Name: Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende a aislar neuronas fluorescentes de ratón mediante clasificación manual para secuenciación de ARN unicelular. Este método permite obtener perfiles de expresión génica de alta profundidad con mínima contaminación.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH (5R01MH094705-04 y R01MH109665-01 a Z.J.H.), por el CSHL Robertson Neurociencia fondo (Z.J.H.) y por una beca Post-Doctoral de NARSAD (a A.P.).

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Autores declaran que no hay ninguna competencia intereses financieros.

El manual de clasificación de protocolo es adecuado para una secuencia de RNA supervisada de neurona las poblaciones que son escasamente marcados en el cerebro de ratones o representan a una población de células raras que de lo contrario no es factible estudiar con células de alto rendimiento actual métodos de selección y amplificación. Las células sometidas a FACS generalmente se someten a las presiones de línea de vaina y muestra en la gama de ~ 9 – 14 psi, dependiendo del tamaño de la boquilla y deseado de las tasas d...

Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular ha transformado estudios transcriptómico. Mientras que a gran escala unicelular RNAseq puede realizarse usando una variedad de técnicas, como gotitas1,2, microfluídica3, nanogrids4y5de los micropocillos, mayoría de los métodos no puede ordenar tipos celulares definidas expresan fluoróforos genéticamente codificados. Para aislar a una población selecta de la célula, célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación es de uso frecuente para clasificar las células etiquetadas en el modo de una sola célula. Sin embargo, FACS tiene algunas restricciones y requiere de etapas de procesamiento de una muestra. En primer lugar, un gran número de células de entrada es típicamente necesarios (a menudo varios millones células / mL), con una fracción significativa (> 15-20%) que contiene la población marcada. En segundo lugar, preparaciones celulares pueden requerir múltiples rondas de pasos de centrifugación del gradiente de densidad para eliminar la fracción glial, escombros y montones de celulares que de lo contrario podrían obstruir la boquilla o flujo de la célula. En tercer lugar, FACS generalmente emplea la coloración y los pasos para live/dead tinción (por ejemplo, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), yoduro de propidio (PI) y colorantes de Cytotracker), que toman más tiempo de extracción. En cuarto lugar, como regla general para la clasificación (como DAPI y proteína fluorescente verde y rojo (GFP/RFP)), generalmente dos muestras de dos colores y un control son necesarios, que requieren una muestra sin etiqueta para ser procesados además de la cepa de ratón deseado. En quinto lugar, filtrado a menudo se realiza varias veces antes y durante la clasificación de la muestra para evitar proactivamente obstruido muestra líneas en una máquina de FACS. En sexto lugar, debe asignarse tiempo en configuraciones de FACS más comúnmente utilizadas para inicializar y estabilizar el flujo y realizar la calibración de la gota. Séptimo, control de muestras normalmente se ejecutan en secuencia antes de la colección de la muestra real para configurar matrices de compensación, rechazo de doblete, puertas, etc. usuarios o realice los pasos seis y siete se antes de tiempo o requieren la asistencia de un técnico en paralelo. Por último, post-FACS, hay a menudo medidas para asegurar que sólo con la etiqueta solo las células están presentes en cada pozo; por ejemplo, revisando las muestras en una instalación de proyección de alto contenido como un toner de la placa rápida.
Para eludir los pasos descritos arriba y facilitar una relativamente rápida, dirigida la secuencia de una población pequeña de neuronas fluorescencia etiquetadas sola, describimos un manual de clasificación procedimiento seguido por dos rondas de una alta sensibilidad in vitro Protocolo de amplificación, llamado doble transcripción de in vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq). La generación de biblioteca de cDNA y amplificación de RNA está adaptada de Eberwine et al. 6 y Hashimshony et al. 7, con algunas modificaciones para todos los interneurons de ratón que tienen volúmenes celulares más pequeños; Además, también hemos encontrado que es igualmente útil para neuronas piramidales excitatorias.

<table><tbody><tr><td>Mezclas de control de espiga de ARN ERCC</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fragmentación de ARN</td> New <td>England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA MinElute</td><td>Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasa antártica</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligasa2, truncado</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp magnético&nbsp; perlas</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIseleccionar tamaño selección de perlas</td> <td>magnéticasThermo Fisher</td><td>Gato# B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Gato# 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Gato# 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Gato# 1078</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa de Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Gato# P5147</td><td></td></tr><tr><td>Mensaje Kit Amp II</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA</td><td>kit Illumina</td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizador RNA Pico chip</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizador Chip de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección con fluorescencia e iluminación de campo claro con óptica DIC. (Leica modelo MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Modelo MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Microcapilar de vidrio: Tubos capilares de borosilicato 500/paquete. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, pared= 0,21 mm, Longitud= 150 mm.</td><td>Warner instruments</td><td>Modelo GC100-15, Pedido # 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas capilares</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de enfriamiento de tejidos</td><td>Vibratome Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

secuenciación de arn unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación manual y doble transcripción in vitro con recuentos absolutos secuenciación (diva-seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Secuencia de RNA (RNA-seq) del unicelular es ahora una herramienta ampliamente implementada para análisis de expresión génica. Disponible en el mercado plataformas de secuenciación del RNA unicelular procesan todo entradas células indiscriminadamente. Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación se utiliza a veces, contra la corriente para aislar a una población específicamente etiquetada de interés. Una limitación de FACS es la necesidad de un número elevado de células entradas con fracciones significativamente marcadas, que no es práctico para la recogida y perfiles de poblaciones raras o escasamente marcada neurona del cerebro del ratón. Aquí, describimos un método para manualmente recoger escasa fluorescencia etiquetada neuronas solo de recién disociados tejido de cerebro de ratón. Este proceso permite capturar las neuronas solo etiquetados con pureza elevada y posterior integración con un protocolo en vitro amplificación basada en la transcripción que conserva relaciones de transcripción endógena. Se describe un método de doble amplificación lineal que utiliza identificadores de molécula única (UMIs) para generar cuentas de ARNm individuales. Dos rondas de los resultados de amplificación en un alto grado de detección de genes por célula.

Utilizando el protocolo descrito, GABAergic neuronas fueron manualmente ordenadas (figura 1) y RNA fue amplificado, hecho en una biblioteca de cDNA (figura 2) y secuenciado en profundidad8. Los productos amplificados de RNA (aRNA) oscilaron entre 200 – 4.000 bp en tamaño, con una distribución de pico ligeramente por encima de 500 bp (Figura 3A). La biblioteca de cDNA de grano ...

Este protocolo describe el manual de clasificación procedimiento para aislar neuronas fluorescencia etiquetadas solo seguidas en vitro basada en la transcripción ARNm amplificación de la secuencia de RNA de alta profundidad unicelular.

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Este método puede ayudar a resolver un obstáculo clave en el campo del aislamiento y la secuenciación de una sola neurona. Como la recolección de población específica o una subpoblación de neuronas etiquetadas fluorescentemente de área cerebral definida por el usuario. La principal ventaja de esta técnica es que asegura que la única neurona de interés se captura sin contaminar los escombros.También es relativamente suave, que es importante para los tipos de neuronas frágiles que mueren rápidamente cuando se someten a las presiones de fluidos de la clasificación convencional de FACS. Comience preparando microcapillarios de vidrio tirado con un diámetro de salida de 10 a 15 micras utilizando un tirador capilar. Utilice tijeras finas para cortar la punta del capilar para obtener el diámetro de placa deseado.A continuación, utilice conectores de tubería para conectar un tubo de silicona flexible de 120 a 150 centímetros de longitud con un diámetro interior de 0,8 milímetros a un filtro de jeringa de membrana PVDF de 0,2 micras y una válvula de tubo bidireccional. Preparar 500 mililitros de líquido cefalorraquídeo artificial refrigerado o ACSF y oxigenar burbujeando 5%dióxido de carbono equilibrado a través de una Airstone durante 15 minutos o hasta que la solución se despeje por completo. Prepare tres vasos de 150 mililitros cada uno que contengan 100 mililitros de ACSF.A uno, agregue un cóctel de bloqueadores de actividad. A otro, añadir la fracción de Streptococcus para la proteasa a una concentración final de un miligramo por mililitro. Al vaso final, añadir FBS a una concentración final de 1%y oxigenar con 5% de oxígeno equilibrado de dióxido de carbono a través de una piedra de aire.Por último, haga tres pipetas Pasteur de tallo largo con diámetros de salida decrecientes enrollándolas sobre una llama abierta. Disecciona el cerebro de un ratón eutanasia abriendo el cráneo con una pequeña tijera y extrayendo el cerebro fresco usando fórceps finos sin dañar la corteza. Coloque el cerebro en ACSF refrigerado y oxigenado dejando un Airstone unido a 5% de oxígeno equilibrado con dióxido de carbono durante toda la duración de la seccionamiento.Coloque el cerebro en el mandril del vibratome y corte las secciones coronales o sagitales con un grosor de 300 micras. Recopile tantas secciones como sea necesario para obtener un mínimo de 10 a 50 celdas etiquetadas. Coloque las rodajas en un soporte de rodajas de malla de algodón colocado dentro de un vaso de precipitados para que se bañen en ACSF oxigenado.Mueva las rodajas en el vaso de precipitados que contiene ACSF con bloqueadores de actividad y bloquee durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente mientras burbujea de oxígeno con una Piedra de Aire. Mueva las rodajas al vaso de precipitados que contiene ACSF con la solución proteasa para realizar una digestión leve a temperatura ambiente. Después de la digestión, lavar la proteasa moviendo las rodajas de nuevo al vaso de precipitados que contiene ACSF con solución de bloqueador de actividad durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente.Sigue burbujeando oxígeno. A continuación, prepare un plato Petri de 100 milímetros que contenga ACSF con 1%FBS a temperatura ambiente y mueva secciones individuales al disco para la microdisección. Bajo un ámbito de disecciones fluorescentes, utilice un par de fórceps finos para microsectar áreas y capas de interés que tengan un mínimo de 10 a 50 celdas.Con una pipeta Pasteur, mueva las piezas microdesinscriptadas a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga aproximadamente 0,8 mililitros de 1%FBS en solución ACSF. Valore el tejido diseccionado en el tubo de microfuge a temperatura ambiente. Realice aproximadamente 10 golpes con cada una de las pipetas Pasteur flameadas comenzando con la más grande y terminando con el diámetro de salida más pequeño.Dispensar las células disociadas en un plato de Petri de 100 milímetros que contenga ACSF oxigenado y esperar de cinco a siete minutos para que las células se asienten gradualmente. Observe la señal GFP y RFP bajo un microscopio de disección. Identifique los escombros examinando la morfología bajo la iluminación de campo brillante.Una vez que se haya identificado un área de células con poco desecho, utilice el capilar y adjúntelo al tubo para recoger las células bloqueando el extremo de la válvula de tubo con la lengua. A continuación, coloque el capilar cerca de las células. Suelte el bloque en el capilar y bloquee rápidamente de nuevo para capturar la célula mediante la acción capilar.Mueva el capilar a un plato petri de 100 milímetros con ACSF fresco oxigenado y sople suavemente en el tubo mientras observa la punta capilar bajo la óptica de fluorescencia para dispensar las células en el plato. Repita el procedimiento de recolección hasta que se recojan entre 100 y 150 células, asegurándose de que los contaminantes, como los desechos, sean mínimos en la óptica de contraste de interferencia diferencial de campo brillante. Por último, utilizando una pipeta micro-capilar fresca cada vez, elija una sola célula y expulse en no más de 0,5 microlitros en un tubo de microfuto de 0,2 microlitros que contenga un microlitro de tampón de recolección de muestras con imprimadores.Romper la punta de la pipeta en el tubo de micro-fuge para asegurarse de que la célula permanece en el búfer de recolección. Congele las células poniendo los tubos sobre hielo seco. Conservar en un congelador de menos 80 grados Celsius hasta su procesamiento para amplificación de ARN.Las neuronas GABAérgicas fueron aisladas de la corteza cingulet del cerebro del ratón. El ARN amplificado a partir de las neuronas ordenadas manualmente oscilaba entre 200 y 4.000 pares base en tamaño con una distribución máxima ligeramente superior a 500 pares base. Después de la purificación de cuentas, la biblioteca de cDNA es de tamaño adicional restringido por una segunda ronda de purificación utilizando cuentas para eliminar fragmentos de menos de 200 pares base y para el pico en aproximadamente 350 pares base.La secuenciación mostró un 4.8 veces 10 a la 5a mediana o 6.9 por 10 a la 5a lecturas asignadas promediadas por celda. Después de la eliminación duplicada de ARN utilizando IRI, cada celda tenía una media de 1,0 a la 5a mediana o 1,4 veces 10 a la 5a lecturas únicas promedio por celda. En cada consorcio de controles de ARN externo de célula única, se utilizó un pico de ARN como control interno para calcular el número absoluto de moléculas añadidas a la muestra.Hubo una relación lineal de entrada a los recuentos observados con una pendiente de 0,92 y un cuadrado R ajustado de 0,94. Se detectó un promedio de alrededor de 10.000 genes por neurona única utilizando este procedimiento con más del 95% de las células individuales que detectan más de 6.000 genes. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los biólogos moleculares exploraran el transcriptoma de claras interneuriones corticales de ratón bien caracterizadas, e identificó categorías genéticas selectas que son responsables de codificar la identidad celular.

single-cell-rna-sequencing-fluorescently-labeled-mouse-neurons-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un método para aislar neuronas marcadas con fluorescencia del cerebro de un ratón.

Aislamiento de neuronas marcadas con fluorescencia de un cerebro murino

El ARN total de alta calidad se ha preparado a partir de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratón mediante microdisección de captura láser después de manchar secciones de la médula espinal con Azure B en etanol al 70%. Suficiente ARN (~ 40-60 ng) se recupera de 3.000-4.000 neuronas motoras para permitir el análisis de ARN aguas abajo por RNA-seq y qRT-PCR.

Producción De ARN Para El Análisis Transcriptómico De Los Cuerpos Celulares De La Neurona Motora De La Médula Espinal De Ratón Por Microdisección De Captura Láser

Reportamos un método basado en la Clasificación de Células Activadas Fluorescentes (FACS) para aislar células madre neurales (NSCs) y su progenie de la zona subventricular (SVZ) del cerebro de ratón adulto. Aplicado a ratones transgénicos Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), permite el estudio de la progresión del ciclo celular mediante imágenes en vivo.

Clasificación celular del Neuronales madre y progenitoras Las células del adulto Ratón zona subventricular y Live-imágenes de sus Dinámica del Ciclo Celular

En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Describimos una técnica para perfilar microARN en embriones de ratón tempranos. Este protocolo supera el desafío de la entrada de células bajas y el enriquecimiento de ARN pequeño. Este ensayo se puede utilizar para analizar los cambios en la expresión de miRNA a lo largo del tiempo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

Aquí se presenta un método para secuenciar núcleos individuales aislados del giro dentado de ratón que excluye la mayoría de las neuronas a través de la clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FAN). Este enfoque genera perfiles de expresión de alta calidad y facilita el estudio de la mayoría de los otros tipos de células representadas en el nicho, incluidas las poblaciones escasas, como las células madre neurales.

Clasificación negativa de neuronas de núcleos activados por fluorescencia combinada con secuenciación de ARN de núcleos únicos para estudiar el nicho neurogénico del hipocampo

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Este protocolo combina la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular para aislar y caracterizar los estados de las células microgliales en el cerebelo de los cerebros de ratones postnatales tempranos. Utiliza la disociación enzimática, la centrifugación de Percoll y la inmunotinción para revelar la heterogeneidad de la microglía y mejorar la comprensión de sus funciones en el desarrollo y la enfermedad del cerebelo.

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Aprende a aislar neuronas fluorescentes de ratón mediante clasificación manual para secuenciación de ARN unicelular. Este método permite obtener perfiles de expresión génica de alta profundidad con mínima contaminación.

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq) (Video) | JoVE Journal

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Explorar más videos