Name: Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a cuantificar la estimulación dependiente de anticuerpos del virus Zika en células inmunitarias humanas primarias mediante PCR en tiempo real. Este método evalúa cómo la inmunidad previa contra el dengue afecta la infección por Zika.

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Este trabajo fue apoyado generosamente por 1R21AI129881-01 (a Interpetative), fondos de puesta en marcha de los laboratorios nacionales de emergentes infecciosas enfermedades y la escuela de medicina de la Universidad de Boston.

Las muestras de suero utilizadas en este estudio se obtuvieron de los humanos participantes de una cohorte de Columbia. Recogida de la muestra fue aprobada por la Junta de revisión interna (IRB) en Universidad de Pamplona (Colombia, América del Sur) y Los Potios Hospital8. Las muestras se anónimamente y los investigadores no tenían acceso a información para el paciente. Se revisaron las muestras de suero para el serotipo DENV. Las muestras más fueron confirmadas para neutralizar la infección por DENV in vitro. Para el control, se utilizaron muestras de suero de individuos sanos (HC) de los Estados Unidos.
Nota: Este protocolo se puede utilizar para examinar la replicación de ADE de ZIKV en cualquier tipo de célula humana expresando los receptores de Fcγ. El protocolo consta de tres partes (figura 1).
1. siembra de la célula y configuración de infección
Nota: Para este estudio en particular, los macrófagos primarios humanos o línea de celular U937 mielomonocítica (ATCC-CRL-1593.2) fueron utilizados. Las células fueron mantenidas en Medio RPMI suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) en una incubadora de 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2). Todos los pasos se llevaron a cabo en una bioseguridad nivel 2 (BSL-2) gabinete de seguridad de la biotecnología en condiciones estériles.
<ol><li>Semilla 3 x 104 células por pozo en una placa de 96 pocillos de fondo plano estéril junto con 100 μl de medio y colocarlos en la incubadora de 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Después de la siembra de las células, descongelar las muestras de suero a temperatura ambiente y hacer diluciones seriadas 10 veces (es decir, 1/10, 1/100, 1/1.000, 1/10.000) mediante la mezcla de las muestras en medio libre de suero. Alícuota las diluciones en una placa de 96 pocillos estéril. Usar el virus sin suero como un control adicional.</li>
	<li>Descongelar el stock ZIKV a 37 ° C en un baño de agua durante 1-2 min y transferir rápidamente a hielo para uso futuro.</li>
	<li>Añadir una multiplicidad 0.1 de una cantidad equivalente de tensión ZIKV MR766 infección (MOI) de las alícuotas de suero. Nota: Asegúrese de que el factor de dilución se mantiene constante y el volumen total es de ~ 200 μL; eso es suficiente por triplicado de cada tratamiento. Mantener tres pozos no infectados para utilizar como control negativo para análisis posteriores.</li>
	<li>Incubar las diluciones del suero con el virus añadido en la incubadora de 37 ° C con 5% CO2 durante 1 hora para permitir que los anticuerpos DENV para formar complejos con los viriones Zika (para mayor comodidad, en lo sucesivo como "complejos inmunes").</li>
	<li>Aspire los medios de comunicación de las células que fueron sembradas en la placa de 96 pozos de fondo plano. Lavar las células con estéril de 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS de x 1).</li>
	<li>Añadir 50 μl de los complejos inmunes a cada pocillo e incubar en la incubadora de 37 ° C con 5% CO2 h 2.</li>
	<li>Después de 2 h de incubación, aspirar los medios que contienen complejos inmunes de las células, utilizando un multicanal pipeta y lavar las células 2 x con 1 x PBS para eliminar los complejos inmunes y cualquier virions sueltos.</li>
	<li>Añada 100 μl de frescos medios completo suplementados con 10% FBS a cada bien e incubar las células en la incubadora de 37 ° C con 5% CO2 durante 48 h.</li>
</ol>2. extracción de RNA
<ol><li>Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y traslado al gabinete de seguridad de la biotecnología.</li>
	<li>Aspirar los medios de comunicación, lavar las células 2 x con PBS 1 x y procede a la extracción de RNA. Nota: RNA se puede extraer por cualquier método de elección (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Añadir 250 μl de tampón de lisis celular con 10% β-mercaptoetanol por pozo. Pipeta el búfer y bajar al menos 5 x junto a rayar las células con la punta de la pipeta para acelerar el procedimiento de lisis.</li>
	<li>Transferencia de los lysates de la célula a los tubos nuevos, etiquetados, estériles de 1.5 mL.</li>
	<li>Añadir una cantidad igual de etanol al 70% (250 μL). Pipetear arriba y abajo 4 x - 5 hasta que la mezcla esté clara.</li>
	<li>Transferir la mezcla (~ 500 μl) para etiquetado columnas basadas en silicona en tubos de 2 mL y centrifugar a 15.000 x g durante 30 s. descarte el flujo a través y mantienen las columnas en tubos de la misma.</li>
	<li>Añadir 700 μl de tampón de lavado 1 a cada columna y centrifugue a 15.000 x g durante 30 s. descarte el flujo a través y mantienen las columnas en tubos de la misma.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 cada columna y centrifugue a 15.000 x g por 30 s. descarte el sobrenadante. Repetir este paso 2 x.</li>
	<li>Transferencia de la izquierda de las columnas a nuevos tubos de recogida de 2 mL y centrifugar a 15.000 x g durante 2 minutos, asegúrese de que columnas de sílice totalmente secos y no hay etanol de tampón de lavado 2.</li>
	<li>Deseche los tubos de 2 mL y colocar las columnas de nuevo, estéril, etiquetados, tubos de recuperación de 1,5 mL.</li>
	<li>Agregar a precalentado (42 ° C) 30 μl de agua libre de ARNasa en el centro de cada columna y centrifugar a 15.000 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>Recuperar el ARN eluído y cuantificar las muestras, usando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. Nota: Lo ideal sería determinar la pureza del ARN mediante el cálculo de la relación entre los valores de absorbancia a 260 nm y 280 nm. Proporción de 260/280 de RNA purificado es idealmente entre 1.8-2.0.</li>
</ol>3. cuantitativa de polimerasa en tiempo real la reacción en cadena
Nota: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquier mezcla de verde de SYBR, que generalmente se compone de SYBR Green tinte, Taq ADN polimerasa, Deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) y un tinte pasivo. Cualquier qPCR máquina capaz de la detección de SYBR verde puede utilizarse para realizar la reacción y obtener los datos. Para este experimento, se utilizó un kit de RT-PCR de un paso que tenía un cóctel de SYBR Green I, ROX tinte, Taq DNA polimerasa, dNTPs y una mezcla adicional de la transcriptasa inversa (véase Tabla de materiales). Los cebadores diseñados contra la región envolvente y utilizados en este estudio para cuantificar niveles genómicos ZIKV son CCGCTGCCCAACACAAG por ZIKV qF y CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT por ZIKV-qR. Como control, humana β-2-microglobulina (B2M) se midió y se utiliza para normalizar la expresión de ZIKV (gen housekeeping). Las secuencias de la cartilla para cuantificar la expresión génica de B2M utilizada en este estudio son CTCCGTGGCCTTAGCTGTG para B2M-qF y TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT para B2M-qR. Asegúrese de poner tres repeticiones técnicas para cada muestra el ZIKV y los genes de B2M. La configuración de la RT-PCR se describe brevemente a continuación.
<ol><li>
Configuración de RT-PCR
	<ol>
<li>Uso 100 ng de ARN por muestra.</li>
		<li>Añadir 1 μl de 10 poblaciones de μm de iniciadores de avance y retroceso de un gen en particular para cada reacción.</li>
		<li>Añadir 0,25 μl de mezcla de la transcriptasa reversa por muestra.</li>
		<li>Para cada reacción individual, añadir 12,5 μl de mezcla de SYBR Green.</li>
		<li>Añadir 25 μl de agua. Hacer un master mix de todos los reactivos antes mencionados excepto RNA, alícuota en la placa PCR de 96 pocillos y añadir RNA última.</li>
		<li>Selle la placa con cinta adhesiva transparente.</li>
		<li>Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 1 minuto mezclar los reactivos.</li>
		<li>Poner la placa en la máquina de la qPCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Perfil de RT-PCR Nota: Utilizar el perfil de RT-PCR que se muestra en la tabla 1.
	<ol>
<li>Incubar las muestras a 50 ° C durante 10 minutos para asegurar la síntesis de ADN complementario (cDNA).</li>
		<li>Después de la síntesis de cDNA, activar la Taq ADN polimerasa a 95 ° C durante 5 minutos.</li>
		<li>Realizar 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C 10 s primer recocido y extensión a 60 ° C para 30 s.</li>
		<li>Poner el paso de la curva de fusión adicional (65° C) en el final.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de datos
	<ol>
<li>Seguimiento de la curva de fusión haciendo clic en la ficha de curva de fusión en el programa utilizado para hacer funcionar la máquina de la qPCR, que, idealmente, muestra un solo pico en todas las muestras para un gen determinado confirmar la presencia de sola amplicones y un valor de amplificación if más de 1.6 el algori THM considera 2 como el valor de amplificación de 100% (el valor de amplificación varía según el algoritmo utilizado por la máquina de qPCR). Asegúrese de utilizar incrementos de 0.5 ° C temperatura entre pasos y un mínimo de tiempo de 10 s en el protocolo de curva de fusión, para obtener resultados óptimos.</li>
		<li>Después de asegurarse de que hay un solo amplicon y amplificación buen valor, primero haga clic en la ficha de datos de cuantificación para obtener un ciclo cuantitativo (valor de Ct/Cq) de cada muestra y exportar a Microsoft Excel.</li>
		<li>Una hoja de cálculo, calcular la media de cada muestra utilizando el valor de Ct. A continuación, haga clic en las fórmulas y seleccione la media. Los valores promedio de CT de cada muestra (repetición) se utilizan para su posterior análisis.</li>
		<li>A continuación, calcular la ΔCt utilizando la fórmula ΔCt = promedio de Ct del gen Diana - promedio de Ct del gen de control (en este caso, ΔCt = promedio de Ct del gen ZIKV - promedio de Ct del gen de B2M).</li>
		<li>Calcular ΔΔCt para normalizar los datos (en este caso, ΔΔCt = ΔCt muestras ZIKV - B2M muestras).</li>
		<li>Calcular que el pliegue aumenta la expresión génica escribiendo la fórmula 2^-(ΔΔCt) para cada valor único ΔΔCt normalizado. Los resultados del aumento de doblar para llevar a cabo pruebas estadísticas pueden obtenerse como se indica en anteriores estudios9,10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).</li>
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<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
<li>Charles, A. S., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+a+Dengue-Derived+Monoclonal+Antibody+to+Enhance+Zika+Infection+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Currents%22%5BJournal%5D)">Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro.</a> PLoS Currents. 8, (2016).</li>
<li>Swanstrom, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Virus+Envelope+Dimer+Epitope+Monoclonal+Antibodies+Isolated+from+Dengue+Patients+Are+Protective+against+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

Reactividad cruzada de anticuerpos contra DENV hacia ADE de otros serotipos DENV ha obstaculizado el desarrollo de una vacuna eficaz11. ZIKV pertenece a la misma familia, Flaviviridae y tiene una considerable homología con otros flaviviruses, especialmente DENV12. El objetivo principal de anticuerpos neutralizantes por ZIKV y DENV es la proteína, que comparte una homología de secuencia estructural y cuaternario muy alto entre los dos virus13,</s...

Entre las enfermedades virales transmitidas por mosquitos, la infección Zika es uno de los más clínicamente importantes1. La infección es causada por un flavivirus ZIKV que, en la mayoría de los casos, Aedes aegypti el vector primario1,2. Sin embargo, hay estudios que han reportado Aedes albopictus como vector primario en algunos brotes ZIKV3. Aunque la infección es asintomática en muchos casos, los síntomas más comunes son fiebre, dolor de cabeza y musculares dolor2. No existe ninguna cura o una vacuna para la infección por ZIKV y el tratamiento disponible es principalmente de apoyo. Los brotes recientes de ZIKV en América del sur llevaron a casos severos de la enfermedad y un aumento de aproximadamente 20-fold en el trastorno del desarrollo neurológico en fetos llamado microcefalia2. Como América del sur es una zona endémica de varios arbovirus como virus DENV y del oeste del Nilo, es crucial investigar si inmunidad previa a otros flavivirus(es) desempeña un papel en la severidad de las infecciones ZIKV y enfermedad.
A lo largo de la edad, los virus han evolucionado diferentes estrategias para aumentar sus probabilidades de infectividad para apoderarse de la maquinaria de la célula huésped y suprimir la respuesta antiviral. Uno de los más fascinantes de todos es el uso de anticuerpos previamente inmune anfitrión por los virus para mejorar su replicación con el fenómeno ADE4. ADE a través de los cuatro serotipos de DENV ha sido bien estudiado y demostrado aumentar títulos virales y enfermedad resultado5,6,7. En un estudio in vitro, hemos demostrado realce significativo de replicación ZIKV debido a pre-existir inmunidad DENV en células inmunes humanas primaria8. También hemos demostrado un método in vitro pertinente para cuantificar la capacidad de mejorar la replicación ZIKV en células primarias de anticuerpos preexistente contra DENV.
El protocolo que hemos desarrollado utiliza muestras de suero humano que se prueban para la neutralización de DENV TCID 50 o análisis de la prueba de neutralización de la reducción de placa (PRNT), junto con ZIKV en células biológicamente relevantes o células derivadas de tejidos que pueden infectar ZIKV.

<table><tbody><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>GEMINI</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>iCycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>785BR02188</td><td>N.º de modelo Módulo óptico CFX96</td></tr><tr><td>Microfuge 18 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-1000</td><td>Termocientífico&nbsp;</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>Quantifast SYBR-Kit de RT-PCR de un solo paso&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>204154</td> Se utiliza para el kit de aislamiento de ARN <td>RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy de 1 paso&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74106</td><td>Utilizado para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>RPMI-medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del virus zika en células humanas primarias

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

La reciente aparición del flavivirus Zika y complicaciones neurológicas, tales como síndrome de Guillain-Barré y microcefalia en los bebés, ha llevado a preocupaciones graves de seguridad pública. Entre los factores de riesgo, estimulación dependiente de anticuerpos (ADE) representa la amenaza más significativa, como el reciente resurgimiento del virus Zika (ZIKV) es principalmente en las zonas donde la población ha estado expuesta y está en un estado de inmunidad previa a otros estrechamente relacionados flaviviruses, especialmente el virus del dengue (DENV). Aquí, describimos un protocolo para cuantificar el efecto de los anticuerpos del suero humano contra DENV en infección por ZIKV en las células humanas primarias o líneas celulares.

En la figura 1, hay una ilustración diagramática paso a paso de todos los pasos necesarios para llevar a cabo el protocolo de ADE. Es un diagrama esquemático mostrando el procedimiento entero de ADE de ZIKV debido a inmunidad preexistente a DENV. La figura 2 muestra cómo humano suero muestras se categorizaron en tres grupos diferentes: muestras de la infección confirmada de DENV se refieren como el grupo de infectados con DENV, D...

Se describe un método para evaluar el efecto de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección del virus Zika mediante el uso de suero humano, las células humanas primarias y cuantificación de la infección por reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Este método se puede utilizar para evaluar los efectos de la inmunidad preexistente contra el virus del dengue en la infección por el virus del Zika, utilizando el suero real del paciente humano y las células inmunes humanas primarias. El uso de muestras de suero reales para pacientes humanos y células primarias humanas proporciona una visión más profunda de la mejora dependiente de los anticuerpos del virus del Zika mediante sueros y anticuerpos preinmunes. Este método proporciona información sobre la capacidad de los anticuerpos dentro de la sangre de un paciente para mejorar una infección por virus en otras células humanas.Es importante asegurarse de que los niveles de infección viral son lo suficientemente altos para la detección, pero lo suficientemente bajos como para no abrumar las células o interferir con la interpretación de los datos. Comience por sembrar tres veces diez a las cuartas células en 100 microlitros de medio de cultivo celular por pozo en una placa estéril y plana inferior de 96 pozos. Cuando todas las células hayan sido chapadas, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5%y haga diluciones seriales de 10 veces de muestras de suero humano descongeladas en medio libre de suero.Asegúrese de mantener constantes las diluciones séricas y el factor de dilución para todos los sueros preinmunes antes de agregar las diluciones a las soluciones del virus y las células. A continuación, descongelar la solución de las cepas del virus del Zika en un baño de agua de 37 grados Celsius durante uno a dos minutos antes de transferir rápidamente la población al hielo. Añadir un volumen equivalente de 0,1 multiplicidad de infección del virus del Zika a las alícuotas séricas y colocar la placa en la incubadora de cultivo celular durante una hora para permitir que los anticuerpos del virus del dengue formen complejos con los viriones del zika.Al final de la incubación, lavar las células con 100 microlitros de PBS por pozo y añadir 50 microlitros de complejo inmune a cada pocóteo. Después de las dos horas de incubación, retire el medio y lave los pozos dos veces con 100 microlitros de PBS por pozo para eliminar completamente los complejos inmunológicos y cualquier virión no conectado. A continuación, alimentar las células con 100 microlitros por pozo de medio de cultivo celular complementado con 10%suero bovino fetal.Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Dos días después de la infección, lavar las células dos veces con 100 microlitros de PBS estériles por bien antes de agregar 250 microlitros de tampón de lysis celular con 10%beta mercaptoetanol a cada pozo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces con arañazos para acelerar el proceso de lelisis y transferir los tonos celulares a tubos estériles etiquetados de 1,5 mililitros.Añadir un volumen igual de 70% etanol a cada tubo y pipetear la solución de izado hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces. Cuando las suspensiones de izado estén claras, transfiera cada solución a columnas etiquetadas a base de sílice en dos tubos de recolección de mililitros para centrifugación. Deseche el flujo que mantiene las columnas en los mismos tubos de recogida y agregue 700 microlitros de Wash Buffer 1 a cada columna para una segunda centrifugación.Después de desechar el flujo a través, enjuague las columnas dos veces más con 500 microlitros de Wash Buffer dos por lavado. Después del segundo lavado, transfiera las columnas a nuevos tubos de recogida de dos mililitros para otra centrifugación. Agregue 30 microlitros de agua libre de RNase de 42 grados Celsius al centro de cada columna para la centrifugación y recupere el ARN eluido.Para la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real o el análisis QRTPCR agregue un microlitro de imprimaciones específicas de genes hacia adelante y hacia atrás de 10 existencias micromolares junto con 0,25 microlitros de mezcla de transcriptasa inversa por reacción. Tenga en cuenta que los imprimadores que reconocen el material genético del virus del Zika detectarán genes virales y permitirán la cuantificación de infecciones. A continuación, agregue 12,5 microlitros de SYBR Green Mix seguidos de 25 microlitros de agua a cada reacción añadiendo 15 microlitros de Master Mix en cada pozo de placa QPCR de 96 pozos.Cuando utilice una mezcla maestra, añada 100 nanogramos de la muestra de ARN a la mezcla y pipetee la mezcla maestra en pozos individuales de la placa QRTPCR. Tenga en cuenta que las muestras deben ejecutarse por triplicado en la misma placa QRTPCR. A continuación, ejecute las muestras en una máquina de PCR cuantitativa de acuerdo con los parámetros descritos en la tabla.Al hacer clic en la pestaña de curva de fusión en el software del sistema para supervisar la curva de fusión. La curva de fusión mostrará un solo pico en todas las muestras para un gen en particular para confirmar la presencia de un solo amplón. Para obtener resultados óptimos, utilice incrementos de temperatura celsius de 0,5 grados entre pasos y un tiempo de retención mínimo de 10 segundos en el protocolo de curva de fusión.A continuación, haga clic en la pestaña de datos de cuantificación para obtener un ciclo cuantitativo para cada muestra y exportar los datos a una hoja de cálculo para un análisis de cuantificación adicional. Las muestras de suero humano se pueden clasificar en tres grupos diferentes: muestras confirmadas por infección por el virus del dengue, muestras confirmadas de anticuerpos del virus del dengue y sueros sanos sin anticuerpos neutralizantes del virus del dengue o ARN. Después de 48 horas de infección, el análisis QRTPCR demuestra que la mayoría de los sueros que contienen serotipo uno a cuatro anticuerpos del virus del dengue son capaces de mejorar la replicación del virus del Zika a diferentes niveles.El mayor aumento de los títulos del virus del Zika se encuentra en los macrófagos tratados con serotipo dos y cuatro del virus del dengue que contienen sueros en comparación con el serotipo uno y tres que muestran una inducción relativamente menor del virus del Zika. Es importante mantener un ambiente estéril, usar el equipo de protección personal adecuado y mantener siempre en hielo las muestras de suero del virus descongelado y los reactivos QPCR. Este protocolo se puede modificar fácilmente para estudiar la mejora dependiente de anticuerpos de otro flavivirus, como el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue o el virus del Nilo Occidental utilizando un panel de suero del paciente.Esta técnica será muy útil para llevar a cabo futuros estudios de mejora dependientes de anticuerpos en los campos del arbovirus o la virología. Se deben utilizar en todo momento un equipo adecuado de bioseguridad, dos equipos de protección personal y todos los residuos virales deben descontaminarse en un 10% de lejía durante 30 minutos antes de su eliminación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Este video muestra un ensayo para medir el aumento dependiente de anticuerpos (ADE) de la infección por el virus del dengue utilizando suero de convaleciente del virus del Zika. El ensayo utiliza partículas virales reporteras del dengue (RVP) que codifican una proteína verde fluorescente. Los anticuerpos séricos contra el virus del Zika reaccionan de forma cruzada con los RVP para formar un complejo. Los anticuerpos unidos mejoran la absorción de RVP por parte de las células que expresan el...

Un ensayo in vitro para examinar el aumento dependiente de anticuerpos de la infección viral

El video muestra un ensayo in vitro para la detección de interferones con actividad antiviral contra el virus del Zika, un patógeno humano. Dentro de la célula huésped, el virus del Zika se multiplica al internalizarse, infectando a las células vecinas y creando zonas distintas o placas virales. El interferón tipo I, que actúa como agente antiviral, dificulta la multiplicación del virus, evitando así la formación de placas virales en la monocapa de la célula huésped.

Un ensayo in vitro para la detección de interferones como inhibidores potentes del crecimiento del virus del Zika

Este video muestra un procedimiento para infectar células madre neurales fetales humanas con el virus del Zika. Las células infectadas se pueden utilizar para estudios posteriores.

Infección por el virus del Zika de células madre neurales fetales

El virus del Zika (ZIKV), un patógeno emergente, está relacionado con anomalías del desarrollo fetal y microcefalia. El establecimiento de un sistema eficaz de cultivo de células infecciosas es crucial para los estudios de replicación del ZIKV, así como para el desarrollo de vacunas y fármacos. En este estudio, se ilustran y discuten varios ensayos virológicos relacionados con el ZIKV.

Virus Zika Sistema infecciosa cultivo celular y la<em&gt; In Vitro</em&gt; Profiláctica Efecto de los interferones

Este protocolo describe la recuperación del virus Zika infeccioso a partir de un clon de ADNc infeccioso de dos plásmidos.

Rescate y Caracterización del Virus Recombinante de un Nuevo Mundo Zika Virus Infectious Clone

Se describe un protocolo simple y fácil para medir la mejora dependiente de anticuerpos de la infección por Zika virus suero convaleciente con partículas virales de Dengue virus reportero.

Una citometría de flujo Simple basado en análisis para determinar In Vitro anticuerpo dependiente del realce del Virus del Dengue usando suero convaleciente Zika Virus

Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1- / - modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Aquí, demostramos el uso de la impedancia eléctrica basada en células (CEI) como un método muy fácil y directo para estudiar la infección y replicación del virus Zika en células humanas en tiempo real. Además, el ensayo CEI es útil para la evaluación de compuestos antivirales.

Plataforma de impedancia eléctrica basada en células para evaluar los inhibidores del virus del Zika en tiempo real

Aprende a cuantificar la estimulación dependiente de anticuerpos del virus Zika en células inmunitarias humanas primarias mediante PCR en tiempo real. Este método evalúa cómo la inmunidad previa contra el dengue afecta la infección por Zika.

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

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