Name: Un análisis de transporte de la rodopsina por análisis de la proyección de imagen de alto contenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprende a cuantificar el transporte de rodopsina mutante mediante análisis de imagen de alto contenido. Este método permite evaluar la localización celular y acelerar el desarrollo de tratamientos para la retinitis pigmentosa.

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Agradecemos al Dr. Mark E. Schurdak y descubrimiento de fármacos de la Universidad de Pittsburgh para proporcionar las imágenes de alto contenido y formación inicial. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartida la 4 1 y los anticuerpos anti-rodopsina B630. El plásmido que contiene el cDNA del constructo de Venus rodopsina de ratón fue compartido por el Dr. Nevin Lambert (Universidad de Augusta). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de concesión de la salud EY024992 YC y P30EY008098 de grant de la Universidad de Pittsburgh visión investigación base.

Nota: El rodopsina transporte ensayo.
1. preparación y cultivo de células
<ol><li>Revivir el crio-preservado U2OS estable las células que expresan el tipo salvaje (WT) o proteínas de fusión de Venus de la rodopsina de ratón mutante. Descongelar las células a 37 ° C hasta que quedan sólo los cristales de hielo en el frasco. Nota: Las células U2OS se utilizan en este protocolo porque no se dispone de ninguna línea de células del fotorreceptor para estudios en vitro y la biosíntesis de la ciliar de la rodopsina está reglamentada por mecanismos moleculares similares en células de mamíferos. Además, las células U2OS Fije firmemente a la parte inferior de la placa y tienen grandes cuerpos de la célula, por lo que son ideales para el análisis de transporte de la rodopsina. Siete U2OS estable las células que expresan el peso T4R P23H, P53R, C110Y, D190N y P267L mutantes rhodopsin se utilizan aquí como un ejemplo para mostrar la calidad y fiabilidad de la prueba. Células estables que expresan otros mutantes de la rodopsina u otras proteínas de membrana se pueden utilizar, dependiendo el objetivo del ensayo. Células estables que expresan la rodopsina humana pueden ser utilizadas en este ensayo si está disponible. La rodopsina de ratón fue utilizada aquí porque ratón y proteínas de la rodopsina humana comparten el 95% de homología, y los compuestos identificados por este ensayo será probado en vivo utilizando un modelo de ratón adRP llevando la rodopsina P23H mutación8. Las células estables fueron generadas como se ha descrito anteriormente19. La WT y rodopsina mutante transcripciones fueron cuantificadas por la q-PCR, y los clones de células estables que expresan niveles similares de WT y transcripciones de rodopsina mutante fueron seleccionados para este análisis. La expresión de proteínas de rodopsina fue confirmada por inmunoblot y el immunostaining. El paso de células utilizadas en este ensayo debe ser inferior a 20.</li>
	<li>Transferencia de cada línea de células en un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de medio de cultivo (glucosa alta Dulbecco modificado Eagle (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 5 μg/mL Plasmocin).</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 5 mL de medio de crecimiento celular para cada línea celular. Transferir cada línea de la suspensión celular en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm e incubar a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Subcultivo de las células cuando el plato de cultivo de tejidos alcanza el 90% de confluencia como se describen en la referencia12.</li>
</ol>2. siembra de células en 5.000 células por pozo
Nota: Realice el siguiente procedimiento en una campana de cultivo de tejidos.
<ol><li>Tratar la placa con poli-lisina.<ol>
<li>Un día antes de sembrar las células, tratar una pared de negro y claro placa de 384 pozos inferior con 20 μL/pocillo de solución poli-lisina durante 30 minutos.</li>
		<li>Aspirar el líquido y permitir que todos los pocillos se seque por 1 h. volver a la tapa de la placa y la placa a 4 ° C durante la noche para la siembra de la célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la suspensión de células.<ol>
<li>La cultura de cada línea celular en medio de cultivo en una placa de cultivo de tejido de 100 mm hasta 90% de confluencia.</li>
		<li>Lave cada plato con tampón fosfato salino (PBS) y separar las células con 1 mL de 0.05% tripsina a 37 ° C.</li>
		<li>Resuspender cada línea de células en 10 mL del medio de ensayo (alta glucosa DMEM con 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL).</li>
		<li>Contar las células y diluir cada línea de 1.25 x 105 células/mL con el medio de ensayo de las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Las células de la semilla.<ol>
<li>Use una pipeta multicanal electrónica o un dispensador de reactivo automatizado para despachar 40 μL/pocillo de la suspensión celular en tres columnas por línea celular y llenar columnas 1-21 de la placa de 384 pozos (figura 2).</li>
		<li>Agregar 40 μL/pocillo de U2OS (P23H-rodopsina-Venus) columnas 22-23 y 40 μL/pocillo de U2OS (rodopsina-Venus) a la columna 24, como controles.</li>
		<li>Centrifugar la placa a 300 x g durante 30 s a todas las células en la parte inferior de la placa de 384 pozos. Nota: Evitar golpes físicos al plato después de la siembra de células. De lo contrario, las células serán aplastadas a una de las esquinas de cada pocillo y la placa no será adecuada para la proyección de imagen de alto contenido.</li>
		<li>Incubar la placa de 384 pozos a 37 ° C con 5% CO2 para 3 h de las células a sujetar a la base de la placa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tratamiento de las células con compuestos
<ol><li>Generar un mapa de la placa con condiciones de tratamiento tal como se muestra en la figura 2.</li>
	<li>Preparar 300 μL de 5 x soluciones de trabajo de hasta 15 compuestos en una placa de 96 pocillos.<ol>
<li>Diluir 1 a 15 cps con el medio de ensayo para cinco veces de su concentración final en los pozos A1 para G2 de los 96 pocillos de la placa (figura 2A). Añadir 300 μL del medio de ensayo en H2 bien. Nota: La concentración final de cada compuesto es utilizada en la concentración más efectiva para rescatar el transporte de la rodopsina P23H por HTS12,13.</li>
		<li>Añada 100 μl por pocillo de 2% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 25 μm 9 -cis-retinal que se diluyen en el medio de ensayo a las columnas 11 y 12, respectivamente. Añadir 9 -cis-retinal en luz dévil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La adición de 10 μl por pocillo de 5 x trabajo soluciones a la placa de 384 pozos con las células (figura 2B).<ol>
<li>Utilice una pipeta multicanal electrónica para agregar compuestos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15 a filas A, C, E, G, I, K, M y O de las columnas 1 a 21 (figura 2). Añadir compuestos de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y M a las filas de B, D, F, H, J, L, N y P de las columnas 1 a 21.</li>
		<li>Añadir 10 μl por pocillo de 2% DMSO a columnas de 22 y 24. Añadir 10 μl por pocillo de 25 μm 9 -cis-retinal a la columna 23. Nota: El DMSO se utiliza como un control del vehículo porque todos los compuestos son inicialmente disuelto en DMSO como acción. Columna 22 tratado DMSO células expresando el P23H rhodopsin es utilizada como control 0%. 9 -Cis-retinianas células tratadas expresando la rodopsina P23H se utiliza como el control del 100%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cubrir la placa de 384 pozos con papel de aluminio e incubar la placa a 37 ° C durante 24 h.</li>
</ol>4. Immunostaining sin permeabilización de la membrana a manchar la proteína rodopsina en la superficie celular.
Nota: Evite cualquier detergente en el proceso de inmunotinción todo para mantener intacta la membrana de la célula.
<ol><li>Preparar 4% paraformaldehido (PFA) diluyendo el 16% PFA con PBS en una proporción de volumen 1:4 en una campana de humos químicos. El 4% de transferencia PFA en un reservorio de reactivo.</li>
	<li>Sacar la placa de 384 pozos en un cuarto oscuro con luz roja tenue. Utilice un aspirador de 8 canales conectado a una botella de colección vacío para aspirar suavemente el medio. Utilice una pipeta multicanal electrónica para añadir 20 μl por pocillo del 4% recién preparado PFA a toda la placa de 384 pocillos e incubar por 20 min a temperatura ambiente. Para evitar el desprendimiento de células, siempre punto los consejos del aspirador para el mismo lado de cada bien durante las aspiraciones. No toque el área de medio fondo de cada pozo. Al tomar imágenes, seleccione los campos para evitar que la región afectada por el aspirador. Para incubaciones más de 10 minutos, cubrir la placa de 384 pozos con su tapa para evitar evaporación. Nota: Las células se fijan en un cuarto oscuro para evitar el fotoblanqueo de la isorhodopsin regenerada que afectará el resultado del control de 100%. Después de la fijación, la placa de 384 pozos se puede sacar bajo luz normal.</li>
	<li>Utilice un aspirador de 8 canales para aspirar la PFA en cada pozo y utilizar una pipeta multicanal electrónica para añadir 50 μL por pocillo de PBS. Repetir dos veces más para realizar tres lavados con PBS. PRECAUCIÓN: Los residuos PFA que contiene líquido se recogen en un frasco tapado y debe desecharse como un residuos químicos peligrosos después de la experiencia.</li>
	<li>Bloquear las células añadiendo 20 μl por pocillo de suero de cabra de 5% a toda la placa de 384 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Aspire el suero de cabra 5% y añadir 15 μl por pocillo de 20 μg mL-1 B6-30 la rodopsina de anticuerpo en el suero de cabra de 1% a filas A O. Añadir 15 μl por pocillo de suero de cabra de 1% a fila P para el grupo control sólo anticuerpo secundario.</li>
	<li>Incubar la placa de 384 pocillos a temperatura ambiente durante 90 minutos o a 4 ° C durante la noche. Cubrir la placa de 384 pozos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos.</li>
	<li>Lave la placa 3 veces con 50 μL por pocillo de PBS.</li>
	<li>Aspire PBS y añadir 15 μl por pocillo de 5 μg mL-1 conjugado con Cy3 cabra anti-ratón IgG anticuerpo. Cubra la placa 384-bien con papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Lave la placa 3 veces con 50 μL por pocillo de PBS. Añadir 50 μL por pocillo de PBS que contenga 1 μg mL-1 Hoechst 33342 para teñir los núcleos a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Sellar la placa de 384 pozos con una película transparente antes de la proyección de imagen. Cubrir la placa de 384 pozos con papel de aluminio y almacenar a 4 ° C por hasta una semana si imágenes son tomadas inmediatamente.</li>
</ol>5. proyección de imagen de.
Nota: Este procedimiento de proyección de imagen de alto contenido está adaptado para el sistema de imágenes listado en la Tabla de materiales. Procedimientos pueden ser diferentes si utiliza otros sistemas de proyección de imagen de alto contenido.
<ol><li>Retire la tapa y poner la placa de 384 pozos en el reproductor de imágenes de alto contenido con A1 ubicado en la esquina superior izquierda de la placa.</li>
	<li>Abra el software de adquisición de imagen para configurar los parámetros para la adquisición de la imagen.<ol>
<li>Abra la ventana Configuración de adquisición de la placa y crear nuevo valor o cargar un archivo de configuración existente.</li>
		<li>Seleccione el objetivo 20 x y configurar pixel binning 2 así que el tamaño de píxel calibrado es 0.80 x 0.80 μm. establecer las líneas de exploración como 2.000 y el tamaño de la imagen (W x H) como 1.000 x 1.000 píxeles (800.00 x 800.00 μm) por sitio.</li>
		<li>Seleccione el tipo de placa a ser reflejada. Utilice la información proporcionada por el fabricante de la placa de 384 pozos para llenar en las dimensiones de la placa.</li>
		<li>Seleccione los pozos a ser fotografiada para la placa de 384 pozos.</li>
		<li>Seleccione cuatro sitios a ser reflejada por pozo. Evitar el lado del bien tocado por las puntas de aspiración.</li>
		<li>Seleccione láseres de excitación como 405, 488 y 561 nm. Seleccione filtros de emisión para los canales rojo Texas, DAPI y FITC. Optimizar la potencia del láser y ganancias de cada canal para asegurar el brillo de imágenes tomadas de los pozos de control positivo están menor que el umbral de saturación.</li>
		<li>Seleccionar el foco de bien a bien para el enfoque automático. Seleccione el primer pozo adquirido como el inicial para encontrar las muestras. Sistema autofocus de sitio a todos los sitios.</li>
		<li>Seleccione cuatro promedios por línea para cada canal. Optimizar el valor de Z-offset para cada canal.</li>
		<li>Prueba del 2-3 pozos en las esquinas diagonales de la placa de la pozo 384 para asegurarse de que las imágenes son en enfoque para todos los pozos muestreados, imágenes de todos los sitios por pozo tienen células con más de 40% confluencia e intensidades de fluorescencia de todos los canales están cerca de la mitad saturada en el 100% control de pozos.</li>
		<li>Excepto el método de adquisición de imagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar toda la placa. Ver el reproductor de imágenes hasta que termine la captura de imágenes de la primera columna de la placa para comprobar la calidad de imagen antes de salir del sensor. Saque la placa de 384 pozos y almacenar a 4 ° C para su uso futuro. Nota: Dependiendo del número de sitios seleccionados por bien y los canales de toma, se tarda 40 min a 3 h para terminar la imagen de una placa de 384 pozos.</li>
</ol>6. imagen análisis.
<ol><li>Extraer los datos de imagen utilizando un software de análisis de imagen de alto contenido. Seleccione uno de los pozos de control del 100% (columna 23) para configurar los parámetros.</li>
	<li>Seleccione la Onda celular que como el método de análisis y empezar a configurar.<ol>
<li>Definir los núcleos usando imágenes del canal del DAPI. Escuchar para asegurarse de que las formas de los núcleos definidos en el seleccionado bien encaja bien con las imágenes de núcleos.</li>
		<li>Definir la forma de la célula en el canal FITC donde está reflejada la rodopsina-Venus.</li>
		<li>Definir las áreas de tinción de superficie celular de rodopsina en el canal rojo de Texas.</li>
		<li>Probar el algoritmo actual en 5 pozos para determinar si los ajustes están optimizados. Guardar la configuración y cerrar la ventana de configuración .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecute todos los pozos con el método de análisis optimizado.</li>
	<li>Exportación Objeto número como número de células intactas. Exportar la Intensidad media del canal FITC como intensidad de rodopsina-Venus (Venus de rodopsina INT). Exportar la Intensidad media del canal rojo de Texas como intensidad de la rodopsina en la superficie de la célula (INT de la rodopsina en la superficie celular).</li>
	<li>Abra los datos exportados en un software de hoja de cálculo. Dividir la intensidad de la rodopsina en la superficie celular por la rodopsina-Venus INT como cociente del MEM a total. Calcular el Z'-factores para cada parámetro evaluar la calidad del ensayo. Z′ = 1−3X (STD100% control+STD0% control) / | Significacontrol del 100%−Mean0% control. Nota: A Z'-mayor que 0 indica un ensayo moderado suficiente para una pantalla de alto contenido y un Z factor' factor de entre 0,5 y 1 sugiere un análisis excepcional para una pantalla de alto rendimiento20,21.</li>
	<li>Utilice el software de hoja de cálculo para generar un mapa de calor de dos colores para cada parámetro. Coloque el nombre de líneas celulares en el eje x y los compuestos en el eje y.</li>
</ol>

<ol><li>Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).</li>
<li>Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspective+on+genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).</li>
<li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li>
<li>Stenson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Gene+Mutation+Database%3A+towards+a+comprehensive+repository+of+inherited+mutation+data+for+medical+research%2C+genetic+diagnosis+and+next-generation+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies.</a> Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).</li>
<li>Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mutant+rhodopsins+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).</li>
<li>Athanasiou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+reveals+potential+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).</li>
<li>Chiang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Endoplasmic+Reticulum-Associated+Degradation+of+Rhodopsin+Precedes+Retinal+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration.</a> Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).</li>
<li>Sakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+mechanisms+of+photoreceptor+degeneration+in+a+new+mouse+model+of+the+common+form+of+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa+due+to+P23H+opsin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).</li>
<li>Dryja, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+rhodopsin+gene+in+patients+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).</li>
<li>Sohocki, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+mutations+causing+retinitis+pigmentosa+and+other+inherited+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies.</a> Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+chaperone+of+rod+opsin+and+its+potential+therapy+for+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration.</a> Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assays+to+identify+small+molecules+preventing+photoreceptor+degeneration+caused+by+the+rhodopsin+P23H+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation.</a> Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Drug+Screening+Strategy+for+Detecting+Rhodopsin+P23H+Mutant+Rescue+and+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).</li>
<li>Noorwez, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+chaperone-mediated+in+vivo+folding+and+stabilization+of+the+P23H-opsin+mutant+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).</li>
<li>Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+fate+of+mutant+rhodopsin%3A+quality+control%2C+degradation+and+aggresome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation.</a> Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).</li>
<li>Kaushal, S., Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+in+rhodopsin.+7.+Point+mutations+associated+with+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa.</a> Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).</li>
<li>Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+NIH3T3+cell+lines+expressing+opsin+and+the+P23H+opsin+mutant+identifies+candidate+drugs+for+the+treatment+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa.</a> Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).</li>
<li>Adamus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-rhodopsin+monoclonal+antibodies+of+defined+specificity%3A+characterization+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application.</a> Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).</li>
<li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+mutations+responsible+for+autosomal+dominant+retinitis+pigmentosa.+Clustering+of+functional+classes+along+the+polypeptide+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).</li>
<li>Krebs, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+rhodopsin+retinitis+pigmentosa+and+the+efficacy+of+pharmacological+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, mostramos un análisis de imagen de alto contenido utilizado para caracterizar hits identificados de un HTS La automatización única en estos protocolos es el reproductor de imágenes de alto contenido. El immunostaining y proyección de imagen de la fluorescencia de la rodopsina se han utilizado comúnmente para caracterizar la localización de la rodopsina5,14,15,16. Sin embargo, la cuantific...

Mal plegamiento de la proteína está implicada en la distrofia muscular, degeneraciones neuronales, así como enfermedades cegadoras, incluida la retinitis pigmentosa (RP)1. RP es una degeneración retiniana hereditaria y progresiva asociada a mutaciones en más de 60 genes que afectan a la función y la homeostasis de los fotorreceptores de la barra o la retina pigmentada epitheliums (RPEs)2,3. No hay tratamiento eficaz está disponible para RP. Rhodopsin mutaciones representan alrededor del 25-30% de autosómica dominante (ad) casos RP. Entre los más de 150 rodopsina mutaciones4 (humano Gene mutación de base de datos, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), las mutaciones clase II causan la inestabilidad estructural de la proteína rodopsina que contribuye a la muerte de fotorreceptores de varilla y pérdida visión5,6,7,8. El P23H es la mutación más frecuente de la rodopsina en América del norte, que también es un ejemplo típico de la clase II la rodopsina mutaciones9,10. Debido a su inestabilidad estructural inherente, la rodopsina mal plegada se acumula en el retículo endoplásmico (ER) en células de mamíferos, mientras que el tipo salvaje la rodopsina se encuentra en la membrana plasmática5. La rodopsina misfolded P23H exposiciones mutante dominante negativo citotoxicidad no por haploinsufficiency, pero se relaciona con la activación de ER asociados vía de degradación de proteínas y la organización del segmento externo de varilla interrumpida. Para aliviar el estrés de barra fotorreceptor de la célula, una estrategia es estabilizar el plegamiento nativo de la rodopsina mutante con un chaperonas farmacológicas.
Para lograr este objetivo, se realizó una pantalla de alto rendimiento basado en la célula (HTSs)11,12,13 utilizando un ensayo de complementación de fragmento de β-galactosidasa para cuantificar al mutante de rodopsina P23H transportado en el plasma membrana. El Protocolo simple y robusto de este ensayo HTS nos permitió explorar las actividades de unos 79.000 moléculas pequeñas para cada pantalla. Sin embargo, dado que este ensayo HTS Lee las señales de luminiscencia, falsos positivos, incluyendo los inhibidores de β-gal, compuestos coloreados o citotóxicos están incluidos en la lista esperando ser identificado por un análisis secundario.
El immunostaining tradicional y métodos de proyección de imagen de fluorescencia han utilizado durante años para estudiar el transporte de la rodopsina en las células mamíferas5,14,15,16. Sin embargo, estos métodos convencionales no pueden utilizarse para cuantificar los efectos farmacológicos de más de 10 compuestos hacia transporte de rodopsina porque un análisis fiable de imágenes requiere un gran número de imágenes tomadas bajo una condición altamente consistente, que es no modificable por los métodos convencionales de la proyección de imagen. Aquí, hemos desarrollado un protocolo de imagen de alto contenido de immunostaining basado en como un análisis secundario para cuantificar el transporte de superficie de célula de misfolded rodopsina mutantes11,13,17. Para etiqueta de rodopsina en la membrana de plasma, nos hemos saltado el paso de permeabilización de la membrana de la célula y immunostained los mutantes de la rodopsina por una monoclonal (B6-30) contra la rodopsina reconoce el epitopo del N-terminal de la rodopsina en el lado extracelular de la célula membrana18. Para visualizar la rodopsina mutante en la célula entera, nos fundió rodopsina con la proteína de la fluorescencia de Venus. Por la cuantificación de las intensidades de fluorescencia en canales diferentes de la fluorescencia, que son capaces de obtener varios parámetros de un experimento único, incluyendo la intensidad total de la rodopsina en las células enteras, sobre la superficie de la célula y la relación de fluorescencia de la rodopsina en la superficie celular para en la célula entera. Aplicar este método para estabilizar las células expresan un total de seis mutantes de rodopsina mal plegadas, podemos generar un perfil farmacológico de varias pequeñas moléculas chaperonas hacia estos mutantes. En este protocolo, todas las células son immunostained en una placa de 384 pozos y reflejada usando un sistema automatizado de proyección de imagen bajo una condición de proyección de imagen altamente consistente. Se realiza un análisis de la imagen a cada pocillo, que contiene imágenes de más de 600 celdas para reducir variación debido a la heterogeneidad de las células con diferentes nivel de expresión de proteína y forma celular. El flujo de trabajo de este protocolo se resume en la figura 1. La ventaja de este método es que obtenemos imágenes de alta resolución así como cuantificaciones de múltiples parámetros del análisis basado en imágenes. En general, este protocolo puede ser modificado y aplicado para cuantificar el transporte de cualquier proteína de la membrana mal plegadas de interés.

<table><tbody><tr><td>Células U2OS (rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Células estables generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (T4R-rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Células estables NA generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (P23H-rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Células estables generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (P53R-rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Células estables generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (C110Y-rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Células estables generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (D190N-rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td></td><td>NA Células estables NA generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>Células U2OS (P267L-rodopsina-Venus)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Células estables generadas a partir de células U2OS</td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>Con L-Glutamina, sodio piruvato</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Plasmocina inactivada por calor</td></tr><tr><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>Reactivo de eliminación de micoplasmas</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X soluciones antibióticas concentradas para prevenir la contaminación bacteriana de los cultivos celulares</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0,25%, 1 mM de EDTA en HBSS sin solución</td></tr> de <tr><td>poli-L-lisina</td> de calcio y magnesio <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70.000-150.000, 0,01%, filtrado estéril, Biorreactivo, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplacas PerkinElmer</td><td></td><td>6057300</td><td>Microplacas tratadas con tejido de 384 pocillos con paredes de pocillos negras y un fondo de olefina cíclica ópticamente transparente para la obtención de imágenes de células en análisis</td></tr> <tr><td>de alto contenidoPlaca estéril de 96 pocillos</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>Cultivo de tejidos tratado con tapa de fondo plano, estéril, libre de pirógenos detectables, Rnasa, DNasa y ADN. </td></tr><tr><td>Sailina tamponada de fosfato no citotóxico (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x tampón PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5%, cultivo celular probado</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>Compuestos probados</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Compuestos de NA sintetizados a medida</td><td></td><td>fueron comprados de diferentes proveedores o anticuerpo</td></tr><tr><td>anti-rodopsina B6-30</td> sintetizado a medida <td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Regalo del Dr. Krzysztof Palczewski</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehído</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Sin metanol</td></tr><tr><td>10% Suero de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>Tampón de bloqueo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Solución de tinción nuclear</td></tr><tr><td>Generador de imágenes de alto contenido</td><td>Molecular Devices</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; Sistema de adquisición de imágenes de alto contenido Micro Confocal</td></tr><tr><td>MetaXpress software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaXpress</td><td>Software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (0,5-10 y micro; L)</td> <td>Pipeta</td><td></td><td>manual de 8 canales Rainin 17013802, 0.5-10 y micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (0,5-10c</td><td>Rainin 17013805</td><td></td><td>Pipeta manual de 8 canales, 20-200 y micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta electrónica multicanal (10-200 &mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>Pipeta electrónica multicanal para tareas de pipeteo de microplacas de 96 y 384 pocillos</td></tr><tr><td>Depósito de reactivos de 50 ml</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>Reservador de reactivos para dispensación de pippte multicanal</td></tr><tr><td>Aspirador de 8 canales</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>Adaptador de acero inoxidable de 8 canales para aspirar líquidos de placas de 96 o 384 pocillos</td></tr><tr><td>Excel software de hojas de cálculo</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>El software de hojas de cálculo para el análisis de datos y la generación</td></tr><tr><td>de mapas de calor Origin2018 software de análisis y gráficos de datos científicos</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>El software de análisis de datos para generar las curvas de dosis-respuesta</td></tr></tbody></table>

un análisis de transporte de la rodopsina por análisis de la proyección de imagen de alto contenido

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin causa mutaciones conducen a la muerte de fotorreceptores de varilla que se manifiesta como un autosoma dominante pigmentosa de la retinitis (RP), una progresiva ceguera que carece de tratamiento eficaz. Presumimos que la citotoxicidad de los mutantes de la rodopsina mal plegadas puede ser aliviada por farmacológicamente estabilización de la proteína rodopsina mutante. La mutación P23H, entre las otras mutaciones de la rodopsina de clase II, codifica una proteína mutante de rodopsina estructuralmente inestables que se acumula en el retículo endoplásmico (ER), mientras que la rodopsina de tipo salvaje es transportada a la membrana plasmática en mamíferos células. Realizamos previamente una pantalla basada en la luminiscencia de alto rendimiento (HTS) e identificó un grupo de chaperonas farmacológicas que rescató el transporte de la rodopsina P23H de ER a la membrana plasmática. Aquí, usando un método de immunostaining seguido de un análisis de proyección de imagen de alto contenido, cuantificar la cantidad de la proteína rodopsina mutante en la célula entera y en la membrana plasmática. Este método es informativo y eficaz para identificar los verdaderos éxitos de falsos positivos después de HTS Además, el análisis de imágenes de alto contenido permitió cuantificar parámetros múltiples de un solo experimento para evaluar las propiedades farmacológicas de cada compuesto. Usando este análisis, se analizó el efecto de 11 diferentes compuestos hacia seis mutantes de rodopsina RP asociada, obteniendo un perfil farmacológico del 2-D para una comprensión cuantitativa y cualitativa acerca de la estabilidad estructural de estos mutantes de la rodopsina y eficacia de los diferentes compuestos a estos mutantes.

Nos caracteriza el transporte rodopsina con tres parámetros: la intensidad de la rodopsina-Venus en la célula entera (rodopsina-Venus INT), la intensidad de la inmunotinción de la rodopsina en la membrana plasmática (INT de la rodopsina en la superficie celular) y la relación de mancha de rodopsina en la superficie de la célula a la intensidad de la rodopsina-Venus en la célula entera (cociente de MEM-Total). Un resultado representativo del ensayo de transporte rhodopsin se muestra en la ...

Aquí, describimos un método de imagen de alto contenido para cuantificar el transporte de los mutantes de la rodopsina asociada con retinitis pigmentosa. Un análisis de puntuación de múltiple longitud de onda se utilizó para cuantificar la proteína rodopsina en la superficie celular o en la célula entera.

Un análisis de transporte de la rodopsina por análisis de la proyección de imagen de alto contenido

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

El error de Rhodopsin causa degeneración progresiva de la retina llamada retinitis pigmentosa. Mientras que un método de imagen tradicional tiene una capacidad limitada para cuantificar el transporte de rodopsinas, este ensayo basado en imágenes recientemente desarrollado permite un cribado de alto rendimiento, eliminando falsos positivos. Esta técnica permite una evaluación rápida de la farmacodinámica farmacológica.En el ojo de rescatar el plegado de rodopsila causante de la enfermedad, acelerando así el potencial de un tratamiento para la enfermedad silenciosamente intratable y cegadora, la retinitis pigmentosa. La localización celular de una proteína de membrana es muy importante por su función. Este método se puede modificar y aplicar fácilmente para cuantificar el transporte de cualquier otra proteína de membrana de interés.Asegúrese de preparar un mapa de placas y agregar y aspirar suavemente líquido de cada pozo de la placa, para mantener el número de célula y las condiciones de estado inmunológico consistentes entre las células. Esto producirá un factor Z alto y resultados fiables. Para empezar, sembrar 5000 células por pozo en un negro pared, fondo transparente, poli lisina tratada 384-bien-placa.Incubar la placa a 37 grados celsius con cinco por ciento de CO2 durante tres horas para que las células se adhieran a la parte inferior de la placa. A continuación, utilice una pipeta multicanal para añadir 10 microlitros por pozo de soluciones de trabajo 5X, de acuerdo con un mapa de placas predeterminado como el que se muestra aquí. Ahora, agregue 10 microlitros por pozo de 2%DMSO a las columnas 22 y 24.Además, agregue 10 microlitros por pozo de 25 micromolares 9-cis-retinal a la columna 23 en una habitación oscura bajo la luz roja tenue. Cuando termine de cargar todos los diversos compuestos de prueba, cubra la placa con papel de aluminio e incubar a 37 grados Celsius durante 24 horas. Saca la placa de 384 pozos en una habitación oscura con luz roja tenue.Aquí, utilizando el aspirador de 8 canales, conectado a una botella de recogida al vacío, para aspirar suavemente el medio de los pozos de la placa. A continuación, utilice una pipeta multicanal para agregar 20 microlitros por pozo de 4%Paraformaldehído recién preparado a toda la placa de 384 pozos, y fije las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, coloque la placa en la luz normal.Allí, utilice un aspirador de 8 canales, para aspirar el Paraformaldehído en cada pozo, y utilice una pipeta multicanal para agregar 50 microlitros por pozo de PBS. Aspirar y reemplazar el PBS para un total de tres ciclos de lavado. Luego, agregue 20 microlitros por pozo de 5% de suero de cabra a cada pozo, e incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de la incubación, aspirar los pozos, y añadir 15 microlitros de 20 microgramos por mililitro B630 anticuerpo anti-rhodopsin, en 1%suero de cabra a los pozos en las filas A a O.Next, añadir 15 microlitros por pozo de 1%suero de cabra a la fila P para el anticuerpo secundario sólo grupo de control. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 90 minutos, o a cuatro grados centígrados durante la noche. A continuación, cubra la placa con papel de aluminio para evitar el fotoblanda de los fluoróforos.A continuación, lave la placa tres veces con 50 microlitros por pozo de PBS. Después del último lavado, aspirar el PBS, y añadir 15 microlitros por pozo de cinco microgramos por mililitro de anticuerpos IgG anti-ratón de cabra conjugados Cy3. Cubra la placa con papel de aluminio e incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora.Después de la incubación, lave el plato tres veces. A continuación, agregue 50 microlitros por pozo de PBS, que contienen un microgramo por mililitro de tinción de Hoechst a temperatura ambiente durante 15 minutos. Por último, selle la placa del pozo con una película transparente, cúbrala con papel de aluminio y guárdela a cuatro grados centígrados durante una semana.Retire la lámina y coloque la placa de muestra en un imager de alto contenido, con A1 colocado en la esquina superior izquierda de la placa. A continuación, abra el software de adquisición de imágenes para configurar los parámetros para la adquisición de imágenes. Abra la ventana de configuración de adquisición de placas y cree una nueva configuración o cargue un archivo de configuración existente.Seleccione el objetivo 20X y configure el binning de píxeles como dos, de modo que el tamaño de píxel calibrado sea de 0,80 por 0,80 micras. A continuación, establezca las líneas de escaneado como 2000 y el tamaño de la imagen como 1000 por 1000 píxeles por sitio. A continuación, seleccione el tipo de placa que desea establecer la imagen.Utilice la información proporcionada por el fabricante para rellenar las dimensiones de la placa. Ahora, seleccione los pozos que se van a crear imágenes junto con cuatro sitios para ser imageados por pozo. Evite el lado del pozo, que son tocados por las puntas de aspiración.Para imágenes, seleccione láseres de excitación como 405, 488 y 461 nanómetros. A continuación, seleccione los filtros de emisión para los canales DAPI, FITC y Texas Red. Optimice la potencia láser y las ganancias de cada canal, para garantizar que los pozos de control positivos no estén saturados.Seleccione bien para enfocar bien para el enfoque automático. A continuación, seleccione el pozo inicial que se va a adquirir y establezca el foco automático del sitio para todos los sitios. Además, seleccione cuatro promedios por línea para cada canal y optimice el valor de desplazamiento Z para cada canal.Validar, que todo está correctamente configurado, probando primero de dos a tres pozos en las esquinas de la placa, para asegurarse de que las imágenes están en el foco para todos los pozos probados. A continuación, compruebe que las imágenes de todos los sitios por pozo tienen celdas con más del 40% de confluencia. Por último, compruebe, que las intensidades de fluorescencia en todos los canales están casi la mitad saturadas en los pozos de control 100%.A continuación, guarde el método de adquisición de imágenes y ejecute toda la placa. Observe el imager hasta que termine de capturar imágenes de la primera columna de la placa para comprobar la calidad de la imagen antes de salir del imager. Cuando haya terminado, retire la placa y guárdela a cuatro grados Centígrados para su uso futuro.Extraiga los datos de imagen utilizando un software de análisis de imágenes de alto contenido. Seleccione uno de los pozos de control 100% en la columna 23 para configurar los parámetros. En primer lugar, seleccione la puntuación de celda de longitud de onda múltiple como método de análisis y comience a configurar los ajustes adicionales.Defina los núcleos utilizando imágenes del canal DAPI. Vista previa, para asegurarse de que las formas de núcleos definidos en el pozo seleccionado encajan bien con las imágenes de núcleos. A continuación, defina la forma de la celda en el canal FITC, donde se crea la imagen de Rhodopsin Venus.Para lograr esto, configure diámetros mínimos y máximos de cada celda, intensidad mínima de fluorescencia sobre el fondo, así como el área mínima de cada celda. Ahora, defina las áreas de manchas de la superficie celular de rodopsina en el canal Rojo de Texas, estableciendo los diámetros mínimo y máximo de la forma celular, la intensidad de fluorescencia de minium sobre el fondo, así como el área mínima de cada célula manchada. Pruebe el algoritmo actual en cinco pozos para determinar si la configuración está optimizada.A continuación, guarde los ajustes y cierre la ventana de configuración. Ejecute todos los pozos con el método de análisis optimizado. Cuando haya terminado, exporte el número de objeto como el número de celda intacto.Exporte la intensidad media del canal FITC como la intensidad de Rhodopsin Venus, y exporte la intensidad promedio del Canal Rojo de Texas como intensidad Rhodopsin en la superficie celular. Utilice el software de hoja de cálculo para generar un mapa de calor de dos colores para cada parámetro. Organice el nombre de las líneas de celda en el eje X y los compuestos en el eje Y.Aquí, nuestras imágenes de P23H rhodopsin Venus trataron células U2OS, expresando fluorescencia de Venus en verde, y inmuno-manchado de la superficie celular en rojo. Las células fueron tratadas con DMSO o cinco micromolares 9-cis-retinal. El ensayo de transporte de rodopsila, comparando la cantidad de rodopsin en toda la célula bajo diversas condiciones, muestra una recuperación significativa en la línea celular mutante P23H, cuando se trata con 9-cis-retinal.Además, la intensidad de rodopsin en la superficie celular, y la proporción de la mancha de rodopsila en la superficie celular a la intensidad de la venus rodopina en toda la célula, no son significativamente más bajas para el mutante P23H, en comparación con el tipo salvaje de rodopsino tratado con DMSO. Un mapa de calor es una manera eficiente de comparar la cantidad media de rodopsila y la localización por celda entre varios mutantes. Aquí, los controles de tipo salvaje y seis mutantes de rodopsila se enumeran horizontalmente, y los efectos de los tratamientos compuestos se comparan verticalmente.De acuerdo con estudios anteriores, la intensidad de la rodopsin en la superficie celular y la proporción de la mancha de rodopsila en la superficie celular a la intensidad de La venus rodopsin son menores para los seis mutantes en comparación con el tipo salvaje tratado con DMSO. Los compuestos uno, dos, seis y nueve aumentaron significativamente la proporción de manchas de rodopsina en la superficie celular a la intensidad de la venus rodopsina en mutantes de rodopsina T4R, P23H, D190N y P267L, lo que sugiere que estos compuestos rescatan el transporte de estos mutantes de rodopsin a la membrana plasmática. Tenga en cuenta que las celdas deben estar entre 50 y 70%confluentes antes de la fijación, ya que esto es fundamental para el análisis de imágenes.Además, mostramos imágenes de pozos en todo el plato. Asegúrese de que las imágenes enfocadas, y que la fluorescencia, que no salen, tienen todo el valor de umbral para cualquier canal. Hasta un compuesto de selección, que el rescate mal plegado rhodopsin transporte, podemos validar el proceso, a continuación, pasar la eficacia de estos compuestos in vivo, utilizando un modelo de ratón que expresa el mutante rhodopsin P23H.Este método nos permite cuantificar la cantidad de proteína de membrana y su localización. Por lo tanto, es una gran herramienta para micro mistake iniciado en proteína de membrana por ayuda, salvo y degradación. Paraformaldehído, como en este experimento, tiene procedimientos que implican el manejo de este reactivo.Se hará bajo el capó. Los residuos que incluyan este reactivo deben eliminarse adecuadamente como un producto químico peligroso.

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Investigación

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