Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

Nuestro método para la recolección de células epidérmicas de ratones adultos es útil para aplicaciones aguas abajo como células madre de queratinocitos. Nuestra técnica es altamente reproducible y se puede utilizar junto con procedimientos in vivo en ratones en el contexto del modelo de carcinogénesis de la piel. Después de cosechar muestras dorsales de piel de ratones adultos eutanizados, utilice fórceps autoclaves y un bisturí para colocar una piel dorsal a la vez lado peludo hacia abajo en una placa delgada de Petri y raspar el tejido subcutáneo incluyendo la grasa del tejido de la piel ventral hasta que el tejido es semi translúcido.

Coloque la piel raspada en PBS hasta que se procesen todas las demás pieles restantes. Luego usa un bisturí para cortar las muestras de piel en tiras de 0,5 a una a 1,5 centímetros. Coloque las tiras de lado peludo hacia arriba en un plato estéril de Petri antes de flotar las muestras de lado peludo hacia arriba en la superficie de un PBS de 20 mililitros más dos x solución de gentamicina, complementada con 0.25%trypsin en un plato de plástico de 100 por 20 milímetros petri durante dos horas a 32 grados Celsius.

Al final de la incubación, coloque un plato estéril, plástico y cuadrado de Petri que contenga 15 mililitros de medio de cosecha en una inclinación de 30 grados y use fórceps curvos para transferir cuidadosamente una tira de piel flotante al plato. Sosteniendo una nueva cuchilla de bisturí en un ángulo perpendicular a la piel y usando fuerza suficiente pero no excesiva, raspar la epidermis y los pelos de la muestra en el medio. Cuando todas las tiras hayan sido raspadas, decantar cuidadosamente la célula epidérmica que contiene sobrenadante en un frasco estéril de 60 mililitros que contiene una barra de agitación magnética de 1,5 pulgadas y enjuague el plato Petri con un medio de cosecha adicional para recoger las células epidérmicas restantes.

Lleve el volumen final en el frasco a 30 mililitros con medio fresco, y revuelva la solución de la célula epidérmica a 100 rotaciones por minuto durante 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación de agitación en un gabinete de bioseguridad retire la barra de agitación y filtre la solución celular a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Utilice fórceps y luego una pipeta para presionar los pelos y los materiales del estrato córneo a través del colador para manipular el tejido para liberar las células pilosas atrapadas y utilizar cinco mililitros adicionales de medio de cosecha para liberar las células pilosas atrapadas en el tubo.

Es fundamental que las células epidérmicas y los pelos sean manipulados para liberar las células de los folículos pilosos. Lleve el volumen total en el tubo hasta 50 mililitros con medio fresco y recoja el filtrado celular por centrifugación. Resuspender el pellet en 5 mililitros de medio de cosecha fresca en aproximadamente 20 trituraciones con una pipeta de 5 mililitros.

Tome 0,5 mililitros de dilución de uno a 20 y transfiéralo a un tubo de microfugo de 2 mililitros. Después de mezclar la muestra cuidadosamente, tome 200 microlitros del tubo de microfure y mezcle suavemente con un volumen igual de solución azul tripano al 0,4%. Mezclar suavemente esta solución tres veces y transferir las células a un hemocitomekilómetro para contar queratinocitos nucleados.

Puntuar todas las células azules oscuras como células no viables y anotar pequeñas células de oro y rosa como células viables. El promedio de viabilidad es de alrededor del 80% y el rendimiento final de queratinocitos por ratón debe ser de unos 30 millones de células viables. Después de contar, recoger las células con otra centrifugación, y para el cultivo de masa resuspendir de dos a cuatro veces 10 a la sexta queratinocitos viables por plato de Petri de 35 milímetros en 2 mililitros de medio de cultivo celular.

Para un ensayo de formación de colonias clonogénicas, resuspendir las células a una vez 10 a la tercera queratinocitos por cuatro mililitros de William's E Medium modificado con suplementos en concentración sérica por colágeno recubierto de 60 milímetros de petri en capas de alimentación de ratón suizo irradiado por rayos X 3T3. Para el cultivo masivo, haga crecer los cultivos a 32 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono para el período de cultivo celular adecuado. Cambiar el medio 24 horas después de la siembra inicial para el cultivo de masas y tres veces a la semana a partir de entonces.

Al final del cultivo clonal aspirar el medio y fijar las colonias en 10% formalina tamponada sobre la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, mancha las colonias con 0.5%rhodamine B en agua autoclavada durante una hora, antes de enjuagar los platos en agua fría autoclavada hasta que el agua se despeje. A continuación, incline los platos en sus párpados para que se sequen antes de contar las colonias.

Aquí, se muestran los resultados típicos de los ensayos de formación de colonias de queratinocitos después de varios tratamientos tópicos. Las células madre del folículo piloso suelen conformar aproximadamente el 9% de las células aisladas de la piel dorsal del ratón C57BL/6 adulta, según lo evaluado por la tinción citométrica de flujo para los marcadores de células madre del folículo piloso del ratón. En esta figura se pueden observar las características de crecimiento de las colonias de células madre de queratinocitos después del cultivo en cuatro condiciones medias diferentes.

Después de este procedimiento, las células se pueden utilizar para la citometría de flujo, la clasificación celular activada por fluorescencia, el cultivo celular y los análisis biológicos moleculares. Esta técnica nos ha permitido determinar que el número de células madre epidérmicas es un rasgo cuantitativo y complejo que conduce a la identificación de un nuevo gen regulador de células madre.