Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Este método puede ayudar a resolver un obstáculo clave en el campo del aislamiento y la secuenciación de una sola neurona. Como la recolección de población específica o una subpoblación de neuronas etiquetadas fluorescentemente de área cerebral definida por el usuario. La principal ventaja de esta técnica es que asegura que la única neurona de interés se captura sin contaminar los escombros.

También es relativamente suave, que es importante para los tipos de neuronas frágiles que mueren rápidamente cuando se someten a las presiones de fluidos de la clasificación convencional de FACS. Comience preparando microcapillarios de vidrio tirado con un diámetro de salida de 10 a 15 micras utilizando un tirador capilar. Utilice tijeras finas para cortar la punta del capilar para obtener el diámetro de placa deseado.

A continuación, utilice conectores de tubería para conectar un tubo de silicona flexible de 120 a 150 centímetros de longitud con un diámetro interior de 0,8 milímetros a un filtro de jeringa de membrana PVDF de 0,2 micras y una válvula de tubo bidireccional. Preparar 500 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial refrigerado o ACSF y oxigenar burbujeando 5%dióxido de carbono equilibrado a través de una Airstone durante 15 minutos o hasta que la solución se despeje por completo. Prepare tres vasos de 150 mililitros cada uno que contengan 100 mililitros de ACSF.

A uno, agregue un cóctel de bloqueadores de actividad. A otro, añadir la fracción de Streptococcus para la proteasa a una concentración final de un miligramo por mililitro. Al vaso final, añadir FBS a una concentración final de 1%y oxigenar con 5% de oxígeno equilibrado de dióxido de carbono a través de una piedra de aire.

Por último, haga tres pipetas Pasteur de tallo largo con diámetros de salida decrecientes enrollándolas sobre una llama abierta. Disecciona el cerebro de un ratón eutanasia abriendo el cráneo con una pequeña tijera y extrayendo el cerebro fresco usando fórceps finos sin dañar la corteza. Coloque el cerebro en ACSF refrigerado y oxigenado dejando un Airstone unido a 5% de oxígeno equilibrado con dióxido de carbono durante toda la duración de la seccionamiento.

Coloque el cerebro en el mandril del vibratome y corte las secciones coronales o sagitales con un grosor de 300 micras. Recopile tantas secciones como sea necesario para obtener un mínimo de 10 a 50 celdas etiquetadas. Coloque las rodajas en un soporte de rodajas de malla de algodón colocado dentro de un vaso de precipitados para que se bañen en ACSF oxigenado.

Mueva las rodajas en el vaso de precipitados que contiene ACSF con bloqueadores de actividad y bloquee durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente mientras burbujea de oxígeno con una Piedra de Aire. Mueva las rodajas al vaso de precipitados que contiene ACSF con la solución proteasa para realizar una digestión leve a temperatura ambiente. Después de la digestión, lavar la proteasa moviendo las rodajas de nuevo al vaso de precipitados que contiene ACSF con solución de bloqueador de actividad durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente.

Sigue burbujeando oxígeno. A continuación, prepare un plato Petri de 100 milímetros que contenga ACSF con 1%FBS a temperatura ambiente y mueva secciones individuales al disco para la microdisección. Bajo un ámbito de disecciones fluorescentes, utilice un par de fórceps finos para microsectar áreas y capas de interés que tengan un mínimo de 10 a 50 celdas.

Con una pipeta Pasteur, mueva las piezas microdesinscriptadas a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga aproximadamente 0,8 mililitros de 1%FBS en solución ACSF. Valore el tejido diseccionado en el tubo de microfuge a temperatura ambiente. Realice aproximadamente 10 golpes con cada una de las pipetas Pasteur flameadas comenzando con la más grande y terminando con el diámetro de salida más pequeño.

Dispensar las células disociadas en un plato de Petri de 100 milímetros que contenga ACSF oxigenado y esperar de cinco a siete minutos para que las células se asienten gradualmente. Observe la señal GFP y RFP bajo un microscopio de disección. Identifique los escombros examinando la morfología bajo la iluminación de campo brillante.

Una vez que se haya identificado un área de células con poco desecho, utilice el capilar y adjúntelo al tubo para recoger las células bloqueando el extremo de la válvula de tubo con la lengua. A continuación, coloque el capilar cerca de las células. Suelte el bloque en el capilar y bloquee rápidamente de nuevo para capturar la célula mediante la acción capilar.

Mueva el capilar a un plato petri de 100 milímetros con ACSF fresco oxigenado y sople suavemente en el tubo mientras observa la punta capilar bajo la óptica de fluorescencia para dispensar las células en el plato. Repita el procedimiento de recolección hasta que se recojan entre 100 y 150 células, asegurándose de que los contaminantes, como los desechos, sean mínimos en la óptica de contraste de interferencia diferencial de campo brillante. Por último, utilizando una pipeta micro-capilar fresca cada vez, elija una sola célula y expulse en no más de 0,5 microlitros en un tubo de microfuto de 0,2 microlitros que contenga un microlitro de tampón de recolección de muestras con imprimadores.

Romper la punta de la pipeta en el tubo de micro-fuge para asegurarse de que la célula permanece en el búfer de recolección. Congele las células poniendo los tubos sobre hielo seco. Conservar en un congelador de menos 80 grados Celsius hasta su procesamiento para amplificación de ARN.

Las neuronas GABAérgicas fueron aisladas de la corteza cingulet del cerebro del ratón. El ARN amplificado a partir de las neuronas ordenadas manualmente oscilaba entre 200 y 4.000 pares base en tamaño con una distribución máxima ligeramente superior a 500 pares base. Después de la purificación de cuentas, la biblioteca de cDNA es de tamaño adicional restringido por una segunda ronda de purificación utilizando cuentas para eliminar fragmentos de menos de 200 pares base y para el pico en aproximadamente 350 pares base.

La secuenciación mostró un 4.8 veces 10 a la 5a mediana o 6.9 por 10 a la 5a lecturas asignadas promediadas por celda. Después de la eliminación duplicada de ARN utilizando IRI, cada celda tenía una media de 1,0 a la 5a mediana o 1,4 veces 10 a la 5a lecturas únicas promedio por celda. En cada consorcio de controles de ARN externo de célula única, se utilizó un pico de ARN como control interno para calcular el número absoluto de moléculas añadidas a la muestra.

Hubo una relación lineal de entrada a los recuentos observados con una pendiente de 0,92 y un cuadrado R ajustado de 0,94. Se detectó un promedio de alrededor de 10.000 genes por neurona única utilizando este procedimiento con más del 95% de las células individuales que detectan más de 6.000 genes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los biólogos moleculares exploraran el transcriptoma de claras interneuriones corticales de ratón bien caracterizadas, e identificó categorías genéticas selectas que son responsables de codificar la identidad celular.