Name: Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende a obtener firmas proteómicas de macrófagos humanos bajo hipoxia mediante cuantificación libre de etiquetas. Este protocolo permite caracterizar estados de activación celular a nivel proteico para estudios inmunológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AM es financiado por el programa de líder del grupo de jóvenes (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), de la Ligue Nationale contre le cáncer y la Fundación arco pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo de la espectrometría de masas para plataforma de Biología (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, París). Agradecemos a Lauren Anderson por su lectura del manuscrito.

Se obtuvieron muestras de sangre humana (LRSC) de donantes sanos, anónima de EFS (servicio nacional de sangre francesa) como parte de un protocolo autorizado (CODECOH CC-2018-3114). Los donantes dieron consentimiento firmado para el uso de sangre.
1. los medios y preparación del tampón
<ol><li>Preparar el medio de macrófagos [RPMI glutamax + 10 mM HEPES 1 x aminoácidos no esenciales (AANE)] y caliente a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar el medio de macrófagos + 10% de suero humano de plasma AB (SAB), filtrarla (0.22 μm filtro), y luego calentarlo a 37 ° C (conocido como macrófago mediana + 10% SAB en adelante).</li>
	<li>Preparar el búfer de clasificación [1 x de tampón fosfato salino (PBS) + 0,5% albúmina de suero bovino (BSA) + ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA)], filtrarla (0.22 μm filtro) y mantener a 4 ° C.</li>
</ol>2. aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de la cámara de sistema Leukoreduction (LRSC)
<ol><li>Colocar 15 mL de solución de la separación de densidad gradiente de la célula (véase Tabla de materiales) en 50 mL tubo de centrifugación por lo que puede calentar a la temperatura ambiente (RT) antes de recibir la LRSC. Nota: La densidad depende de la temperatura. Como este producto se almacena a 4 ° C, este paso debe hacerse por adelantado por lo que puede equilibrar a RT.</li>
	<li>Vacíe la LRSC en un tubo de centrifugación de 50 mL, añadir hasta 50 mL de PBS 1 x y mezclar. Muy lentamente, añadir 25 mL de la mezcla preparada en el paso 2.2 sobre 15 mL de solución de densidad gradiente calentado durante el paso 2.1. Nota: Tenga cuidado de no mezclar las fases durante este paso. La sangre debe agregarse a la solución del gradiente de densidad sin cualquier perturbación de esta fase.</li>
	<li>Centrifugar los tubos de centrifugación durante 25 minutos a 700 g de x sin pausas. Nota: Al final de la centrifugación del gradiente de densidad, las capas de abajo a arriba son: los eritrocitos y los granulocitos formando los pellets, fase de solución gradiente de densidad, capa de PBMCs y plasma.</li>
	<li>Con una pipeta, pasar por la fase de plasma sin lo aspiración y recoger la capa PBMC en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mL. Añadir a 50 mL de 1 x PBS a las PBMCs como un paso de lavado y centrifugar durante 10 min a 300 x g.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 mL de medio de macrófagos.</li>
</ol>3. etiquetado magnético y aislamiento de CD14 (monocitos) de las células+
<ol><li>Cuenta las PBMCs en una cámara Malassez. Retirar la cantidad de PBMCs necesarios para llevar a cabo el experimento (típicamente 100 a 300 x 106 células), colóquelos en un tubo de centrifugación y centrifugar durante 10 min a 300 x g.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 80 μl de la solución de clasificación preparada en el paso 1.3 por 107 PBMCs. agregar 20 μl de microesferas de CD14 por 107 PBMCs. Mix bien e incubar por 15 min a 4 ° C en agitación constante.</li>
	<li>Añadir 1 mL de buffer por 107 PBMCs que clasifica como un paso de lavado y centrifugar 10 min a 300 x g. aspiración el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de buffer por 108 PBMCs de clasificación.</li>
	<li>Colocar una columna en el campo magnético del separador. Preparar la columna de lavado con 3 mL de buffer de ordenación.</li>
	<li>Aplicar la suspensión de células en la columna. La columna depende del número de células para ser aislados (aquí, se utilizan columnas de LS de PBMCs de9 hasta 10). Recoger a través de flujo que contiene células sin etiqueta. Nota: A partir de este paso, todos los tubos (selecciones negativas y positivas) se mantienen para posterior comprobación de los diferentes pasos por citometría de flujo.</li>
	<li>Lavar la columna con 3 x 3 mL de buffer de ordenación. Recoger las células pasando a través del mismo tubo de paso 3.12. Realizar pasos de lavado agregando buffer clasificación, tenga cuidado de no secar la columna. Colocar un tubo de colección en la columna y retire del separador.</li>
	<li>Pipetear 5 mL de buffer de clasificación en la columna. Limpie inmediatamente las células magnéticamente etiquetado empujar firmemente el émbolo en la columna. Para aumentar la pureza de la CD14+ las células, la fracción eluída se ha enriquecido en una segunda columna.</li>
	<li>Repita los pasos 3.4 a 3.7 con una nueva columna.</li>
</ol>4. galjanoplastia de monocitos
<ol><li>Contar los monocitos en una cámara Malassez. Compruebe la pureza de la CD14+ de las células mediante citometría de flujo. Retirar la cantidad de monocitos es necesarios para el experimento y colocar en un tubo de centrifugación.</li>
	<li>Centrifugar 10 min a 300 x g. aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de monocitos en medio de los macrófagos. Las células de la placa y dejarlas asentarse por 50 min a 1 h. Aspire el medio y sustituirlo con medio macrófagos + 10% SAB + 25 ng/mL macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) para inducir la diferenciación.</li>
</ol>5. polarización de los macrófagos en el día 6
<ol><li>Aspire el medio. Sustituirla por medio de macrófagos + 10% SAB con varios estímulos. Por ejemplo, agregar 10 ng/mL interferón gamma (INFγ) + 1 lipopolysaccharide ng/mL (LPS) para obtener polarización M1, o 20 ng/mL interleukin 4 (IL4) + 20 ng/mL interleucina 13 (IL13) polarización M2. Nota: La estimulación se puede realizar entre 24 y 48 h antes de proceder a otras pruebas.</li>
	<li>Cosecha de células con una solución de desprendimiento o un raspador celular.</li>
</ol>6. célula cultura en condiciones de poco oxígeno
<ol><li>A partir de paso 4, mantener los monocitos y macrófagos en un entorno controlado de oxígeno para realizar el análisis de la condición hipóxica. Utilizar una estación de trabajo de hipoxia para mantener las células debajo de la presión parcial de oxígeno deseada durante el experimento. Nota: Cuando se trabaja bajo la presión de oxígeno baja, es importante preparar todos los medios y tampones de lavado bajo la estación y esperar lo suficiente para obtener la correcta presión parcial en el líquido. Por ejemplo, 10 mL de PBS en una caja Petri de 60 mm requiere aproximadamente 2 horas para llegar a 25 mmHg para la presión de O2 parciales a partir de la presión atmosférica (como hemos medido con un sensor de oxígeno óptico de fibra). En muchas estaciones hipóxicas o incubadoras, la presión del oxígeno se establece como un porcentaje de la presión atmosférica. Si las medidas exactas son necesarias, es mejor utilizar una estación que autoriza establecer directamente la presión de oxígeno en mmHg.</li>
</ol>7. lisis y digestión en Gel (protocolo 1)
Nota: En esta y las siguientes secciones, se describen dos protocolos utilizados para obtener péptidos y realizar el análisis por LC-MS/MS. Protocolo 1 describe lisis celular y fraccionamiento en gel y digestión, y en el protocolo 2 describe lisis celular en solución seguido por digestión en solución y fraccionamiento utilizando un método de enfoque isoeléctrico.
<ol><li>Realizar la lisis celular en Tampón Laemmli [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7,5% SDS, 37% de glicerol, 33.3% (v/v) β-mercaptoetanol, azul de bromofenol 0,2% p/v]. El equivalente de proteína de 300.000 células para cada muestra en geles de acrilamida bis-Tris 4-12% de la carga.</li>
	<li>Controlar la duración de la migración electroforética a cada muestra de proteínas se divida en gel 6 bandas como se ejemplifica en la figura 3.</li>
	<li>Fije el gel con una solución fijadora (30% de etanol + ácido acético al 7.5% por 20 min), luego la solución de tinción (R-250 Coomassie blue por 45 min). La solución de extracción (etanol 30% + 7,5% acético hasta que aparecen bandas) antes de suprimir las bandas de proteínas con un bisturí limpio.</li>
	<li>Trocear cada banda suprimida antes de la introducción de 500 tubos μl. Una superficie de vidrio limpio es garantía para evitar la contaminación con las queratinas (solución de SDS 5% en agua desionizada se puede utilizar para limpiar las superficies).</li>
	<li>Lavar las rodajas de gel 3 veces en 200 μL de 25 mM de bicarbonato de amonio por 20 min a 37 ° C, seguido de un lavado en 25 mM bicarbonato de amonio y acetonitrilo (50% v/v). Deshidratar los pedazos de gel con 200 μL de acetonitrilo 100% durante 10 minutos.</li>
	<li>Incubar cada pieza de gel con 10 mM DTT (Ditiotreitol) de bicarbonato de amonio 25 mM por 45 min a 56 ° C (200 μL), seguida de Yodoacetamida 55 mM en 25 mM bicarbonato de amonio (200 μL) durante 35 min en la oscuridad a TA.</li>
	<li>Dejar de alquilación, incubar cada pieza de gel con 200 μL de 10 mM TDT de bicarbonato de amonio 25 mM durante 10 minutos a RT. Wash las piezas gel en 200 μL de 25 mM de bicarbonato de amonio, luego deshidratar con 200 μL de acetonitrilo 100% durante 10 minutos.</li>
	<li>Digerir las proteínas durante la noche a 37 ° C con mezcla de tripsina/Lys-C según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Extracto de los péptidos resultantes de pedazos de gel mediante la adición de 50 μL de 50% acetonitrilo para 15 minutos, luego 50 μL de ácido fórmico al 5% durante 15 min y finalmente, 50 μL del 100% de acetonitrilo para piscina a 15 minutos y secar cada fracción en tubos de baja absorción para limitar la absorción de péptidos y pérdida de muestra. Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su análisis posterior.</li>
</ol>8. proteína extracción y digestión en solución (protocolo 2)
<ol><li>Con 150 μL del tampón de lisis siguiente de realizar la lisis celular (2 x 106 células):<ol>
<li>Urea de 7 M, tiourea de 2 M, 40 mM Tris y grietas del 4%, suplidas con los inhibidores de proteasa (mini completa, libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneizar las soluciones por 30 min a temperatura ambiente con un termoagitador. Centrifugue a 13.800 x g por 20 min RT y conservar el sobrenadante.</li>
	<li>Eliminar contaminantes con un kit de limpieza 2D:<ol>
<li>El kit contiene solución precipitante, solución precipitado Co, tampón de lavado y lavado aditivo.</li>
		<li>Añadir 300 μL de solución precipitante y mezclar bien. Incubar en hielo por 15 minutos añadir 300 μL de solución de co precipitado. Centrifugar los tubos (al menos) a 12.000 x g durante 5 minutos. Una pequeña pelotilla debe ser visible. Proceder rápidamente al siguiente paso para evitar resuspensión o dispersión de la pelotilla. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet.</li>
		<li>Centrifugar los tubos otra vez con la bisagra de la tapa y pellets hacia fuera para traer el líquido sobrante en la parte inferior del tubo. Un pulso breve es suficiente. No debería haber queda líquido visible en los tubos.</li>
		<li>Sin perturbar el pellet, agregar 40 μl de solución de co precipitado. Dejar que el tubo se sientan en hielo por 5 min, centrifugar durante 5 minutos, luego retire y deseche el lavado. Añada 25 μl de agua desionizada. Vortex cada tubo para s 5-10. El diábolo debe dispersar pero se disuelve en el agua.</li>
		<li>Añadir 1 mL de tampón de lavado (previamente enfriado durante al menos 1 h a-20 ° C) y 5 μl de aditivo de lavado. Vortex hasta que el pellet se dispersa completamente. Incubar los tubos a-20 ° C durante al menos 30 min vórtex por 20-30 s cada 10 minutos Nota: Los tubos pueden almacenarse a-20 ° C hasta 1 semana con degradación proteica mínima o modificación.</li>
		<li>Centrifugar los tubos (al menos) en 12.000 × g por 5 min con cuidado retire y descarte el sobrenadante. Una pelotilla blanca debe ser visible. Permiten la pelotilla a seca al aire durante no más de 5 minutos (si es demasiado seco, va a ser difícil que vuelva a suspender los pellets).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspender el precipitado de proteína en 300 μL 8 M urea y 0.1 M de bicarbonato de amonio. Vortex fuertemente durante 1 minuto determinar la concentración de proteína usando un análisis colorimétrico.</li>
</ol>9. en la solución digestión (protocolo 2)
<ol><li>Reducir los puentes disulfuro añadiendo 5.1 μl de una solución acuosa de 700 mM TDT (concentración final 12.5 mM) a las proteínas resuspendidas de paso 8.4 e incubar a 37 ° C por 30 min con un termoagitador. Alquilato residuos de cisteína mediante la adición de 20,3 μl de una solución acuosa de 700 mM Yodoacetamida (concentración final 40 mM) y se incuba a 25° C por 30 min en la oscuridad con un termoagitador.</li>
	<li>Añadir 990 μl de bicarbonato de amonio de 0.1 M a la muestra. Añadir un volumen correspondiente de tripsina/Lys-C mix (enzima: sustrato proporción 1: 100 w/w). Incubar a 37° C durante la noche con un termoagitador.</li>
</ol>10. limpiar el cartucho (protocolo 2)
<ol><li>Moje un cartucho con 1 columna-volumen (1 mL) de metanol. Limpie el cartucho con 1 columna-volumen (1 mL) de agua al 80% acetonitrilo HPLC-grado y descartar el flujo a través. Equilibre el cartucho con 4 columnas-volúmenes (4 mL) de agua de 0,1% ácido fórmico/HPLC-grado y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Acidificar las muestras con 90 μl de ácido fórmico al 10% o agua a pH 2-3 (Compruebe el pH con un indicador de pH). Cargar las muestras acidificadas y recoger el flujo a través. Vuelva a cargar el paso (contiene los péptidos no conservado). Lavar el cartucho con columna-volumen 6 (6 mL) de agua de 0,1% ácido fórmico/HPLC-grado.</li>
	<li>Eluir péptidos del cartucho con volúmenes de columna 1 (1 mL) de agua de acetonitrilo HPLC-grado de acid/50% fórmico 0,1%. Transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Concentrar la muestra utilizando un concentrador de vacío (150 x g, vacío a 160 mBar).</li>
</ol>11. fraccionamiento de la concentración isoeléctrica (protocolo 2)
Nota: Los péptidos son separados según sus puntos isoeléctricos usando un fraccionador de gel en una tira de 13 cm cubriendo un rango de pH de 3 a 10. Se utilizó el siguiente protocolo suministrado por el proveedor (resumido a continuación):
<ol><li>Preparar las siguientes soluciones: solución (600 μl de solución de glicerol, 60 μL de tampón de OFFGEL, 4,34 mL de agua ultrapura) y B (1,776 mL de solución) y 444 μl de agua ultrapura.</li>
	<li>Armar las tiras IPG, marcos y electrodos según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Resuspender la muestra con 1,8 mL de solución B. agregar 40 μl de la solución B a cada pocillo. Carga 150 μL de muestra a cada pocillo.</li>
	<li>Seleccionar el método por defecto para péptidos: OG12PE00 (método OFFGEL predeterminado para péptidos para uso con 3100 OFFGEL baja Res Kit marcos de pH 3-10, 12-bien. Espere a que este método ha sido completado (20 h). Recoger las fracciones en tubos debidamente etiquetados.</li>
</ol>12. limpiar Harvard aparato columna C18 reversa Post-IEF (protocolo 2)
<ol><li>Añadir progresivamente unos μL en un tiempo de 1% TFA en agua desionizada a cada fracción para acidificar la muestra. Verifique con papel pH el pH es de 3 o menos.</li>
	<li>Preparar las siguientes soluciones: solución 1 (5 mL de acetonitrilo, 10 μl de ácido fórmico, 4,99 mL de agua ultrapura) y 2 (0, 5 mL de acetonitrilo, 10 μl de ácido fórmico, 9,49 mL de agua ultrapura).</li>
	<li>Humedezca previamente la columna spin con 150 μL de solución 1. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través. Lavar la columna de vuelta con 150 μL de solución 2. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Pasar la fracción a través de la columna. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través. Lavar con 150 μL de solución 2. Centrífuga para 90 s en 750 g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Eluir la fracción con 50 μL de solución 1. Centrífuga de 90 s a 750 x g. Repita estos pasos una vez más.</li>
	<li>Seco-fracción utilizando un concentrador de vacío (150 g de x, vacío 160 mBar) y almacenar a-80 ° C</li>
</ol>13. Análisis de datos de proteómica y bioinformática18
<ol><li>Analizar los datos obtenidos por un nano-LC MS/MS masa espectrómetro usando software de cuantificación como MaxQuant (versión 1.5.2.8) y el motor de búsqueda de Andrómeda.</li>
	<li>Establece tarifa falsa del descubrimiento (FDR) al 1% para proteínas y péptidos y un largo mínimo de 7 aminoácidos. Establecer la especificidad de la enzima como C-terminal Arg y Lys. Permite 2 divisiones perdidas en bonos de prolina. Seleccione carbamidomethylation de la cisteína como modificación fija y oxidación de la acetilación y la metionina de la proteína N-terminal como modificaciones variables.</li>
	<li>Analizar los datos con el software de análisis estadístico. Realizar un análisis de enriquecimiento funcional usando el software FunRich (www.funrich.org/). Realizar un análisis de enriquecimiento ontología génica utilizando el software de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).</li>
</ol>

<ol><li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biology+perspective+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders%3A+functions+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li>
<li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+morphological%2C+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li>
<li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li>
<li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926(2013).</li>
<li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li>
<li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
<li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

Porque la proteómica es una poderosa herramienta para estudiar la expresión de diferentes proteínas de una célula entera o compartimentos subcelulares, optimización del Protocolo de lisis celular y la digestión de las proteínas ha sido abordados por diversos estudios. Hay tres clases principales de métodos, que son en gel de la digestión (digestión de proteínas en geles de poliacrilamida matriz)17, digestión en solución18 y asistido por el filtro muestra preparación<sup cla...

Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido, incluyendo la remoción de células apoptóticas y la remodelación de la matriz extracelular1. Estas células se caracterizan por una fuerte plasticidad fenotípica2 que se traduce en unas muchos Estados posible activación, que también se llaman polarizaciones. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología de macrófagos3. Se ha propuesto clasificar estas polarizaciones utilizando la llamada dicotomía M1/M2, M1 representa pro-inflamatoria y M2 representa macrófagos antiinflamatorios. Este modelo se ajusta bien en diferentes situaciones patológicas como infecciones agudas, alergias y obesidad4. Sin embargo, en los tejidos crónicamente inflamados y cáncer, se ha demostrado que esta clasificación es incapaz de captar el amplio repertorio fenotípico que los macrófagos presentan en determinados ambientes celulares5,6, 7. el consenso actual es que polarización macrófago se describe mejor usando un modelo multidimensional para integrar señales microambiental específicas8. Esta conclusión ha sido confirmada mediante análisis transcriptómico de macrófagos humanos que muestra que el modelo M1/M2 es ineficiente en la descripción de las polarizaciones obtuvo9.
El estudio presentado tiene como objetivo ofrecer un protocolo para obtener firmas de Proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Describimos cómo diferenciar los macrófagos humanos en entornos de varios niveles de oxígeno y obtener péptidos de proteoma todo macrófagos para llevar a cabo una cuantificación de etiqueta-libre. Esta cuantificación permite la comparación de los niveles de expresión de diversas proteínas. Como investigación en células madre ha puesto de manifiesto la importancia del oxígeno como un parámetro clave ambiental10, buscamos entender cómo este parámetro de tejido puede influir polarización de macrófagos en los seres humanos. La presión parcial de oxígeno se ha encontrado al rango de 3 a 20% (de la presión atmosférica total) en el cuerpo humano, donde el 20% corresponde aproximadamente a lo que comúnmente se utiliza en una incubadora de cultivo celular (el valor exacto es alrededor 18.6% mientras que la presencia de agua en cuenta).
Trabajo previo ha demostrado que difieren alveolar de macrófagos intersticiales de funcional y morfológico punto de vista11 y estas diferencias son probablemente parcialmente debido a los niveles de oxígeno diferentes a los que están expuestos12. Además, macrófagos derivados de médula ósea muestran una mayor capacidad que fagocitan bacterias cuando están expuestos a un bajo nivel de oxígeno medio ambiente12. El efecto contrario se ha encontrado para macrófagos humanos THP1 distinguido13, pero estos resultados apoyan la idea de que el oxígeno es un regulador de la biología del macrófago y que es necesario aclarar esta función a nivel molecular en macrófagos humanos. En un estudio anterior, hemos aplicado un enfoque de la proteómica para tratar estos temas. Al medir los niveles de expresión de miles de proteínas al mismo tiempo, destacó el impacto del oxigeno sobre polarización y proporciona una lista de nuevos marcadores moleculares. También fuimos capaces de relacionar estos resultados para algunas funciones de los macrófagos. En particular, encontramos que la tasa de fagocitosis de células apoptóticas se incrementó en macrófagos IL4/IL13-polarizado, que estuvo vinculado a la regulación al alza de ALOX15 según lo revelado por el análisis proteómico del14. En el presente estudio, describimos cómo realizar tal análisis.

<table><tbody><tr><td>Estación de trabajo de hipoxia</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Citómetro de flujo</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico (FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie blue</td><td>Biorad</td><td>1.610.436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido, E.Coli (LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>kit de limpieza 2D</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio, suplemento glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (NEAA) 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Columna de aparatos Reverse C18 micro columna de centrifugado</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 CAJA</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microperlas humanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS columna de separación LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>Interferón gamma (INF&gamma;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (clon T&Uuml; K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Rotador de tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de tripsina/Lys-C</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasa mini sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>solución de gradiente de densidad ( Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero humano de plasma AB masculino humano (SAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td>solución de</tr><tr><td>albúmina sérica bovina (BSA) 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) 20%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de ensayo</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL pipeta de plástico estéril</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 cartuchos de fase inversa, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Los macrófagos son las células inmunes innatas involucrados en una serie de funciones fisiológicas que van desde las respuestas a patógenos infecciosos a la homeostasis del tejido. Las diferentes funciones de estas células están relacionadas con sus Estados de activación, que también se llama polarización. La descripción molecular precisa de estas polarizaciones diferentes es una prioridad en el campo de la biología del macrófago. Actualmente se reconoce que un enfoque multidimensional es necesario describir cómo la polarización es controlada por señales ambientales. En este informe, describimos un protocolo diseñado para obtener la firma proteómica de diferentes polarizaciones en macrófagos humanos. Este protocolo se basa en una cuantificación de etiqueta-libre de expresión de la proteína del macrófago obtenida de in-gel fraccionado y Lys C/tripsina-digerido contenido de lisis celular. También proporcionamos un protocolo basado en la solución en digestión y fraccionamiento para usar como una alternativa de enfoque isoeléctrico. Debido a la concentración de oxígeno es un parámetro ambiental relevante en los tejidos, utilizamos este protocolo para explorar la composición de la atmósfera o un ambiente de poco oxígeno afecta a la clasificación de la polarización del macrófago.

A partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas por centrifugación diferencial, el protocolo permite la obtención de una población de CD14+ monocitos con una pureza cuota de más del 98% mediante citometría de flujo (figura 1). Estos monocitos se diferencian secundariamente hacia polarizaciones diferentes (figura 2). Cuando se elige un fraccionamiento en gel, la migración en geles de SDS-page se...

Presentamos un protocolo para obtener firmas de Proteómica de macrófagos humanos y aplicar esto a la determinación del impacto de un ambiente de poco oxígeno en polarización de macrófagos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Por lo tanto, este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de macrófagos, como cómo caracterizar el estado de activación bajo diversos ambientes a nivel proteico. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece la oportunidad de obtener la diferencia de expresión de muchas proteínas en macrófagos humanos utilizando el método de cuantificación sin etiquetas. Demostrar el procedimiento serán Marie Malier y Magali Court de mi laboratorio.Para comenzar, añada 15 mililitros de solución de separación de células de gradiente de densidad en cada uno de dos tubos de centrifugación de 50 mililitros para que la solución pueda calentarse a temperatura ambiente antes de recibir el LRSC. Esto es esencial ya que la densidad depende de la temperatura. Vacíe el LRSC en un tubo de centrifugación de 50 mililitros.Añadir 1x PBS hasta 50 mililitros y mezclar. A continuación, muy lentamente, añadir 25 mililitros de la mezcla en la parte superior de 15 mililitros de solución de gradiente de densidad equilibrada. Tenga cuidado de no mezclar las fases durante este paso.Se debe añadir sangre en la solución de gradiente de densidad sin ninguna alteración de esta fase. Centrifugar ambos tubos de centrifugación durante 25 minutos a 700 G sin roturas. Al final de la centrifugación de gradiente de densidad, las capas de abajo a arriba son los eritrocitos y granulocitos, formando el pellet, la fase de solución de gradiente de densidad, una capa de PBMC y el plasma diluido.Con una pipeta, pasar a través de la fase de plasma sin aspirarlo. A continuación, recoja la capa PBMC en un nuevo tubo de centrifugación de 50 mililitros. Añadir hasta 50 mililitros de 1x PBS a los PBMC como una configuración de lavado y centrífuga durante 10 minutos a 300 G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 40 mililitros de medios de macrófagos.Después de hacer seda los PBMC en una cámara De Malassez, transfiera la cantidad de PBMC necesaria para llevar a cabo el experimento a un tubo de centrifugación. Centrifugar las células durante 10 minutos a 300 G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 80 microlitros del búfer de clasificación por cada 10 millones de PBMC. A continuación, agregue 20 microlitros de microperlas CD14 por cada 10 millones de PBMC.Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 grados centígrados bajo agitación constante. Después de la incubación, agregue un mililitro de tampón de clasificación por cada 10 millones de PBMC como paso de lavado, y centrifugar como antes. A continuación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de clasificación por cada 100 millones de PBMC.Ahora, coloque una columna en el campo magnético del separador. Prepare la columna enjuagando con tres mililitros de búfer de clasificación. Aplique la suspensión de celda en la columna.A continuación, recoja el flujo a través de las celdas sin etiquetar para su posterior tinción, si es necesario. Lave la columna tres veces con tres mililitros de búfer de clasificación. Tenga cuidado de no secar la columna.A continuación, coloque un tubo de recogida debajo de la columna y retírelo del separador. Después del lavado, pipetee cinco mililitros de tampón de clasificación en la columna. Enjuague inmediatamente las células etiquetadas magnéticamente empujando firmemente el émbolo hacia la columna.Por último, repita estos pasos con una nueva columna antes de encolar los monocitos y realizar la polarización de macrófagos como se describe en el protocolo de texto. Mantener los monocitos y los macrófagos en un ambiente controlado por oxígeno para realizar análisis de condición hipoxica. Utilice una estación de trabajo de hipoxia para mantener las células bajo la presión parcial de oxígeno deseada durante el experimento.Cuando se trabaja bajo baja presión de oxígeno, es importante preparar todos los medios y tampones de lavado debajo de la estación, y esperar lo suficiente para obtener la presión parcial correcta en el líquido. Realice la lysis celular en un búfer bajo una capucha adaptada. Cargue el equivalente proteico de 300.000 células por cada muestra en geles de acrilamida 4-12%bis-tris.Controlar la duración de la migración electroforética para permitir que cada muestra de proteína se divida en seis bandas de gel como se muestra aquí. Después de la fijación y tinción como se describe en el protocolo de texto, excúles las bandas de proteínas con un bisturí limpio. En dados cada banda extirpada antes de colocarlos en tubos de 500 microlitros.Ahora, lave las rodajas de gel tres veces en 200 microlitros de bicarbonato de amonio milimolar durante 20 minutos a 37 grados centígrados, descartando el bicarbonato de amonio entre cada paso. Siga esto con un lavado en bicarbonato de amonio de 25 milimolares y acetonitrilo. A continuación, deshidratar las piezas de gel con 200 microlitros de 100% acetonitrilo durante 10 minutos.Incubar cada pieza de gel con 10 TDT milimétrica y bicarbonato de amonio mili evolucionador durante 45 minutos a 56 grados centígrados. A continuación, deseche la TDT e incubar la pieza de gel con 55 yodoaceta milimétricas en bicarbonato de amonio de 25 milimolar durante 35 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Para detener la alquilación, deseche la solución usada e incubar cada pieza de gel con 200 microlitros de TDT de 10 mililitrolares en bicarbonato de amonio milimolar durante 10 minutos a temperatura ambiente.Lavar las piezas de gel en 200 microlitros de bicarbonato de amonio de 25 milimolares. A continuación, deshidratar con 200 microlitros de 100% acetonitrilo durante 10 minutos. Digerir las proteínas durante la noche a 37 grados Celsius con Trypsin/Lys-C Mix de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Extrae los péptidos resultantes de las piezas de gel añadiendo 50 microlitros de 50%acetonitrilo durante 15 minutos en tubos de baja absorción. Después de añadir 50 microlitros de 5% de ácido fórmico durante 15 minutos, añadir 50 microlitros de 100%acetonitrilo durante 15 minutos. Tire y seque cada fracción en tubos de baja absorción para limitar la absorción de péptidos y la pérdida de la muestra.Almacene las muestras a 80 grados centígrados hasta que se sigan analizando como se detalla en el protocolo de texto. Aquí se muestra la pureza representativa evaluada por la citometría de flujo después de la selección de cuentas magnéticas de monocitos positivos CD14. Las imágenes de contraste de fase de macrófagos humanos diferenciados muestran heterogeneidad de morfologías obtenidas para dos polarizaciones diferentes después de nueve días de cultivo.Se muestra un ejemplo de una digestión fuera de gel utilizando geles de página SDS manchados de plata. La evaluación de la proteína de la lelisis celular y después de la digestión en la solución muestra la ausencia de degradación durante la lelisis y la eficiencia de la digestión. Aquí se muestra un ejemplo de un espectro de disociación inducido por colisión de un péptido encontrado en la relación masa-carga de 597.29 en el espectro de la MS con una carga eléctrica de dos positivos.A partir de este espectro, se determinó la secuencia correspondiente. El resultado final después del análisis es un mapa de calor que representa la agrupación jerárquica de todos los estados de polarización utilizando proteínas expresadas diferencialmente. El análisis revela un grupo de proteínas sobre-expresadas en todas las polarizaciones en la condición de oxígeno del 3%.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que primero tienes que decidir qué tipo de fraccionamiento realizarás en nuevas muestras para adaptar tu protocolo en consecuencia. El enfoque proteómico que utiliza este trabajo es complementario a los enfoques genómicos que se han utilizado durante los últimos años en el campo de los estudios de polarización de la biología de macrófagos. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que el investigador en el campo de la inmunología explore los diversos estados de activación de las células inmunitarias en los seres humanos y también en otros mamíferos.No olvide que trabajar con TDT podría ser peligroso, por lo que necesita trabajar bajo una capucha adaptada para realizar este procedimiento.

proteomic-analysis-human-macrophage-polarization-under-low-oxygen

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Los macrófagos son las células clave implicadas en la patogenicidad del huésped. Los macrófagos muestran una diversidad fenotípica y funcional que puede ser analizada y detectada mediante análisis proteómico. Este artículo describe cómo realizar electroforesis 2D de cultivos primarios de macrófagos humanos diferenciados en fenotipo M1 o M2.

Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Este protocolo proporciona un método para estudiar la infección por Mycobacterium tuberculosis en macrófagos polarizados M1 o M2 humanos basados en la diferenciación de monocitos de sangre periférica a células similares al macrófago que están infectadas con la cepa virulenta H37Rv etiquetada por GFP, y analizada con citometría de flujo utilizando un panel de 10 colores que incluye la expresión de marcadores M1/M2 seleccionados.

Polarización de células y análisis de células y análisis derivados de monocitos humanos M1 y M2 con citometría de flujo sobre la infección por mycobacterium tuberculosis

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.

Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para evaluar el potencial inmunomodulador de las superficies de los implantes in vitro, con el objetivo de mejorar la fiabilidad y la reproducibilidad de los protocolos actuales y promover nuevas investigaciones. Los perfiles de citocinas secretoras, la expresión de ARNm y los marcadores de superficie celular se monitorizaron utilizando macrófagos derivados de monocitos sanguíneos para investigar la polarización de los macrófagos cultivados...

Polarización y caracterización de macrófagos derivados de monocitos humanos M1 y M2 en superficies de implantes 

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Aprende a obtener firmas proteómicas de macrófagos humanos bajo hipoxia mediante cuantificación libre de etiquetas. Este protocolo permite caracterizar estados de activación celular a nivel proteico para estudios inmunológicos.

Análisis proteómico de polarización macrófago humano bajo un ambiente de poco oxígeno

Explorar más videos