Name: Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Aprende a utilizar Ustilago maydis como caballo de Troya para la entrega in situ de proteínas en maíz. Este método permite estudiar la progresión de infección y la función de proteínas secretadas en tejidos específicos de la planta.

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Los autores desean agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella y Armin Hildebrand para proporcionar espacio y planta el material de laboratorio. La obra original en el método del caballo de Troya fue apoyada por una beca postdoctoral de Leopoldina y proyecto NSF IOS13 39229. El trabajo presentado en este artículo fue apoyado por SFB924 (proyectos A14 B14) del DFG.

1. construcción de un caballo de Troya de U. maydis
Nota: Vea la figura 1.
<ol><li>Amplificar un gen de interés a partir de maíz cDNA utilizando cartillas gene-específicas y una revisión ADN polimerasa. Clonar el producto primario de la polimerización en cadena y transforman la construcción de e. coli siguiendo las instrucciones del proveedor de plásmido. Verifique que el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación antes de los próximos pasos de la clonación. Nota: Especificaciones de PCR necesitan ser optimizado debido a la primer secuencia especificidades y condiciones de la reacción de polimerasa de la DNA óptimo.</li>
	<li>Diseño de cebadores para amplificar el gen maíz de interés sin la secuencia de codificación de un péptido de señal (SP).</li>
	<li>Extender el extremo 5´ del primer revés con el motivo RSIATA y un NcoI corte sitio (tabla 1).</li>
	<li>Amplificar el gen maíz de interés con una corrección ADN polimerasa mediante la construcción de la polimerización en cadena generada en 1.1 como la plantilla de la polimerización en cadena.</li>
	<li>Doble-digerir el producto PCR y el plásmido de transformación de U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2- ZmmCherry mac1-Ha15, con XbaI y Nco I. purificar el producto de PCR y el plásmido digerido.</li>
	<li>Ligar el producto PCR digerido en la p123-PUmpit2-SpUmpit2- ZmmCherry mac1-Ha plantilla con T4 ADN ligasa siguiendo las instrucciones de manufacturer´s. Transformar el producto de la ligadura en e. coli y verificar el gen correcto de la secuencia de interés por Sanger secuenciación.</li>
	<li>Alinear la p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgene de interés mCherry-Ha con la enzima de restricción SspI y transformación ADN en el solopathogenic U. maydis cepa SG20016. Aislar U. maydis transformantes selección carboxin y confirmar aislados transformantes por sur blot análisis16. Nota: Para cada proteína de interés, por lo menos tres independientes U. maydis transformantes deben ser aislados y analizados para estimar efectos de fenotipo de mutaciones al azar del fondo.</li>
</ol>2. medios de cultivo
<ol><li>Preparación de medio líquido de YEPSlight16: Extracto de levadura 1.0% (w/v), 0.4% (w/v) Bacto-peptona y 0.4% (p/v) de sacarosa. Disolver todos los componentes en ddH2O y autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.</li>
	<li>Preparar papa-dextrosa-agar (agar PD)20: 3,9% (w/v) papa dextrosa agar y 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). Mezclar todos los componentes directamente en la botella para el autoclave y añadir ddH2O más una barra de agitación magnética. Autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.</li>
	<li>Preparación de agar carbón PD20: 3,9% (w/v) papa dextrosa agar, carbón 1% (p/v) y 1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). Mezclar todos los componentes directamente en la botella para el autoclave y añadir ddH2O más una barra de agitación magnética. Autoclave a 121 ° C durante 15 min; autoclave a una temperatura elevada durante un largo periodo de tiempo o repetidamente reduciría la calidad del medio.</li>
</ol>3. planta infección
<ol><li>Realizar análisis de maíz la división celular en respuesta a caballo de Troya entregada proteína (por ejemplo, basado en la microscopía celular contando) previamente. U. maydis -indujo proliferación celular maíz y formación de un tumor posterior comienza alrededor de 4-5 días post infección. Evaluación cuantitativa de la enfermedad dependen del tejido y se debe realizar de 6 a 14 días post infección. Nota: Distintos cultivares de maíz muestran diferentes niveles de susceptibilidad a la infección por U. maydis . Maíz cvs W23, A188, Pedernal de Gaspe, gallo de oro temprano o Va35 susceptibilidad a este patógeno y así cultivares adecuados para estudios de caballo de Troya.</li>
	<li>Preparación del inóculo de U. maydis
	<ol>
<li>Incluyen la cepa progenitora SG200 como control negativo en todos los experimentos de caballo de Troya para la estimación de los efectos secundarios a la infección por la cepa transgénica. Aquí, se utiliza una cepa de U. maydis expresando una versión no segregada de la proteína de interés como control negativo. Sin embargo, por razones de factibilidad (p. ej., grandes proyecciones), la cepa progenitora puede ser la opción más fácil de control.</li>
		<li>Antes de comenzar el experimento, estimar qué cantidad de la cultura de la infección es necesarios. Tenga en cuenta que la infección de la planta requiere de 1-1.5 mL de la suspensión de U. maydis depende del tipo de maíz tejido. Nota: Aproximadamente 1 mL de una cultura de la noche a la mañana es suficiente para la dilución a un OD600 de 0.2 en 20 mL de medio deluz YEPS y 25 mL de un cultivo de U. maydis con un OD600 de 0.8-1.0 es suficiente para la infección de plantas de 13-16.</li>
		<li>Rasguño U. maydis de un agar de PD la placa con una pipeta Pasteur estéril, inocular en 5 mL de medio YEPSluz y dejar que la cultura crece a 28 ° C con agitación constante a 200 rpm por 16 h.</li>
		<li>Antes de la infección, examinar la cultura de la inoculación de U. maydis por microscopia ligera estándar para el adecuado crecimiento y contaminación bacteriana con 400 aumentos. Nota: En una cultura adecuada, sólo el hongo en forma de cigarro es visible (figura 2).</li>
		<li>900 μl de fresco YEPSluz se mezclan con 100 μl del cultivo durante la noche y medir el OD600 con YEPSluz medio como un espacio en blanco en el análisis de espectrofotómetro.</li>
		<li>Diluir la cultura durante la noche con medio fresco deluz YEPS a un OD600 de 0.2 y dejar que la cultura crece a 28 ° C con agitación constante a 200 rpm hasta llegar a la fase de crecimiento de registro media indicada por un OD600 nm de 0.8-1.0. Nota: U. maydis células duplican cada 2 h en estas condiciones, así el deseado OD600 se alcanza después de 4-5 h de cultivo.</li>
		<li>Cosechar las células en OD600 de 0.8-1.0 girando a 3.000 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar el precipitado de células una vez con el ddH2O. Para ello, añadir un volumen de cultivo de ddH2O, vuelta con 3000 x g durante 10 min y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el precipitado celular cuidadosamente en ddH2O con una pipeta de vidrio de 20 mL, ajustando así el OD final600 3.0 (para un análisis de caballo de Troya) o 1.0 (para la calificación de la enfermedad).</li>
	</ol></li>
	<li>Verificación del caballo de Troya: en planta de la secreción de la proteína de fusión maíz
	<ol>
<li>Infectar las plántulas de maíz con una cepa de caballo de Troya17.</li>
		<li>Realizar la proyección de imagen microscópica de micorrizada en 2-3 días post infección usando un microscopio de escaneo láser confocal. Para ello, suprimir un trozo rectangular de la hoja de 1 cm por debajo del punto de inyección, coloque la muestra en un portaobjetos y añadir una gota de ddH2O. Para visualizar la proteína de fusión mCherry, excitar la muestra con λ = 561 nm y emisión récord a λ = 580-630 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Infección de hojas de maíz adulto
	<ol>
<li>Cultivar plantas de maíz a la etapa de adulto hojas (hoja de cuando menos 7 crece en el tallo). Nota: Esta etapa se llega después de cuatro semanas en la siembra bajo condiciones de invernadero de 14 h, 28 ° C día/10 h, ritmo de la noche de 22 ° C con CV W23. Duración puede variar con las condiciones de cultivo y efecto invernadero maíz.</li>
		<li>Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.</li>
		<li>Presione el tallo cuidadosamente para localizar el tejido meristemático en el tallo. La base de los meristemos se puede distinguir por una transición de tallo más duro al más suave del tejido.</li>
		<li>Marque el meristemo en el tallo con un bolígrafo.</li>
		<li>Inyectan 1.5 mL de cultivo de U. maydis 1 cm arriba del meristem del lanzamiento o meristemo de la inflorescencia.</li>
		<li>Tasa de síntomas de la enfermedad en 6 y 12 días post infección.</li>
	</ol></li>
	<li>Infección de borlas
	<ol>
<li>Crecer plantas de maíz hasta llegar a la etapa de la borla. Nota: Una detallada cronología sobre el desarrollo de la antera y borla en cultivar maíz W23 fue descrita1819. Borlas que contienen las anteras pre-meióticas son altamente susceptibles a la infección por U. maydis ; en el cultivar maíz W23 borlas son del tamaño de 4-7 cm.</li>
		<li>Presione el tallo cuidadosamente para localizar la borla en el tallo.</li>
		<li>Marca la punta y la base de la borla en el tallo con un bolígrafo.</li>
		<li>Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.</li>
		<li>Inyecta 1,5 mL del inóculo en la borla. Para garantizar la equitativa distribución del inóculo, lentamente colocar 0,5 mL en la base de la espiga marcada con la pluma, la punta y la parte media.</li>
		<li>Tasa de síntomas de la enfermedad a 10 días post infección.</li>
	</ol></li>
	<li>Infección de oídos Nota: el desarrollo de tejido de la oreja difiere en diferentes cultivares de maíz y en condiciones de invernadero y debe respetarse cuidadosamente antes de la inoculación. Orejas a superar sedas son altamente susceptibles a la infección por U. maydis .<ol>
<li>Transferencia de la cultura de U. maydis (ver 3.2.9) en una jeringa de 3 mL con una aguja hipodérmica de 20 x 1.</li>
		<li>Inyectar la aguja de inoculación en el espacio entre las hojas de cáscara tan profundamente como sea posible sin dañar el oído.</li>
		<li>Versión 1.5 mL del inóculo en el oído.</li>
		<li>Retire la jeringa y aguja y masaje con cuidado la cob para distribuir igualmente la solución de U. maydis .</li>
		<li>Tasa de síntomas de la enfermedad a 14 días post infección.</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmar viabilidad del inóculo de U. maydis
	<ol>
<li>Colocar 10 μl del inóculo en una placa de agar carbón de PD e incube a temperatura ambiente durante 2 días. Nota: Si la cultura de U. maydis es capaz de filamentos de forma, micelio esponjoso, blanco se convierte en visible (figura 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Investigación de cultivo moderno exige protocolos de análisis molecular en genética y niveles de la proteína. Accesibilidad genética a través de transformación no es disponible o ineficientes y lentos para más especies de cultivos como el maíz. Por otra parte, herramientas genéticas confiables tales como sistemas de reportero promotor son escasos, lo que hace difícil para el estudio de la función de la proteína in situ de alta resolución espaciotemporal en sitios tisulares distintos. Apoplasto proteínas pueden e...

El patógeno foliares Ustilago maydis es el agente causativo del maíz smut enfermedad1. Infecta todas las partes aéreas de maíz resultando en tumores grandes que contienen esporas de melanized, negro. A nivel mundial, se estima en U. maydis causa una pérdida anual de alrededor del 2% de la producción de maíz, mientras que los tumores son apreciados como un manjar gastronómico en México. Infección de la planta se inicia por un apresorio que secreta enzimas lisis celular para penetrar la primera capa de células epidérmicas maíz. De un sitio de infección primaria, U. maydis crece intracelularmente e intracelular, invaden células de uno o dos capas cada día1,2. Resultado exitoso de la infección en hipertrofia de planta que se transforma en tumores visibles en cinco días post infección1,3,4. Durante todas las etapas de la infección, los hyphae fungicidas invaginate la membrana de citoplasma de la planta sin contacto directo con el citoplasma host1,2. El espacio apoplasmic apretado entre la hifa infectante y la membrana de plasma de la planta se considera que el sitio interactivo de host/patógeno, llamado la zona de interacción de foliares. Para superar el sistema inmune innato de planta, U. maydis secretan una matriz de proteínas efectoras en foliares interacción zona1. Algunos efectores son tomados por células de la planta, mientras que otros permanecen en los foliares interacción zona5,6,7,8. Efectores apoplásticos uno es UmPit2, que interactúa con las proteasas apoplastic maíz para prevenir la liberación de la señalización del péptido ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplasto proteasa actividad9,10.
En las últimas décadas, U. maydis se convirtió no sólo un modelo para la genética fúngica en la interacción planta-patógeno, sino también una valiosa herramienta en la biotecnología debido a un ciclo de vida bien comprendido, fácil accesibilidad genética y expresión heteróloga de secretada proteínas11,12,13. Señales para la secreción de ambas proteínas convencionales y no convencionales se han determinado lo que permite el control de modificaciones del posttranslational14. Recientemente, U. maydis fue empleado como una herramienta de caballo de Troya para estudiar pequeños, secretan proteínas maíz en situ15. El enfoque de caballo de Troya fue utilizado con éxito para analizar la función de la proteína secretada, pequeñas ZmMAC1 que participa en el desarrollo de la antera. ZmMAC1 induce la división periclinal de las células pluripotentes y especificación de destino celular de las células recién formado15. Por el mismo método, la función biológica del péptido asociado daño maíz ZmZIP1 fue revelada. U. maydis secretando el maíz A que zmzip1 dio lugar problemas de formación de tumor10. Por lo tanto, el caballo de Troya enfoque representa una valiosa alternativa a la proteína los estudios ines situ de alta resolución espaciotemporal que ni requieren generación de líneas de transformación de maíz estable ni infiltración de tejidos con heterologously proteínas expresadas y purificadas. En particular, la estrategia del caballo de Troya permite la secreción de cualquier proteína heteróloga en el apoplasto de maíz y comparación directa de infectados frente a células no infectadas de la planta dentro del mismo tejido.
Este protocolo muestra los pasos principales para la generación de una cepa de caballo de Troya de U. maydis para estudiar una proteína de interés. Además incluye información precisa sobre los procedimientos de la infección de tres tipos de tejido diferentes de maíz (hojas adultas, borlas y orejas) con U. maydis, que es un requisito previo para el estudio de la función de progreso y el proteínas infección espaciotemporal en estos tejidos diana. Otras especificaciones no son dadas en la amplificación del gen maíz y microscópica imagen técnicas, puesto que estos pasos son específicos del destino y dependiente del instrumento. Así, este protocolo está dirigido a usuarios avanzados de técnicas de biología molecular estándar.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 2 ml&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 aguja hipodérmica</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>ADNc del maíz</td><td></td><td></td><td>del tejido del maíz que expresa el gen del interrest</td></tr><tr><td>Carbón vegetal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de barrido láser confocal <td>uso de equipos disponibles localmente</td></tr><tr><td>Cubeta (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora-agitadora ajustada a 28 & grados; C, 200 rpm</td><td></td><td></td><td>use equipo disponible localmente</td></tr><tr><td>Microscopio óptico con aumento</td><td></td><td></td> de 400 veces <td>use equipo disponible</td></tr> <tr><td>localmenteNco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>por favor contacte al autor correspondiente&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur (vidrio, punta larga)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>se puede cambiar por otros vectores de clonación básicos como pENTR o pJET</td></tr><tr><td>Agar patata dextrosa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Uso de bolígrafos</td><td></td><td></td> Sharpie <td>Equipos disponibles localmente</td></tr><tr><td>Uso de espectrofotómetros</td><td></td><td></td><td>equipos disponibles</td></tr> <tr><td>localmenteSsp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de ustilago maydis como un caballo de troya en situ entrega de maíz las proteínas

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Inspirado en el mito de caballo Trojan Homer´s, hemos diseñado el patógeno del maíz Ustilago maydis para proporcionar proteínas secretadas en el apoplasto maíz permitiendo análisis fenotípico en vivo. Este método no se basa en la transformación de maíz pero explota capacidades secretoras de patógenos y genética microbiana. En este documento, permite la inspección de en vivo entrega proteínas secretadas con alta resolución espaciotemporal en diferentes tipos de sitios de infección y los tejidos. La estrategia del caballo de Troya puede ser utilizada para complementar transitorio maíz fenotipos de pérdida de función, para caracterizar funcionalmente dominios de la proteína, para analizar los efectos de la proteína objetivo, o para el estudio de sobredosificación de proteína juego, convirtiéndolo en una poderosa herramienta estudios de la proteína en el sistema de cultivo de maíz. Este trabajo contiene un protocolo preciso sobre cómo generar una cepa de caballo de Troya seguida por protocolos estandarizados infección aplicar este método a tres tipos de tejido diferentes de maíz.

Construcciones para los experimentos de caballo de Troya de U. maydis se clonan en el plásmido p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene de interés mCherry-Ha. El maíz gen de interés se fusiona a un reportero de fluorescencia mCherry y un epitopo HA-etiqueta. La expresión de la proteína de fusión es bajo control del promotor U. maydis Umpit2 que específicamente se activa ...

Este trabajo describe la clonación de una cepa de caballo de Troya de Ustilago maydis para la entrega in situ de proteínas secretadas de maíz en tres tipos diferentes de tejidos de maíz.

Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

La investigación de los procesos a nivel genético y proteico es crucial en la investigación de cultivos. Nuestro enfoque permite la inspección de proteínas de laberinto secretadas con la resolución temporal espacial más alta en diferentes lados y tejidos de infección. El método de caballo de Troya explora las capacidades de secretor automáticas útiles.Elude las transformaciones de laberinto que consumen mucho tiempo y las transformaciones desafiantes del laberinto, y facilita estudios detallados sobre proteínas secretadas dentro de la appelplatz del laberinto. Información detallada sobre la infección adecuada de hojas de laberinto añadidas, borlas y oído. Y muestra el estudio exitoso de la progresión de la infección y la función proteica en el tejido objetivo.Demostrando el procedimiento estará Isabell Fiedler, una estudiante de posgrado del laboratorio. Para comenzar el experimento, rasque a Eumadous de una placa de pediatra usando una pipeta pasteur estéril. Inocular 5 mililitros de YEPS Light Medium con Eumadous.Crecer el cultivo a 28 grados centígrados, con un temblor constante a 200 rpm durante 16 horas. Al día siguiente mezcla 900 microlitros de YEPS Light fresco con 100 microlitros del cultivo nocturno. Mida el OD-600 utilizando YEPS Light Medium como un espacio en blanco en el análisis del espectrofotómetro.Diluir el cultivo nocturno con YEPS Light Medium fresco a un OD-600 de 2. Deje que el cultivo crezca a 28 grados celsius con temblores constantes a 200 rpm, hasta que alcance la fase de crecimiento del tronco medio, indicado por un OD-600 de 8 a 1,0. Después de la incubación, cosechar las células girando a 3000 veces chi durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante. A continuación, lave la pilette de celda una vez con 1 volumen de cultivo de DDH2O. Gire las células a 3000 veces chi durante 10 minutos y deseche el sobrenadante.Luego, vuelva a suspender cuidadosamente la pilette de la celda en DDH2O, usando una pipeta de vidrio de 20 mililitros. Ajustando así el OD-600 final a 3.0 para un ensayo de Caballo de Troya o 1.0 para la clasificación de la enfermedad. Cultivar las plantas del laberinto a una etapa de hojas adultas, donde al menos la hoja 7 crece dentro del tallo.A continuación, transfiera el cultivo de Eumadous a una jeringa de 3 mililitros con una aguja hipodérmica bi una de calibre 20. Presione el tallo cuidadosamente para localizar el tejido del tallo del espejo. La base del tallo de espejo se puede distinguir por una transición de tallo más duro a tejido más blando.Marca el tallo de espejo en el tallo usando un bolígrafo. Inyectar 1,5 mililitros de cultivo de Eumadous 1 centímetro por encima del tallo de espejo de brote o tallo de espejo de inflorescencia. Una vez que las plantas del laberinto lleguen a la etapa de borla, presione el tallo cuidadosamente para localizar la borla en el tallo.Marque la punta y la base de la borla en el tallo usando una pluma. Transfiera el cultivo de Eumadous a una jeringa de 3 mililitros con una aguja hipodérmica bi una de calibre 20 para inyectar un total de 1,5 mililitros del inóculo alrededor de la borla. Para asegurar la distribución equitativa del inóculo, coloque lentamente 5 mililitros en la punta, el centro y la base de la borla marcada con la pluma.Transfiera el cultivo de Eumadous a una jeringa de 3 mililitros con una aguja hipodérmica bi una calibre 20. Inyecte la aguja de inoculación en el espacio entre las hojas de cáscara lo más profundamente posible sin herir la oreja, luego libere 1,5 mililitros del inóculo alrededor de la oreja. A continuación, retire la jeringa y la aguja y masajee cuidadosamente la mazorca para distribuir la solución de Eumadous por igual.Suelte 10 microlitros de inóculo en una placa de sinfín de carbón PD. A continuación, incubar a temperatura ambiente durante 2 días. Hyphae secretando ZM Mach1 están rodeados de señal fluorescente y cereza.Por el contrario, las hifas no secreantes sólo muestran señal fluorescente en el citoplasma fúngico. La localización inadecuada de la borla o la distribución desigual del inóculo pueden dar lugar a borlas no infectadas o sólo a una infección parcial de la borla en comparación con la distribución uniforme. La cepa patógena de Trojan Progenester SG-200, cultivada en la cola de carbón PD, forma filamentos de pelusa blanca en la placa como se muestra.Mientras que la cepa Eumadous FB1 requiere apareamiento antes de la formación de filamentos infecciosos. Después de la infección, la posible respuesta de los signos de la proteína hepática de caballo de Troya se puede analizar utilizando varios métodos, incluyendo clasificaciones de enfermedades o imágenes microscópicas. Para muchos patógenos, la transformación y la secreción son bien entendidas y se pueden explorar de una manera similar.Por lo tanto, permiten el estudio del host, que no son susceptibles a la transformación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fuente: Beernink, B. M. et al. Agroinoculación directa de plántulas de maíz mediante inyección con clones infecciosos del virus recombinante del mosaico de la cola de zorro y del virus del mosaico de la caña de azúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demuestra la administración mediada por Agrobacterium de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para el silenciamiento génico. Describe el proceso de infección por Agrobacterium , la propagación sistémica del virus y los cambios...

Administración mediada por agrobacterias de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para silenciamiento génico

Se describe el uso de un método de inyección con aguja para inocular plantas de maíz y teosinto con el patógeno biotrófico Ustilago maydis.  El método de inoculación por inyección de agujas facilita la entrega controlada del patógeno fúngico entre las hojas de la planta donde el patógeno entra en la planta a través de la formación de appresoria. Este método es altamente eficiente, permitiendo inoculaciones reproducibles con U. maydis.

Un método rápido y eficiente para evaluar la patogenicidad de Ustilago maydis en las líneas de maíz y teosinte

Se describe una sólida estrategia de sustitución de genes para manipular genéticamente el hongo Ustilago maydis carbón. Este protocolo explica cómo generar mutantes de deleción para investigar fenotipos de infección. Se puede extender para modificar genes de cualquier manera deseada, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia que codifica un marcador de proteína fluorescente.

La manipulación genética del patógeno de la planta<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Estudiar biología de hongos y plantas Microbe Interactions

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Los genes morfogénicos de las plantas se pueden utilizar para mejorar la transformación genética de los genotipos recalcitrantes. Aquí se describe un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium(QuickCorn) para tres importantes líneas de maíz público endogámico.

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para transfectar transitoriamente millones de protoplastos de maíz para probar grandes bibliotecas de plásmidos en células de mesófilo de maíz.

Transfección escalable de protoplastos de mesófilo de maíz

secuenciación de una sola célula es una herramienta cada vez más popular y accesible para hacer frente a los cambios genómicos en alta resolución. Proporcionamos un protocolo que utiliza la secuenciación de una sola célula para identificar alteraciones en el número de copias en las células individuales.

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Se presenta una estrategia para generar mutaciones en genes de histonas en su ubicación endógena en Saccharomyces cerevisiae.

Targeted<em&gt; In situ</em&gt; mutagénesis de histona genes en la levadura en ciernes

Aquí describimos la entrega de microRNA usando un serotipo de virus adeno-asociado recombinante 9 en un modelo de ratón de una enfermedad neuromuscular. Una sola administración periférica en ratones dio lugar a la sobreexpresión de miRNA sostenida en el músculo y neuronas del motor, proporcionando una oportunidad de estudio miRNA función y potencial terapéutico en vivo.

Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

Aprende a utilizar Ustilago maydis como caballo de Troya para la entrega in situ de proteínas en maíz. Este método permite estudiar la progresión de infección y la función de proteínas secretadas en tejidos específicos de la planta.

Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas

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