Name: Establecimiento de líneas de células Overexpressing DR3 para evaluar la respuesta apoptótica a la terapéutica anti-mitotic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprende a establecer líneas celulares HT29 con sobreexpresión estable de DR3 mediante transfección retroviral para estudiar la apoptosis inducida por agentes antimitóticos y evaluar respuestas terapéuticas.

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Este trabajo fue apoyado por becas de 53110000117 (a GW) y 043222019 (a X.W.) de la Universidad de Tsinghua.

Tenga en cuenta que todos los experimentos de ratón aquí descritos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad Tsinghua.
1. generación de líneas de celulares sobreexpresión DR3
<ol><li>Construir el plásmido de expresión DR3 (pMXs-IRES-DR3-FLAG) mediante la inserción del cDNA integral DR3 con 3 x bandera en el c-terminal en vector retroviral pMXs-IRES-Blasticidin en los sitios de restricción de BamHI/XhoI.</li>
	<li>Cultivar células de Plat-A en platos de 60 mm con 4 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM). Al día siguiente, cuando las células alcanzan 80% - 90% de confluencia, transfectar las células con 2 μg de plásmido pMXs-IRES-DR3-bandera usando el reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) según manual del fabricante de la20.</li>
	<li>Después de 72 h, recoger el sobrenadante filtrado a los medios de comunicación utilizando un filtro estéril de 0,45 μm y mantener la suspensión viral en la oscuridad a 4 ° C.</li>
	<li>Cultivar células HT29 en DMEM en un plato de 60 mm e incubar las células a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Al día siguiente, cuando las células alcanzan 30% - 50% de confluencia, infectar las células con 2 mL de la suspensión viral en presencia de 8 μg de 1, 5-Dimetil-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide por mililitro de suspensión viral. Después de 4-6 h de incubación a 37 ° C, aspirar la suspensión viral, añadir 4 mL de DMEM fresco y vuelva el plato a la incubadora.</li>
	<li>Desechar los medios de comunicación desde el postinfection de 24 h de platos y lavar cuidadosamente las células con 2 mL de PBS precalentadas. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA a las células e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.</li>
	<li>Después de observar al microscopio con 10 aumentos que ha separado la mayoría de las células, parar la tripsinización con 2 mL de DMEM completo con 10% suero bovino fetal (FBS). Recoge la suspensión de células en un tubo de 15 mL y centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 10 mL de DMEM. Mezclar por pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Diluir las células por los factores de 30, 100 y 300. Semilla de las células en platos de 150 mm con 20 mL de DMEM que contenía 1 μg/mL blasticidin. Incubar en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2 ~ 1-2 semanas.</li>
	<li>Durante este período, observar el día a día con un microscopio invertido con 10 aumentos. Marque las colonias bien aisladas en la parte inferior del plato cuando el diámetro de la Colonia es aproximadamente 1-2 mm.</li>
	<li>Aspire el medio y lavar las células con 3 mL de PBS precalentada. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA en un plato de 60 mm. Use pinzas estériles para recoger cilindros de clonación estériles esterilizados y colocarlos en el plato de 60 mm. Recoger los cilindros que contienen tripsina-EDTA y colocarlos suavemente sobre las colonias marcadas. Asegúrese de que cada cilindro de clonación sólo contiene una colonia y evitar la contaminación con las colonias cercanas.</li>
	<li>Vuelva el plato a la incubadora durante 3 minutos.</li>
	<li>Después de 3 minutos, compruebe las células bajo el microscopio con un aumento 10 X para ver si han separado. Cuando las células han elevado, añadir 70 μL de medio de cultivo para cada cilindro para inactivar la tripsina. Mezclar suavemente la suspensión de células con una pipeta μL 200. Asegúrese de que no se mueva el cilindro durante este proceso.</li>
	<li>Transferir la suspensión de células de cada colonia a dos placas de 24 pocillos que contienen 1 mL de DMEM por pozo. Añadir 30 μL de suspensión de células por pocillo en placa A y 70 μL en los correspondientes pozos en placa B. etiqueta las placas correctamente y ponerlos en la incubadora.</li>
</ol>2. verificación de la línea de celular de sobreexpresión de DR3
<ol><li>Cuando las células en la placa B en 90% de confluencia, eliminar los medios de comunicación y lavar cuidadosamente las células con 1 mL de PBS. Completamente quitar PBS y lyse las células con 50 μL de 1 x de buffer de carga SDS-PAGE. Transferencia de los lysates de la célula de la placa de 24 pocillos para tubos de centrífuga de 1.5 mL y hervir las muestras por 10 min a 100 ° C.</li>
	<li>Ejecutar las muestras en el gel de sulfato (SDS) de dodecilbenceno sódico al 10% en una tensión constante de 80 V durante 15 minutos y, luego, a 120 V durante 1 hora.</li>
	<li>La proteína de transferencia a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro por transferencia húmedo en una corriente constante de 400 mA durante 2 horas.</li>
	<li>Prueba la expresión DR3 en diferentes clones con el anticuerpo de anti-FLAG, usando las células HT29 de tipo salvaje como un control negativo (figura 1). Diluir el anticuerpo primario por un factor de 5.000 en 5% leche descremada en polvo que se disuelve en TBST (solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% Tween-20). Incubar la membrana con el anticuerpo de la bandera a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Lavar la membrana con TBST por agitación en un agitador decoloring a 200 rpm en RT. actualización TBST cada 5 minutos para un total de 15 minutos el tiempo de lavado.</li>
	<li>Incubar la membrana con el anticuerpo secundario anti ratón diluido por un factor de 10.000 en 5% de leche descremada a 4 ° C durante 5-6 h.</li>
	<li>Lavar la membrana otra vez como se describe en el paso 2.5.</li>
	<li>Detectar la expresión bandera usando el substrato de la quimioluminescencia realzada occidental (ECL) y la imagen de la membrana con un sistema de documentación de gel (véase Tabla de materiales). Identificar los clones expresando DR3 como los clones positivos.</li>
	<li>La transferencia de los clones en la placa A que corresponden a los clones positivos en placa B a una placa de 6 pozos y continuarán amplificar las células hasta el crecimiento de ellos en platos de 10 cm. Hacer reservas congeladas de las células de cultivo de clones positivos y almacenarlas a-80 ° C para su uso futuro.</li>
</ol>3. evaluación de la respuesta apoptótica de las células a agentes antimitótica
Nota: Diazonamide es una nueva clase de productos naturales marinos que tiene notable actividad en la inhibición de crecimiento de la célula de cáncer, que refleja otros agentes desestabilizadores de tubulina21. Sin embargo, su modo de acción sigue siendo confuso. Para probar la respuesta celular de las células a agentes antimitótica, paclitaxel y diazonamide fueron utilizados para tratar las células HT29 de tipo salvaje y las células HT29-DR3. Las drogas fueron disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO) para hacer las reservas de 10 mM y, luego, más diluidas a concentraciones diferentes: 30 nanómetros, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM y 10.000 nM en DMSO.
<ol><li>Recoger las células HT29 y HT29-DR3 por tripsinización. Medir la densidad de células usando un contador celular automático. Luego, las células en placas de 12 pozos en DMEM con una densidad de 3 x 104 células por pocillo de la semilla. Al día siguiente, añadir 10 nM diazonamide y utilizar DMSO 1% como control negativo. Después de 48 h de tratamiento, imagen de las células bajo un microscopio en 10 X de ampliación (figura 2).</li>
	<li>Semilla HT29 y HT29-DR3 células en placas de 96 pocillos en DMEM con una densidad de 3 x 103 células por pozo y permitan crecer durante la noche a 37 ° C. Luego, añade las concentraciones diazonamide de escalada de dosis de 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM y 100 nM para cada pocillo, utilizando DMSO 1% como control negativo.</li>
	<li>Después de 48 h de tratamiento, medir la viabilidad de las células usando un kit de ensayo de viabilidad celular basado en luminiscencia según el manual del fabricante.<ol>
<li>Saque la placa de 96 pocillos de la incubadora y dejar reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, añada 50 μl de los reactivos de ensayo a cada pocillo, agitar la placa a temperatura ambiente por 2 min para lyse las células e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos otro Determine de la luminiscencia de cada pozo con un lector de microplacas (figura 3). Nota: La viabilidad celular representa la intensidad de la luminiscencia relativa de cada uno bien a bien que el control tratados con DMSO 1%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizar ratones desnudos de seis semanas de edad hembra de BALB/c para un en vivo estudio14. Nota: Los ratones fueron mantenidos en condiciones libres de patógenos específicas.<ol>
<li>Trypsinize células HT29 y HT29-DR3 y, entonces, parar la tripsinización con DMEM precalentada a 37 ° C. Recoger la suspensión de células en un tubo de 50 mL y centrifugar las células a 1.000 rpm por 10 min a RT. descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en medio DMEM sin SFB. Centrifugar las células otra vez y resuspender el precipitado de células en PBS.</li>
		<li>Contar las células usando un contador celular automático y diluir las células a una concentración de 2,5 x 107 células/mL con PBS. Generar tumores a través de una inyección subcutánea de 200 μL de la suspensión de células HT29 o HT29-DR3 en el flanco derecho de cada ratón (5 x 106 células/ratón)22.</li>
		<li>Medir el volumen del tumor (TV) con pinzas cada 2 d después del trasplante. Calcular el TV usando la siguiente fórmula: TV = 1 / 2L x W x W (aquí, W: tumor ancho, L: longitud de tumor). Cuando el volumen del tumor promedio alcanza alrededor de 100 mm3, aleatorizar los ratones en el control o en el grupo tratado (n = 6 por grupo) e iniciar el tratamiento.</li>
		<li>Preparar la solución de paclitaxel como sigue. En primer lugar, disolver paclitaxel totalmente en etanol al 5% del volumen total y, a continuación, añadir 5% del volumen final de polioxil 35 hidrogenada el aceite de ricino. Por último, constituyen el 90% restante del volumen con D5W (dextrosa 5% en agua, pH 7,4).</li>
		<li>Inyectar el paclitaxel por vía intravenosa en una dosis de 20 mg/kg 3 veces por semana durante dos semanas. Medir el tumor volumen y el peso corporal 3 x una semana14. Terminar el experimento y eutanasia a los animales si el peso del cuerpo disminuye en un 20% o el volumen del tumor alcanza unos 2.000 mm3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Recillas-Targa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+for+gene+transfer%2C+expression%2C+knockdown%2C+and+chromatin+influence+in+mammalian+cell+lines+and+transgenic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals.</a> Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+BCR%2FABL-induced+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Animal models of BCR/ABL-induced leukemias.</a> Leukemia & Lymphoma. 11, 57-60 (1993).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+correction+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+ex+vivo+gene+therapy.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England.</a> Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).</li>
<li>Roesler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation%2C+self-inactivating+gp91%28phox%29+lentivector+corrects+the+oxidase+defect+in+NOD%2FSCID+mouse-repopulating+peripheral+blood-mobilized+CD34%2B+cells+from+patients+with+X-linked+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease.</a> Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).</li>
<li>Zhou, J., Giannakakou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+microtubules+for+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry+-+Anti-Cancer+Agents%22%5BJournal%5D)">Targeting microtubules for cancer chemotherapy.</a> Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).</li>
<li>Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+agents%3A+when+mitochondria+become+essential+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).</li>
<li>Bhalla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-targeted+anticancer+agents+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis.</a> Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Bhat, K. M., Setaluri, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins+as+targets+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).</li>
<li>Bates, D., Eastman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+destabilising+agents%3A+far+more+than+just+antimitotic+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).</li>
<li>Qi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-mitotic+chemotherapeutics+promote+apoptosis+through+TL1A-activated+death+receptor+3+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells.</a> Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).</li>
<li>Marsters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apo-3%2C+a+new+member+of+the+tumor+necrosis+factor+receptor+family%2C+contains+a+death+domain+and+activates+apoptosis+and+NF-kappa+B%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B.</a> Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).</li>
<li>Chinnaiyan, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+by+DR3%2C+a+death+domain-containing+receptor+related+to+TNFR-1+and+CD95%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95.</a> Science. 274 (5289), 990-992 (1996).</li>
<li>Xu, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+3+mediates+TNFSF15-+and+TNFalpha-induced+endothelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).</li>
<li>Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TL1A-induced+NF-kappaB+activation+and+c-IAP2+production+prevent+DR3-mediated+apoptosis+in+TF-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+of+TWEAK-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways of TWEAK-induced cell death.</a> Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).</li>
<li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning%3A+powerful+tools+in+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li>
<li>Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazonamide+toxins+reveal+an+unexpected+function+for+ornithine+delta-amino+transferase+in+mitotic+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).</li>
<li>Hassan, M. S., von Holzen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Model%3A+Xenograft+Mouse+Models+in+Esophageal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma.</a> Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).</li>
<li>Potter, H., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transfection by electroporation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9, Unit9 3 (2010).</li>
<li>Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effects+of+transfection%3A+the+potential+for+misinterpretation+of+gene+expression+data+generated+from+transiently+transfected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells.</a> Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).</li>
<li>Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+responses+in+the+HeLa+proteome+subsequent+to+transient+plasmid-mediated+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).</li>
<li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+the+toxicogenomics+and+the+genotoxic+potential+of+a+cationic+lipid-based+gene+delivery+nanosystem+in+human+alveolar+epithelial+a549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que declarar.

En este manuscrito, se describe un método para generar líneas de células estables de HT29-DR3. Las células HT29-DR3 son un modelo para el estudio de los mecanismos moleculares por los cuales DR3 contribuye a la apoptosis inducida por agentes antimitótica. Este enfoque es versátil y repetible. Para garantizar el éxito del procedimiento, cuatro pasos claves del protocolo necesitan ser considerados. En primer lugar, con el fin de producir un alto suficiente título de virus, se recomienda realizar la transfección de ADN cuan...

Expresión de genes heterólogos se emplea a menudo para estudiar la función de los genes de interés. Dos métodos, transfección transitoria y estable, se utilizan predominantemente en las células y biología molecular para insertar un segmento de ADN o ARN en un anfitrión célula1,2. Transitorio transfected ADN o ARN no puede transmitirse a células de la hija, por lo que la alteración genética puede conservarse sólo durante un período corto de tiempo. Por otra parte, en las células transfected estable, genes exógenos se integran en el genoma de la célula anfitrión, mantener su expresión en la línea celular. Así, la transfección estable es un método que generalmente se reserva para la investigación en la regulación genética a largo plazo. La línea celular estable también puede trasplantarse como xenoinjertos en modelos de ratón in vivo de estudio3. Transfección estable puede dividirse en dos categorías: virales y nonviral. En comparación con transfección nonviral, infección viral puede transferir genes en una variedad más amplia de células humanas con una mayor eficiencia4,5,6,7. Además, una línea celular estable de un solo clon ofrece la ventaja de la homogeneidad y pureza clonal.
División y crecimiento incontrolados de células son las más características del cáncer. En ajustes clínicos, agentes antimitótica son los tratamientos principales para muchos tipos de tumores8. Sin embargo, no se puede ignorar algunas limitaciones significativas de agentes antimitótica. En primer lugar, estas quimioterapias también pueden matar a las células normales junto con las células cancerosas no deseadas y, por lo tanto, pueden resultar en efectos secundarios graves8. Segundo, antitubulin medicamentos no son eficaces contra todos los tipos de tumores, a pesar de expresión ubicua de la tubulina en una amplia variedad de diferentes tejidos como una proteína citoesquelética9,10. No está claro porqué antitubulin agentes mostraron eficacia prometedora contra el ovario, pulmón y cánceres hematológicos en el tratamiento clínico, pero no en riñón, colon y los cánceres de páncreas11. Por último, incluso los pacientes con el mismo tipo de tumor pueden responder a las antimitotics diferentemente de una manera impredecible. Puede haber una molécula efectora clave que afecta a la sensibilidad de diferentes pacientes a agentes antimitótica, dando por resultado los diversos resultados en el tratamiento clínico12. Por lo tanto, la potencial sensibilidad diferencial de los pacientes al tratamiento antimitótica debe tenerse en cuenta para optimizar las intervenciones terapéuticas13.
Una pantalla de biblioteca de siRNA de todo el genoma de alto rendimiento demostró que DR3 caída puede hacer sensibles células resistentes a drogas antimitótica, implicando un papel para DR3 en la apoptosis inducida por la quimioterapia14. Como miembro de la superfamilia de receptores (TNFR) factor de necrosis tumoral, DR3 se ha divulgado para mediar la apoptosis de las células en varios sistemas15,16,17,18. Así pues, nos propusimos establecer líneas celulares estables overexpressing DR3 para estudiar los mecanismos moleculares por el cual droga antimitótica induce apoptosis. Un modelo de celular adecuado para el estudio de sobreexpresión de DR3 se puede proporcionar por la línea de celular del cáncer de colon humano HT29, que fue encontrado para ser DR3-deficiente. Además, en la clínica, cánceres de colon son insensibles a fármacos antimitótica19.
En este artículo, describimos un método que permite la generación de una línea celular estable de HT29-DR3 a través infección retroviral. Además mostramos cómo validar la expresión DR3 en estas células mediante western blot y cómo evaluar la sensibilidad a agentes antimitótica mediante un análisis de viabilidad de la célula y la observación morfológica. Las células son amplificadas de clones individuales y, por lo tanto, tienen la ventaja de un fondo genético homogéneo. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 permitido para la visualización de DR3 celular por microscopia y análisis de la gene expresión y proteína interacción por métodos bioquímicos. Además, las células pueden ser investigaciones en ratones para analizar la progresión del tumor en respuesta a antimitotics en vivo14.
El sistema de células HT29-DR3 presentado aquí ofrece una herramienta efectiva para estudiar los mecanismos moleculares de cómo antimitotics matar células de cáncer14. Puesto que la sobreexpresión y líneas celulares de precipitación son herramientas comunes para estudiar la función genética, este protocolo puede ser adaptado fácilmente a otros genes de interés o de otras líneas celulares y, así, se convirtió en un método ampliamente utilizado.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>Suplementado con 10% de FBS y 1% de Penicilina/Estreptomicina</td></tr><tr><td>Ensayo de viabilidad de células luminiscentes</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Dimetil-1,5-diazaundecametileno polimetobromuro Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag</td><td>anticuerpo Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29 línea celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A línea celular</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonación</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Lector multimodo de imágenes celulares</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 12 pocillos</td><td>Nest</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo celular de 60 mm</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga de 15</td><td>mL Nest</td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0,22 y mu; m filtro estéril</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 Pozos, Microplaca de Poliestireno Blanco&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL Sustrato</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agitador decolorante &nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Semiraje Reducido</td><td>Medio Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de líneas de células overexpressing dr3 para evaluar la respuesta apoptótica a la terapéutica anti-mitotic

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

Estudiar la función de un gen de interés se logra mediante la manipulación de su nivel de expresión, como su expresión con líneas celulares de sobreexpresión de aumentando o disminuyendo su expresión con líneas celulares de precipitación. Transfección transitoria y estable son dos métodos que se utilizan para la expresión de genes exógenos. Transitorios de la transfección sólo es útil para la expresión a corto plazo, mientras que la transfección estable permite genes exógenos a integrarse en el genoma de la célula huésped donde se se expresa continuamente. Como resultado, la transfección estable se emplea generalmente para la investigación en regulación genética a largo plazo. Aquí describimos un protocolo simple para generar una línea celular estable overexpressing muerte etiquetado receptor 3 (DR3) para explorar la función DR3. Seleccionamos clones solo después de una infección retroviral para mantener la homogeneidad y la pureza de las líneas celulares estables. Las líneas celulares estables generadas mediante este protocolo representan células HT29 DR3-deficiente sensibles a drogas antimitótica, reconstituyendo así la respuesta apoptótica en células HT29. Además, la etiqueta de la bandera en DR3 compensa la falta de buena anticuerpo DR3 y facilita el estudio bioquímico del mecanismo molecular por el cual agentes antimitótica inducen apoptosis.

Una caracterización de las células HT29 estable expresaban DR3 se muestra en la figura 1. Los clones expresan diferentes niveles de DR3, mientras que las células de tipo salvaje, que sirven como un control negativo, no muestran expresión de genes exógenos. Aquí sólo mostramos cinco clones, entre los que la copia 1 y 5 expresa el máximo nivel de DR3. Elegimos clon 1 y 5 para los siguientes experimentos.
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Estableciendo una línea estable de células overexpressing un gen de interés para el estudio de funciones de los genes puede hacerse estables recogida de transfección clones solo después de la transferencia de ellos a través de la infección retroviral. Aquí mostramos que las líneas de celulares HT29-DR3 generadas de esta manera dilucidar los mecanismos por el cual la muerte receptor 3 (DR3) contribuye a la apoptosis inducida por antimitotics.

Establecimiento de líneas de células Overexpressing DR3 para evaluar la respuesta apoptótica a la terapéutica anti-mitotic

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

La sobreexpresación de genes en las células es una forma importante de estudiar la función génica. La transfección estable con el retrovirus permite que los genes endógenos se integren en el genoma del huésped y se expresen continuamente. Recogimos colonias individuales de la infección retroviral y generamos líneas celulares estables sobreexpresando LA DR3 con flagrante.Las líneas celulares compensaron la indisponibilidad de un buen anticuerpo DR3 y proporcionaron excelentes herramientas para el estudio de la función DR3 post in vitro e in vivo. Generamos las líneas celulares de sobreexpresión de DR3 recogiendo una sola colonia de la infección retroviral. Las líneas celulares de una sola colonia podrían mantener la homogeneidad y pureza.Además, el protocolo es fácil y fácil de manejar. Para comenzar este procedimiento, haga crecer las células plat-A durante la noche en platos de 60 milímetros con cuatro mililitros de DMEM. Cuando las células alcanzan el 80 al 90%confluencia, utilice el reactivo de transfección para transfeczarlas con dos microgramos del plásmido construido como se describe en el manual del fabricante.Después de 72 horas, recoge el sobrenadante. Usando un filtro estéril de 0,45 micrómetros, filtre el medio y mantenga la suspensión viral en la oscuridad a cuatro grados centígrados. A continuación, cultivar células HT29 durante la noche en un plato de 60 milímetros con DMEM, incubando las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Cuando las células alcanzan entre el 30 y el 50% de confluencia, infectarlas con dos mililitros de suspensión viral en presencia de ocho microgramos de polibreno por mililitro de suspensión viral. Incubar las células infectadas a 37 grados centígrados durante cuatro a seis horas. Luego, aspira la suspensión viral.Agregue cuatro mililitros de DMEM fresco y devuelva el plato a la incubadora. A las 24 horas después de la infección, retire los medios de comunicación de los platos y lave cuidadosamente las células con dos mililitros de PBS precalentó. Añadir un mililitro de trippsina EDTA, e incubar las células a 37 grados Celsius durante tres minutos.Usando un microscopio a 10 veces el aumento, observe las células para asegurarse de que la mayoría de ellas se han desprendido. Después de esto, agregue dos mililitros de DMEM que contengan 10%FBS para detener la tripsinanización, y recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y retire el sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet celular en 10 mililitros de DMEM y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, diluya las células por factores de 30, 100 y 300. Las semillas son platos de 150 milímetros que contienen cada uno de 20 mililitros de DMEM que contiene blasticidina a una concentración de un microgramo por mililitro.Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente una o dos semanas. Durante este período, utilice un microscopio invertido a 10 veces el aumento para observar las colonias cada día. Marque las colonias bien aisladas en la parte inferior del plato cuando el diámetro de las colonias sea de aproximadamente uno a dos milímetros.Una vez finalizado el período de incubación, aspirar el medio y lavar las células con tres mililitros de PBS precalentó. Agregue dos mililitros de tripps EDTA en un plato de 60 milímetros. Utilice fórceps estériles para recoger cilindros de clonación estériles autoclavados y colóquelos en el plato.A continuación, recoger los cilindros que ahora contendrán aproximadamente 30 microlitros de trippsina EDTA, y colocarlos suavemente sobre las colonias marcadas. Devuelva el plato a la incubadora durante tres minutos. Después de esto, revise las células bajo un microscopio para asegurarse de que se han desprendido.Cuando las células se han levantado, a 70 microlitros de cultivo medio a cada cilindro para inactivar la tripina. Utilice una pipeta de 200 microlitrotro para mezclar suavemente la suspensión celular, asegurándose de no mover el cilindro mientras se mezcla. Colocar dos placas de 24 pozos, y etiquetarlas la placa A y la placa B.Añadir un mililitro de DMEM a cada pozo.Añadir 30 microlitros de suspensión celular a cada pozo de la placa A, y añadir 70 microlitros a los pozos correspondientes de la placa B.Coloque las placas de nuevo en la incubadora. Cuando las células de la placa B estén al 90% de confluencia, retire los medios y lave cuidadosamente las células con un mililitro de PBS. Se eliminó el PBS completamente, y agregue 50 microlitros de 1X SDS-PAGE buffer de carga paralyse las celdas.Después de cinco minutos, transfiera el lysate de la célula de la placa de 24 pozos a tubos centrífugos de 1,5 mililitros. Hierva las muestras a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Ejecute las muestras en gel 10%SDS a una tensión constante de 80 voltios durante 15 minutos y luego a 120 voltios durante una hora.A continuación, transfiera la proteína a una membrana de fluoruro de polivinilideno mediante transferencia húmeda a una corriente constante de 400 miliamperios durante dos horas. Diluir el anticuerpo primario por un factor de 5.000 en 5% de leche sin grasa que se disuelve en TBST. Añadir el anticuerpo FLAG a la membrana, e incubar a cuatro grados Celsius durante la noche.Con una coctelera decolorante ajustada a 200 RPM, lave la membrana con TBST durante 15 minutos, refrescando el TBST cada cinco minutos. Luego, diluir un anticuerpo secundario antiratón por un factor de 10.000 en 5% de leche sin grasa. Incubar la membrana con anticuerpo secundario diluido a cuatro grados centígrados durante cinco a seis horas.Lave la membrana en la coctelera decolorante de nuevo como se describió anteriormente. Después de esto, utilice la quimiuminescencia mejorada occidental y un sistema de documentación de gel para tomar imágenes de la membrana y detectar la expresión FLAG. En primer lugar, recoja las células HT29 y HT29-DR3 por la tripsinsticación y utilice un contador de celdas automático para medir la densidad de la celda.Siembra las células en los pozos de placas de 12 pozos con DMEM a una densidad de 30.000 células por pozo, e incuba durante la noche a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue 10 nanomolares de diazonamida a cada pozo que contenga células usando 1%DMSO como control negativo, y transfiera las placas a una incubadora a 37 grados Celsius con 5%dióxido de carbono. Después de 48 horas de tratamiento, imagine las células bajo un microscopio a 10 veces el aumento.A continuación, sembrar células HT29 y HT29-DR3 en los pozos de placa de 96 pocillos con DMEM a una densidad de 3.000 células por pozo, y permitirles crecer a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue las concentraciones de diazonamida que aumentan la dosis como se describe en el protocolo de texto. Después de 48 horas de tratamiento, utilice un kit de ensayo de viabilidad celular basado en luminiscencia para medir la viabilidad celular.Retire la placa de 96 pozos de la incubadora y déjela reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Luego, agregue 50 microlitros de reactivos de ensayo a cada pozo, y agite la placa durante dos minutos a temperatura ambiente para anlicenciar las células. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, y luego utilizar un lector de microplacas para determinar la luminiscencia de cada pozo.La caracterización de las células HT29 que expresan de forma estable la DR3 revela que los clones expresan diferentes niveles de DR3, mientras que las células de tipo salvaje no muestran expresión génica exógena. Los genes uno y cinco se ven para expresar los niveles más altos de DR3, por lo que se eligen para otros experimentos. La morfología de las células HT29 y HT29-DR3 se observa después de ser tratada durante 48 horas con diazonamida.Las células HT29-DR3 muestran apoptosis obvia con una membrana celular rota y desechos celulares. Sin embargo, las células HT29 solo muestran un arresto mitótico con células intactas que exhiben una forma de célula redondear hacia arriba. La viabilidad celular de estos tipos celulares se determina después de ser tratada durante 48 horas con tres nanomolares de diazonamida.Se observa que las células HT29-DR3 tienen una muerte celular de más del 80%, mientras que las células HT29 parentales demuestran sólo una ligera respuesta en forma de detención mitótica. Esto indica que la sobreexpresión de DR3 reconstituyó la vía apoptótica inducida por diazonamida en estas células. Las diluciones seriales adecuadas son importantes para obtener una densidad óptima de clones individuales.También es importante asegurarse de que cada cilindro clon solo contenga una colonia y evitar contaminar las colonias cercanas. Las líneas celulares sobreexpresantes de DR3 facilitaron el estudio bioquímico de los mecanismos moleculares in vitro. Generamos xenoinjertos HT29-DR3 a través de la inyección subcutánea de células HT29-DR3, y ayudó a elaborar los mecanismos de apoptosis in vivo inducida por agentes antimitóticos inglés.Este protocolo se puede utilizar para estudiar genes de interés en otras líneas celulares. Además, el nocaut genético es otra forma de estudio funcional, y nuestro protocolo se puede adaptar a los sistemas de derribo genético. Por lo tanto, es generalmente aplicable a las funciones genéticas de aclarado.Recuerde dejar el relé del virus en la basura a contenedores específicos para su eliminación de seguridad.

establishing-cell-lines-overexpressing-dr3-to-assess-apoptotic

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se describe cómo realizar las infecciones por retrovirus o lentivirus de la sobreexpresión o siRNA que contienen las construcciones en la línea de Ramos humanos de células B y la forma de medir la hipermutación somática en estas células.

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

Contribución del factor de remodelación de la cromatina ACF a la muerte celular inducida por E4orf4 se midió. El protocolo incluye la selección de clones de células en las que el tratamiento con doxiciclina induce desmontables condicional de la ACF subunidades Acf1 y SNF2h, y el uso del ensayo de DAPI para medir E4orf4 inducida por la muerte celular en las líneas celulares inducibles.

Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

La actividad citotóxica de la fenantridina PJ-34 en células de cáncer sometidos a la mitosis se documentó en tiempo real por imagen confocal en vivo. 34 PJ-erradicar el cáncer de mama humano MDA-MB-231 células que albergan actividades extra-centrosomas en la mitosis. A diferencia de la mitosis bi-focal normal, las actividades extra-centrosomas no se agruparon en los dos polos del huso en la presencia de PJ-34.

La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de eventos de señalización intracelular inducidos en células viables por interacción física con células muertas o moribundas adyacentes. El protocolo se centra en los eventos de señalización inducidos por el reconocimiento de las células muertas mediado por receptores, en contraposición a su captación fagocítica o liberación de mediadores solubles.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Este papel utiliza un ensayo basado en la citometría de flujo para las bibliotecas de la pantalla de inhibidores químicos para la identificación de los inhibidores y los objetivos que influyen en la del receptor de células T de señalización. Los métodos descritos aquí pueden ampliarse también para proyecciones de alto rendimiento.

Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

El protocolo detalla un modelo de carcinoma murino in vitro de alargamiento de transcripción defectuosa no genética. Aquí, la inhibición crónica de CDK9 se utiliza para reprimir el alargamiento productivo del ARN Pol II a lo largo de genes de respuesta proinflamatoria para imitar y estudiar el fenómeno te definitivamente clínicamente sobrecumplido, presente enaproximadamente el 20% de todos los tipos de cáncer.

Un modelo basado en la línea celular murina de la inhibición crónica de CDK9 para estudiar defectos de alargamiento transcripcional no genéticos generalizados (TEdefinitivamente)en cánceres

Aquí se presenta un protocolo para generar controles de pellets celulares fijados en formalina e incrustados en parafina para inmunohistoquímica.

Procesamiento estandarizado para controles inmunohistoquímicos de pellets de células fijadas en formalina e incrustadas en parafina

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aprende a establecer líneas celulares HT29 con sobreexpresión estable de DR3 mediante transfección retroviral para estudiar la apoptosis inducida por agentes antimitóticos y evaluar respuestas terapéuticas.

Establecimiento de líneas de células Overexpressing DR3 para evaluar la respuesta apoptótica a la terapéutica anti-mitotic

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