permiten la preparación de la muestra doble, muchos estudios preparan bibliotecas de muestras independientes para estudios por separado cuando esté disponible. Para un estudio como el nuestro, esto requeriría normalmente múltiples muestras de sangre, aumentando el tiempo, consumibles y el estrés animal. El objetivo de nuestro estudio era ser capaz de usar sangre de animales para identificar y cuantificar las diferentes clases de ambos mRNA y RNA no codificante expresó entre disgenésico sano y altamente patógena y virus del síndrome respiratorio (HP-PRRS) desafió a cerdos9,10 a pesar de tener sólo una muestra de sangre entera sola (2,5 mL) de cada cerdo. Para ello, necesitábamos optimizar la extracción típica y protocolos de creación de biblioteca para generar los datos adecuados para permitir análisis de mRNA y no codificante del RNA (ncRNA) expresión11 de una sola muestra.
Esto impulsó la necesidad de un protocolo que permitió mRNA y análisis de ARN no codificante porque los kits estándar disponibles y métodos para la extracción de RNA y biblioteca de la creación fueron pensados principalmente para mRNA y utilizan un agotamiento poly-A paso12. Este paso habría hecho imposible recuperar ARN no codificante o transcripciones virales de la muestra. Por lo tanto, era necesario un método optimizado que permite para la extracción de RNA total sin agotamiento de polyA la muestra. El método presentado en este manuscrito se ha optimizado para permitir el uso de sangre entera como un tipo de muestra y construir bibliotecas de la secuencia de mRNA y ncRNAs de tamaños pequeños y grandes. El método ha sido optimizado para permitir el análisis de todos detectables no-codificación RNAs como retener RNAs virales para posterior investigación13. En todos, nuestro protocolo de preparación de biblioteca optimizada permite la investigación de múltiples moléculas de RNA de una muestra de sangre entera solo.
El objetivo detrás del uso de este método fue desarrollar un proceso que permitió la colección no codificante del RNA tanto de ARNm de una muestra de sangre entera. Esto nos permite tener ncRNA y mRNA y RNA viral para cada animal en nuestro estudio de una sola muestra9. Esto, en última instancia, permite el descubrimiento científico más sin costes adicionales de animales y da una imagen más completa de la expresión de cada muestra individual. El método descrito permite la examinación de los reguladores de expresión génica así como permitiendo estudios correlativos comparando ambos de mRNA y la expresión de RNA no codificante con una muestra de sangre entera sola. Nuestro estudio utiliza este protocolo para examinar los cambios en la expresión génica y posibles reguladores epigenéticos en viralmente infectaron cerdos comerciales masculinos 9 - semanas de edad.

<table><tbody><tr><td>Tubos PAXgene</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de biología molecular</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana Kit de aislamiento de miARN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Kit de limpieza</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de pared delgada de 0,2 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>tubos sin RNasa/DNasa de 1,5 mL</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclador de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>Oligo de reducción de globina (&alpha; 1)</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td>Secuencia GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>Reducción de globina Oligo (&alpha; 2)</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td>Secuencia TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>Reducción de globina Oligo (&beta; 1)</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td>Secuencia AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&beta; 2)</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td>Secuencia GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X Oligo Hibridación</td> Tampón-Tris-HCl<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X Tampón</td><td></td><td></td><td></td> RNasa H</tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Grado de biología molecular Agua</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNasa H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Inhibidor de la rnasa</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 Electroforesis BioAnalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent ADN de alta sensibilidad&nbsp; Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Kit de preparación de biblioteca de ARN total trenzado con Ribo-Zero&nbsp;</td><td>Kit</td><td>de ARNm Illumina RS-122-2201</td><td>; Conjunto Humano/Ratón/Rata A&nbsp; (48 muestras, 12 índices)</td></tr><tr><td>Guía de preparación de muestras de ARN total trenzado TruSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Disponible en línea</td></tr><tr><td>RNAClean XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Tira óptica de 8 tubos</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>tubos de pared delgada de 0,2 ml</td></tr><tr><td>MicroAmp Tapa de tira óptica de 8 tubos</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNasa/DNasa - depósitos de reactivos libres</td><td>Cualquier proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Placas de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>Se utilizaron en lugar de placas de .3 mL según fuera necesario</td></tr><tr><td>MicroAmp Película adhesiva óptica</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Small RNA Library Set de preparación para Illumina&reg; (Conjunto 1)&nbsp;</td><td>Kit de ARN pequeño</td><td>E73005</td> de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Set de preparación de bibliotecas de ARN pequeñas para Illumina&reg; (Conjunto 2)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>kit de ARN pequeño</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S Super Magnet Plate</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de la codificación y las clases de arn no codificante expresado en cerdos sangre entera

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

La llegada del innovador y cada vez más potentes técnicas de secuenciación siguiente de generación ha abierto nuevos caminos en la capacidad de examinar la expresión de genes subyacentes relacionadas con procesos biológicos de interés. Estas innovaciones no sólo permiten a los investigadores observar la expresión de las secuencias de ARNm que codifican para los genes función celular efecto, pero también las no codificantes (ncRNA) las moléculas de ARN que permanecen sin traducir, pero todavía tienen funciones reguladoras. Aunque los investigadores tienen la capacidad de observar la expresión de mRNA y ncRNA, ha sido habitual para un estudio que se centran en uno o el otro. Sin embargo, cuando los estudios están interesados en la expresión de mRNA y ncRNA, muchas veces utilizan las muestras separadas para examinar la codificación o no-codificación RNAs debido a la diferencia en la preparación de la biblioteca. Esto puede conducir a la necesidad de más muestras que puede aumentar el tiempo, consumibles y el estrés animal. Además, puede causar los investigadores deciden preparar muestras para análisis sólo uno, generalmente el mRNA, limitar el número de cuestiones biológicas que pueden ser investigadas. Sin embargo, ncRNAs abarcan múltiples clases con funciones reguladoras expresión de mRNA de efecto. Porque ncRNA son importantes para los procesos biológicos fundamentales y desorden de estos procesos en durante la infección, por lo tanto, pueden, hacer objetivos atractivos para la terapéutica. Este manuscrito muestra un protocolo modificado para la generación de mRNA y no codificante del RNA expresión bibliotecas, incluyendo el ARN viral, de una sola muestra de sangre entera. Optimización del presente Protocolo, mejora la pureza del RNA mayor ligadura para recuperación de RNAs metilados y omite la selección del tamaño, para permitir la captura de las especies de RNA más.

Las muestras representativas en nuestro estudio son la globina y muestras de sangre entera ribo-agotado. El resultado representativo del protocolo consiste en una muestra de biblioteca empobrecido de la globina con un número de la integridad del RNA (RIN) por encima de 7 (figura 1a) y cocientes de concentración 260/280 nm en o por encima de 2 (figura 1b y 1 c). Validación de los resultados de la ...

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para el proceso de codificación (mRNA) y no codificantes (ncRNA) globina reducida RNA-seq bibliotecas de una muestra de sangre entera sola.

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las interacciones huésped-patógeno al permitir el examen de la codificación, la no codificación y la expresión de ARN viral implicada en la respuesta de aminoácidos del huésped, así como cómo un patógeno puede afectar las funciones biológicas del huésped. La principal ventaja de esta técnica es que presenta un protocolo optimizado para el procesamiento de ARNm y ARN no codificantes de bibliotecas RNAseq reducidas por globina a partir de una sola muestra de sangre entera. Demostrando la técnica estará Sarah Anderson, una técnico de mi laboratorio.Comience por centrifugar los tubos sanguíneos a 50 20 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Trabajando en un armario de seguridad biológica, después de retirar el sobrenadante, añadir ocho mililitros de agua libre de RNase al pellet. Cierre los tubos y vórtice el pellet hasta que se disuelva visiblemente, luego centrifuga los tubos a 50 20 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente para recuperar el pellet.Trabajando en un armario de seguridad biológica, deseche el sobrenadante y guarde el pellet. Para aislar el ARN total, comience por pipetear 300 microlitros de tampón de unión de lisis al pellet. Después del vórtice, transfiera la mezcla de cada tubo a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Añadir 30 microlitros de aditivo homogeneado del kit de aislamiento miRNA. Vórtice los tubos y colóquelos en el hielo durante 10 minutos. Trabajando en una campana de humo, retire los tubos del hielo y agregue 300 microlitros del reactivo de cloroformo de fenol ácido del kit y el vórtice de nuevo para mezclar.Después de centrifugar a 10.000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, retire cuidadosamente la fase acuosa a un tubo nuevo. Sobre la base de la cantidad de recuperación acuosa del paso anterior, añadir 1,25 veces el volumen de 100%etanol al fago acuoso en cada tubo y pipeta para mezclar. Prepare tubos de recogida nuevos que contengan un cartucho de filtro para cada muestra.Pipeta aproximadamente 675 microlitros de la mezcla de izado y etanol en el cartucho del filtro. Centrifugar brevemente a 10.000 veces G para pasar líquido a través del filtro. Deseche el flujo a través.Repita la mezcla de izado-etanol añadiendo al filtro y centrifugación hasta que se haya utilizado por completo. Agregue 700 microlitros de solución de lavado uno del kit al cartucho del filtro. Centrifugar brevemente para tirar de la solución a través de los filtros.Deseche el flujo y mantenga los mismos cartuchos de filtro y tubos de recogida. Agregue 500 microlitros de solución de lavado dos-tres a cada cartucho de filtro. Después de centrifugar de nuevo, deseche el flujo y repita el paso de lavado.Para eliminar cualquier líquido residual de los cartuchos de filtro, gírelos 60 segundos adicionales. Transfiera los cartuchos a tubos de recogida frescos. Agregue 100 microlitros de agua sin nucleasa precalentada de 95 grados Celsius al centro de cada cartucho de filtro.Centrifugar los cartuchos durante aproximadamente 20 a 30 segundos en la centrífuga de sobremesa a la velocidad máxima. Para preformar la hibridación con oligos de reducción de globina, primero desnaturalizar el ARN añadiendo cada muestra extraída en un tubo de reacción sin nucleasa de 0,2 mililitros de paredes delgadas. Coloque los tubos en un ciclor térmico a 70 grados Centígrados durante dos minutos.Después de eso, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo para obtener una calidad óptima de ARN. Mientras los tubos se enfrían, prepare 400 microlitros de mezcla de oligo de reducción de globina 10X y tampón de hibridación de oligo 10X en un tubo de dos mililitros. Para hacer la mezcla de hibridación, agregue seis microgramos de muestra de ARN, dos microlitros de la mezcla de oligo de reducción de 10X de globina, un microlitro de tampón de hibridación de oligonú 10X y nuclese agua libre a un volumen final de 10 microlitros a cada tubo de reacción de paredes delgadas de 0,2 mililitros, sin nucleasas.Coloque los tubos en el ciclor térmico a 70 grados centígrados durante dos minutos. Después de eso, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo. Para realizar la digestión RNase H, primero diluya 10X RNase H a un X RNase H con un búfer X RNase H.Prepare la mezcla de reacción RNase H combinando dos microlitros de tampón 10X RNase, un microlitro de inhibidor de la ARNa y dos microlitros de un X RNase H, y cinco microlitros de agua libre de nucleasas a un volumen total de 10 microlitros. Agregue 10 microlitros de la mezcla de reacción RNase H a las muestras de hibridación de reducción de globina y mezcle bien. Digerir esta reacción a 37 grados celsius durante 10 minutos y luego enfriar a cuatro grados Celsius.Detenga la digestión añadiendo un microlitro de EDTA molar a la sonda y transfiera todo el contenido del tubo a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Inmediatamente después de eso, añadir 80 microlitros de agua libre de RNase, 350 microlitros de tampón de lelisis, luego 250 microlitros de 100% etanol a cada tubo y mezclar bien por pipeteo. Transfiera cada muestra de 700 microlitros a un cartucho de filtro de elución separado colocado en un tubo de recolección de dos mililitros para recoger el flujo a través.Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 veces G o superior y luego deseche el flujo a través. Coloque los mismos cartuchos de filtro de elución en nuevos tubos de recogida de dos mililitros. Para lavar las membranas del cartucho de filtro, agregue 500 microlitros del tampón de lavado suave a los cartuchos de filtro y centrífuga durante 15 segundos a 8.000 veces G o más.Deseche el flujo a través. A continuación, utilizando los mismos tubos de recogida, agregue 500 microlitros de 80% de etanol a los cartuchos de filtro. Centrifugar durante dos minutos a 8.000 veces G y más.Deseche los tubos de flujo y de recogida y guarde las columnas de giro de elución. Coloque cada columna de giro de elución en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros. Centrifugar a toda velocidad durante cinco minutos con la tapa abierta en los cartuchos de filtro para secar las membranas de la columna de centrifugado y evitar el arrastre de etanol.Después de desechar los tubos de recogida, coloque cada cartucho de filtro seco en un tubo de recogida fresco de 1,5 mililitros. Agregue 14 microlitros de agua libre de RNase directamente al centro de la membrana del cartucho del filtro. Para eluir el ARN, centrifugar los tubos durante 60 segundos a toda velocidad y luego continuar con la evaluación y preparación de ARN.La muestra agotada por globina ahora se puede dividir y utilizar para preparar las pequeñas bibliotecas de ARN no codificantes, así como el ARNm agotado en ribo y las bibliotecas de ARN largas y no codificantes. Después de preparar las bibliotecas de expresiones de las muestras de sangre entera agotadas por globinas y agotadas por ribo utilizando este protocolo, el resumen de la ejecución del archivo de electroforesis mostró una muestra de biblioteca agotada por globina con números de integridad de ARN que oscilaban entre 6.3 y 9.2. Esto resultó ser una mejora en comparación con otros estudios que utilizaron métodos de agotamiento de la globina y sólo fueron capaces de lograr números rin en o cerca de seis.La reducción previa a laglobina y la reducción posterior a la globina de una sola muestra de sangre entera porcina mostraron que las relaciones de concentración de 260 a 280 nanómetros están en o por encima de dos. Mediante este protocolo, se obtuvieron electroferogramas basados en chip de muestras de la biblioteca de ARNm de sangre entera agotadas por globina y ribo antes de la agrupación y la secuenciación. Para las bibliotecas de ARNm, el electroferograma representativo tiene un pico de aproximadamente 280 pares base.Para los pequeños ncRNAs, los electroferogramas representativos basados en chip contienen una gama de picos de aproximadamente 100 a 400 pares base. Los picos en aproximadamente 143 pares base corresponden a miRNAs, y los picos en aproximadamente 153 pares base corresponden a piRNAs. Al intentar este procedimiento, es importante recordar los tubos de hielo inmediatamente donde se indica.Siguiendo este procedimiento, se deben realizar otros métodos como la secuenciación de próxima generación para responder a preguntas adicionales como la expresión diferencial, los cambios epigenéticos y su efecto en las vías y procesos biológicos. No olvide que trabajar con reactivo de fenol-cloroformo es extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones como trabajar en una campana de humo. Además, al manipular sangre entera u organismos infecciosos, se debe trabajar en un gabinete de seguridad biológica antes de la activación del organismo infeccioso.

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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