Name: Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Aprende a evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando Escherichia coli con EGFP. Este método rápido permite comparar la función inmune innata entre grupos de diferentes edades mediante microscopía de fluorescencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 31800046) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Liaoning (Nº 20170540262) apoyan este trabajo. Este trabajo fue realizado en los laboratorios del centro de investigación científica en el segundo Hospital de Dalian Medical University. Los autores desean agradecer a Xiao-Lin Sang su asistencia con la citometría de flujo y Bo Qu y Dong Chuan Yang por su asistencia en la producción de vídeo.

Todos los procedimientos fueron realizados en los institutos nacionales de salud directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio y los protocolos fueron aprobados por el cuidado Animal y uso Comité de Dalian Universidad médica. Dieciséis meses de edad (con un peso de 30-35 g) y ocho semanas de edad se obtuvieron ratones de C57BL/6 (específicos del patógeno-libre) machos (20-25 g) SPF SPF animal del centro de la de la Universidad médica de Dalian. Todos los ratones se mantuvieron en el alojamiento de los animales con acceso a agua y alimento ad libitum. La temperatura se mantuvo a 20-24 ° C, humedad fue 40% - 70%, e iluminación era oscuro de 12 h luz/12 h. Los animales podían aclimatarse al ambiente por al menos 7 días antes del experimento.
1. construcción del plásmido pET-SUMO-EGFP y la inducción de la expresión de EGFP
<ol><li>Sintetizar el fragmento del gen EGFP (una secuencia bp 717 sintetizada por un servicio de síntesis genética personalizada, véase Tabla de materiales y archivo adicional 1 de la secuencia) y amplificar el fragmento con el (primer avance 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') y primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), con alta fidelidad Taq ADN polimerasa.</li>
	<li>Para asegurar que los productos de la reacción en cadena (PCR) polimerasa tienen solo 3' adenina voladizos para la clonación de TA en el paso siguiente, utilice una extensión de 30 min a 72 ° C después del último ciclo (ver archivo adicional 1 para las condiciones PCR). Comprobar el producto PCR por electroforesis en gel de agarosa.</li>
	<li>Clonar el producto PCR en el vector pET-SUMO (véase Tabla de materiales) usando el TA clonación método5 con T4 ADN ligasa. Incubar la reacción a temperatura ambiente (20-25 ° C) durante 30 minutos. El vector es lineal entre los nucleótidos 653 y 654 con un 1 5 bp T-saliente en cada filamento.</li>
	<li>Transformar el producto de la ligadura en la cepa químicamente competente de BL21(DE) e. coli como sigue: Añadir 5 μl (100 ng) del producto de PCR a 100 μl de células competentes BL21(DE) mediante choque térmico a 42 ° C por 90 s; mantener la mezcla en hielo durante 3 min. y luego, añadir 400 μL de medio de caldo (LB) Lisogenia precalentado a 37 ° C, agitándolo durante 1 h a 37 ° C y 120 rpm.</li>
	<li>Inocular 100 μl de las bacterias sobre la superficie de una placa de LB-kanamicina (100 μg/mL) con la lactosa de inductor (0,5 mmol/L), rendimiento de la cepa de expresión de EGFP. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Nota: Si la EGFP se expresa correctamente, se observan algunas colonias como luz verde brillante en la oscuridad.<ol>
<li>Opcionalmente, seleccione colonias para verificar el fragmento insertado de EGFP por secuenciación de ADN. Los iniciadores para la secuenciación del ADN son: avance, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; reverso, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular una colonia positiva en 5 mL de medio LB con kanamicina μg/mL 100. Incubar en una incubadora de agitación a 120 rpm durante 2 h, 37 el ° C, añadir la lactosa inductor a una concentración final de 0,5 mmol/L y continuar a temblar durante 6 h, inducir la expresión de EGFP. Empíricamente, cuando temblores durante 6 h, la densidad óptica a 600 nm (OD600) puede llegar a 0.7 o superior.</li>
	<li>Añadir 10 μl de medio de cultivo bacteriano en un portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos y examinar la expresión de EGFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido. Las bacterias expresan EGFP pueden almacenarse en el medio de a 2-8 ° C durante varias semanas.</li>
</ol>2. primaria cultura y aislamiento de macrófagos peritoneales de ratón
<ol><li>Añadir a 100 mL de agua destilada y la mezcla a la esterilidad antes de su uso de autoclave 3,5 g de tioglicolato. Bombear el medio de cultivo tioglicolato en la jeringa estéril de 1 mL en la campana para la inyección peritoneal de ratón. Utilice un ratón por jeringa para evitar la infección. El uso de tioglicolato puede aumentar el número de macrófagos. Los macrófagos peritoneales residentes pueden ser aislados sin tioglicolato con bajo rendimientos de macrófago.</li>
	<li>Anestesiar el ratón utilizando un método aprobado por la Comisión de uso y cuidado de los animales local. Inyectar 1 mL de medio de cultivo tioglicolato de 3,5% en la cavidad peritoneal del ratón con la jeringa de 1 mL, utilizando una aguja de 23 G. Nota: Mediante la inducción de la anestesia, la inyección peritoneal puede realizarse fácilmente y reduce el riesgo de lesiones a los órganos internos causados por la inyección.</li>
	<li>Mantener el ratón con agua y alimento ad libitum durante 3 días. Controlar el cuerpo peso e ingesta de alimentos de los animales cada día. Si la pérdida de peso es superior al 10% dentro de 3 días, excluye el animal del experimento.</li>
	<li>Después de 3 días, eutanasia el ratón mediante dislocación cervical después de la rápida inducción de anestesia por sevoflurane en una caja cerrada. Como alternativa, utilizar un método que ha sido aprobado por el Comité local de atención y uso animal a eutanasia el ratón.</li>
	<li>Ponga el ratón en un plato (con un diámetro de 10 cm) con etanol al 75% para esterilizar y transferir rápidamente a la campana. Ponga el ratón sobre una placa y la pata delantera a la Junta para fijar la posición del ratón.</li>
	<li>Utilizando una jeringa de 5 mL atada 20 G aguja, colocando el bisel de la aguja hacia arriba en un ángulo de 30° - 40°, inyecta solución salina 5 mL de frío (4-10 ° C) con tampón fosfato (PBS) en la parte inferior del abdomen en la cavidad peritoneal del ratón, evitando perforar el intestino. Si se pincha el intestino (o cualquier otro órgano), el ratón y sus células pueden ya no ser utilizados para experimentos, como esto puede activar las células que no son aptos para el cultivo celular primario.</li>
	<li>Realizar un suave masaje en los dos lados del abdomen del ratón. A continuación, aspirar el líquido suavemente y lentamente. Dispensar el líquido peritoneal en un tubo de centrífuga de 50 mL. Repetir estos pasos 2 x o 3 x.</li>
	<li>Centrifugar las células suspendidas durante 10 min a 400 x g en una centrífuga refrigerada (4-8 ° C). Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en Medio RPMI 1640 con 10% suero bovino fetal (FBS). Contar las células. Empíricamente, la densidad celular es aproximadamente igual a 5 x 106 células/mL cuando las células se resuspendió en 10 mL de medio.</li>
	<li>Añadir 5 x 106 células en cada pozo de una placa de 6 pozos para el análisis de citometría de flujo y 5 x 105 células por pocillo en una placa de 24 pocillos para un microscopio de fluorescencia. La cultura las células a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 durante la noche. El medio de cultivo puede ser renovado después de 3 horas para eliminar las células nonadherent porque la mayoría de estos son los linfocitos. Las células adherentes son principalmente los macrófagos, y puede adherirse a tratados con cultura de tejido plástico.</li>
</ol>3. ensayo de fagocitosis del macrófago usando el microscopio de fluorescencia
<ol><li>Observar las células bajo un microscopio de campo brillante para evaluar viabilidad celular y densidad celular.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos. Añadir 100 μl de medio de cultivo fresco y 10 μl de suspensión bacteriana (aproximadamente 2 x 107 células) en cada pocillo como se describe en la tabla 1. Incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
	<li>Lave suavemente 3 x x-5 con 500 μl de PBS frío por pozo para lavar las bacterias noninternalized.</li>
	<li>Incubar las células con formaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Lavar las células fijadas 3 x con PBS (500 μL/pocillo).</li>
	<li>Añadir 200 μL de phalloidin 633 de la fluorescencia del tinte conjugados solución de trabajo (véase Tabla de materiales) a la F-actina de la mancha. Almacén en un lugar oscuro y húmedo (60% - 80%) a temperatura ambiente durante 60 minutos lavar las células 3 x con PBS (500 μL/pocillo) para eliminar cualquier exceso phalloidin. Por la coloración de la F-actina, el citoplasma puede ser descrito y ayudan a distinguir las bacterias internalizadas.</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución de trabajo de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (1 μg/mL) Mancha el núcleo de las células e incubar por 5 min en un lugar oscuro y húmedo a temperatura ambiente. Enjuague 1 x con PBS (500 μL/pocillo) y 1 x con el mismo volumen de agua destilada. Luego, las células estarán listas para observación bajo un microscopio de fluorescencia invertido.</li>
</ol>4. ensayo de fagocitosis macrófago mediante citometría de flujo
<ol><li>Para minimizar los errores experimentales y hacer una adecuada interpretación de los resultados, establecer los grupos y tubos para el experimento de control como se indica en la tabla 2.<ol>
<li>Para el grupo control, que se colocará en el hielo (grupo 4 en el cuadro 2), retire el medio de la placa de 6 pozos y lavar 1 x con PBS. Luego, añadir 1 mL de EDTA frío 70 m m en el pozo para separar las células y transferirlos al tubo de citometría de flujo. Añadir 50 μl de suspensión bacteriana en el tubo y coloque en hielo durante 1 hora.</li>
		<li>Para los otros grupos, eliminar el medio de cultivo. Añadir 1 mL de medio fresco en cada pozo. Añadir 50 μl de suspensión bacteriana en los pozos de acuerdo con la configuración de grupo, como se describe en la tabla 2. Luego, coloque la placa de 6 pozos en los 37 ° C, 5% CO2 incubadora de 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para calmar la fluorescencia de noninternalized e. coli, añadir 200 μL de solución de agua de cristal violeta (CV) de 0,8% en el pozo y se mecen poco, evitando un resultado falso positivo por el atascamiento de EGFP expresar e. coli a la superficie de la los macrófagos pero no internalizado. Lavar las células 3 x con PBS para quitar cualquier CV residual.</li>
	<li>Luego, añadir 1 mL de EDTA frío 70 m m en el pozo para separar las células y transferirlos al tubo de citometría de flujo.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.</li>
	<li>Añada 100 μl de PBS para resuspender las células. Añadir 5 μl del anticuerpo F4/80-PE-conjugado (un antígeno de superficie expresado en macrófagos de ratón) en los tubos o isotipo IgG2a PE de uso, según la configuración de grupo. Brevemente Vortex e incubar las muestras en hielo durante 5-10 min en la oscuridad.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS a cada tubo y centrifugar a 400 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular con 200-300 μL de PBS para el análisis de citometría de flujo. Ejecutar cada tubo y adquirir datos para al menos 10.000 eventos de células F4/80+ .</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos de este protocolo están muy simple y sencilla. Uno de los pasos críticos es inducir la expresión de EGFP en e. coli. Generalmente, cuando un gen de eucariotes, como EGFP, está previsto expresar en procariotes como la e. coli, existe el riesgo de que la proteína forma agregados inactivos (cuerpos de inclusión), que cambia la estructura nativa de la proteína y la actividad. Utilizando el vector pET-SUMO y construyendo el plásmido pET-SUMO-EGFP, la proteína de la fusión de EGFP-SUMO expresado con...

Ensayos de fagocitosis del macrófago se utilizan a menudo para el estudio de la función inmune innata. La respuesta inmunitaria innata puede indicar susceptibilidad a la infección. Líneas celulares de macrófagos son ampliamente utilizadas en estudios de Inmunología. Sin embargo, el paso extendido puede causar la pérdida de gene y compromete las funciones inmunológicas en estas líneas celulares. Así, los macrófagos peritoneales primarios son el objeto ideal para estudiar la función de células1.
Aunque fue probablemente intacto en el cuerpo de la respuesta inmunitaria innata, la capacidad fagocítica puede disminuir con respecto a que en el más joven del cuerpo2,3. Aquí le mostraremos un método para evaluar la fagocitosis de los macrófagos peritoneales de jóvenes (8 semanas de edad) y el ratón de edad (16-month-old) con expresión de EGFP e. coli, que es conveniente, rápida y económicamente factible.
El uso de una cepa de expresión de EGFP e. coli es una de las ventajas de este ensayo ya que estas bacterias son estables y mostrar una señal de fluorescencia fuerte, incluso después de que los macrófagos son fijos por paraformaldehído al 4% (w/v). Además, mediante el uso de la expresión de EGFP e. coli, los investigadores no necesitan tinción más después de la fagocitosis, que ahorra tiempo. Además, los macrófagos son immunoresponsive para el antígeno de superficie de e. coli , lo que e. coli más adecuado para el ensayo de fagocitosis que el uso de la expresión de EGFP hongos o granos marcados con fluoresceína.
Con expresión de EGFP e. coli, un ensayo de fagocitosis puede ser fácilmente realizado en 2 h y medido por tanto flujo cytometry y fluorescencia microscopía, dependiendo del propósito del investigador. Puesto que este método mide directamente la capacidad fagocítica, los resultados son más reproducibles que otros métodos indirectos.
Este método ha sido validado también en una línea de 264.7 células y células de sangre periférica mononuclear4. El texto siguiente proporciona las instrucciones detalladas paso a paso para realizar este análisis y destaca los pasos críticos que los investigadores pueden modificar para satisfacer las necesidades de sus experimentos.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences-Biotina</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-ratón CD16/32 Anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO Sistema de expresión de proteínas</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Servicio de síntesis génica personalizado Takara</td><td>Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)</td><td>Anticuerpo</td> anti-ratón ThermoFisher <td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE para FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp; Microscopio invertido</td><td>Leica</td> <td>Microsystems-PE</td><td></td></tr> <tr><td>Rat IgG2a, &kappa;-control de isotipo</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Solución de trabajo conjugada con colorante de fluorescencia de faloidina 633</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Medio de tioglicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde escherichia coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Este manuscrito describe un método simple y reproducible para realizar un ensayo de fagocitosis. La primera parte de este método implica la construcción de un vector pET-SUMO-EGFP (SUMO = pequeño ubiquitin-like modifier) y expresión de la proteína de fluorescencia verde (EGFP) en Escherichia coli (BL21DE). Expresión de EGFP e. coli es coincubated con los macrófagos por 1 h a 37 ° C; el grupo control negativo se incuba en hielo para la misma cantidad de tiempo. Entonces, los macrófagos están listos para la evaluación. Las ventajas de esta técnica incluyen sus pasos sencillo y fagocitosis puede ser medida por ambos microscopio de flujo citómetro y fluorescencia. La expresión de EGFP e. coli son estables y mostrar una señal de fluorescencia fuerte incluso después de que los macrófagos son fijados con paraformaldehido. Este método no sólo es adecuado para la evaluación de las líneas celulares de macrófagos o macrófagos primarios en vitro pero también conveniente para la evaluación de la fagocitosis de granulocitos y monocitos en células mononucleares de sangre periférica. Los resultados muestran que la capacidad fagocitaria de los macrófagos peritoneales de ratones jóvenes (ocho semanas de edad) es mayor que la de los macrófagos de ratones (16 meses de edad) años de edad. En Resumen, este método mide la fagocitosis de macrófagos y es conveniente para estudiar la función del sistema inmune innato.

El vector pET-SUMO utiliza un pequeño modificador de ubiquitina-como para permitir la expresión de proteínas nativas en la e. coli. Fusión de SUMO puede mejorar considerablemente la solubilidad EGFP, lo que le permite ser detectado fácilmente. Si la expresión de EGFP con éxito es inducida por lactosa, se observan colonias verdes en la oscuridad (figura 1A). Puntos verdes, que representan la expresión de EGFP e. coli, se observan bajo un micr...

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Este protocolo demostró un método simple y producible para evaluar la capacidad de la fagocitosis de los macrófagos utilizando Escherichia coli, que expresa EGFP. Hola, mi nombre es Jun-Yu de The Second Hospital de la Universidad Médica de Dalian. Hoy vamos a mostrarte una manera fácil y visualizar la manera de evaluar la fagocitosis de macrófagos que se puede hacer fácilmente dentro de dos horas.Este método fue ampliamente utilizado en el estudio de la función inmune innata. Se cree que la función inmune innata permaneció intacta en los ancianos. Así que hoy vamos a aislar los macrófagos peritoneales de los ratones ancianos y jóvenes y a ver la capacidad fagocítica de estos dos grupos.Bueno, empecemos. En primer lugar, sintetizar el fragmento del gen EGFP y clonar el fragmento utilizando la polimerasa de ADN Taq de alta fidelidad. A continuación, ligar el producto PCR en el vector pET SUMO.En tercer lugar, transformar los productos de ligadura en la cepa E.coli e inducir EGFP expresar con lactosa. Estos E.coli que expresan EGFP sirvieron como marcador para el ensayo de fagocitosis. A continuación, se aislaron y cultivaron macrófagos peritoneo de ratón.Entonces, E.coli, expresión de EGFP, fueron acuñados con los macrófagos durante una hora a 37 grados centigrees. Después de la etapa de enfriamiento, los macrófagos estaban listos para ser evaluados tanto por el microscopio de fluorescencia como por el citómetro de flujo. Sintetice el fragmento del gen EGFP y amplifica el fragmento con una imprimación hacia adelante y hacia atrás utilizando polimerasa de ADN Taq de alta fidelidad.Para garantizar que los productos de PCR tuvieran voladizos de adenina de tres extremos para clonación de TA en el siguiente paso, se recomienda una extensión de 30 minutos a 72 grados centigrees después del último ciclo. Compruebe el producto PCR mediante electroforesis de gel de agarosa. Si el fragmento se ha amplificado correctamente, se puede observar una banda de 717 bp en el gel.Clonar el producto PCR en el vector pET SUMO utilizando el método de clonación TA con ligasa de ADN T4. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue cinco microlitros de producto PCR en 100 microlitrotro de células competentes para BL21.Caliente los golpes de las células a 42 grados centígrados durante 90 segundos, luego mantenga la mezcla sobre hielo durante tres minutos. Añadir 400 microlitrotro de medio LB, precalentado a 37 grados centígrados. Temblando una hora a 37 grados centígrados y 120 rpm.Inocular las bacterias sobre la superficie de la placa LB con 100 microgramos por mililitro de kanamicina para cribar la E.coli transformada en vector. Incubar la placa en el horno de 37 grados centigrees durante la noche. Al día siguiente, inocular una colonia positiva en cinco mililitros de medios LB con 100 microgramos por mililitro de kanamicina.Incubar en la incubadora de temblores de 37 grados a 120 rpm durante dos horas. A continuación, añadir la lactosa inductora a una concentración final de 0,5 mililitros por litro y continuar agitando seis horas, induciendo la expresión EGFP. Empíricamente, al agitar seis horas, el OD600 puede llegar a 0.7 o superior.Por último, utilizando el microscopio de fluorescencia para verificar la extensión de la expresión de EGFP. Añadir 10 microlitrotro del medio de cultivo bacteriano a un portaobjetos. A continuación, cubra con un resbalón de cubierta.Examine la expresión de EGFP bajo el microscopio de fluorescencia. Añadir 3,5 gramos de tioginato en 100 mililitros de agua destilada. Esterilizar en autoclave antes de su uso.Aspirar el medio de tioboleo en la jeringa estéril de un mililitro en la capucha. Un ratón por jeringa para evitar la infección. Inyecte un mililitro de 3,5% de medio de tiolicivo en la cavidad peritoneal del ratón utilizando una aguja de calibre 23 y mantenga el ratón con agua y alimentos ad libitum durante tres días.Después de tres días, eutanasia el ratón por luxación cervical después de inducir rápidamente la anestesia por sevoflurano en una caja cerrada. Luego, ponga el ratón en un plato con 75% de etanol a estéril y transfiera a la capucha rápidamente. Coloque el ratón sobre la placa y coloque la pata delantera en la placa para fijar la posición del ratón.Usando una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 20, inyecte cinco mililitros de PBS frío en la parte inferior del abdomen en la cavidad peritoneal del ratón, evitando perforar el intestino. Realice un suave masaje en dos lados del abdomen del ratón. A continuación, aspirar el líquido abdominal suavemente y lentamente.Dispensar el líquido peritoneal en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Repita estos pasos dos o tres veces. Centrifugar las células suspendidas durante 10 minutos a 400 g en cuatro a ocho grados centígrados.Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en el medio RPMI 1640 con 10%suero bovino fetal. Agregue cinco millones de células a cada pozo de la placa de seis pozos para el ensayo de citometría de flujo y 500.000 células por pozo en una placa de 24 pozos para microscopio de fluorescencia. Cultivo de las células a 37 grados centigrees en una incubadora de dióxido de carbono 5% durante la noche.El medio de cultivo se puede actualizar después de tres horas para eliminar las células no adherentes porque la mayoría de estos eran linfocitos. Observe las células bajo un microscopio de campo brillante para evaluar la viabilidad celular y la densidad celular. La imagen que se muestra aquí estaba en condiciones normales de la celda primaria.Por lo general, la densidad celular del macrófago no era alta, porque la mayor parte de las células peritoneales eran linfocitos. Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pozos. Añadir 100 microlitrotro de medio de cultivo fresco y 10 microlitrotro de medio bacteriano.Luego incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante una hora. Lavar suavemente con 500 microlitro de PBS frío por pozo de tres a cinco veces para lavar las bacterias no internalizadas. Incubar las células con 4%formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos.Lave las células con PBS tres veces. Añadir solución de trabajo conjugada de faloide 633 para manchar la F-actina. Conservar en un lugar oscuro y húmedo a temperatura ambiente durante 60 minutos.Agregue la solución de trabajo DAPI para manchar la célula nuclear e incubar durante cinco minutos en un lugar oscuro a temperatura ambiente. Enjuagar una vez con PBS y una vez con el mismo volumen en agua destilada. El E.coli que expresa EGFP en verde sirvió como marcador de fagocitosis.Para minimizar los errores experimentales y hacer una interpretación adecuada de los resultados, establezca grupos y tubos de control para el experimento como se indica en la Tabla 2. Para el grupo de control que se colocará sobre el hielo, retire el medio de la placa de seis pozos y lave con PBS una vez. Luego agregue 70 mililitros por litro de EDTA frío un mililitro en el pozo para separar las células y transferirlas al tubo de citometría de flujo.Agregue 50 microlitro de suspensión bacteriana en el tubo y colóquelo en el hielo durante una hora. Para los otros grupos, retire el medio de cultivo, agregue un medio fresco mililitro en cada pozo. Añadir 50 microlitro de suspensión de bacterias en los pozos de acuerdo con la configuración del grupo como se describe en la tabla dos.A continuación, coloque la placa de seis pozos en la incubadora de 37 grados centigrees 5% de dióxido de carbono durante una hora. Para apagar la fluorescencia de E.coli no internalizado, agregue 200 microlitrotro de 0.8% de solución de agua violeta cristalina en el pozo y se balancee en breve. Este paso pretendía evitar el resultado falso positivo mediante la unión EGFP E.coli a la superficie de los macrófagos pero no interiorizado.Lavar las células con PBS tres veces para eliminar cualquier cristal violeta residual. Luego agregue 70 mililitros por litro de EDTA frío un mililitro en el pozo para separar las células y transferirlas al tubo de citometría de flujo. Centrifugar los tubos 2.000 rpm cinco minutos y desechar el sobrenadante.Agregue 100 microlitros de PBS para resuspender las células. Agregue cinco microlitros de anticuerpo conjugado F4 ATP en los tubos o isotipos según la configuración del grupo. Vortex brevemente e incubar las muestras sobre hielo durante cinco a 10 minutos en la oscuridad.Añadir un mililitro DE PBS en cada tubo y centrifugar 2.000 rpm cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Resuspender los gránulos celulares con 200 a 300 microlitros de PBS para el análisis de citometría de flujo.Ejecute cada tubo y adquiera datos para al menos 10.000 eventos de células F4/80 positivas. Aquí están las imágenes de fluorescencia de los macrófagos peritoneales de los grupos jóvenes y envejecidos. La fluorescencia roja representa F-actina.El verde representa E.coli, expresión de EGFP, y el azul representa el núcleo manchado por DAPI. Estas imágenes sugieren que los macrófagos del ratón joven tenían una capacidad fagocítica más fuerte que los del ratón envejecido. Las células F4/80-positivas y EGFP-positivas indicaron la capacidad fagocítica de los macrófagos.Estos resultados son consistentes con la tendencia de los resultados del microscopio de fluorescencia. Bueno, ya ves, aunque el número de las células inmunitarias innatas puede preservarse en ratón envejecido, la capacidad fagocítica disminuyó significativamente en comparación con el ratón joven. Se han empleado muchos métodos para evaluar la fagocitosis macrófago.Aquí demostramos un método mejorado que es conveniente, rápido y económicamente factible. Con E.coli, expresión de EGFP, un ensayo de fagocitosis se puede realizar y medir fácilmente mediante citómetro de flujo y microscopio fluorescente según las preferencias del investigador. También este método mide directamente la capacidad fagocítica.Los resultados son más reproducibles que otros métodos indirectos.

using-enhanced-green-fluorescence-protein-expressing-escherichia-coli

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células...

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Se presenta un método simplificado para la detección de la expresión de proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli basada en la fusión a la proteína verde fluorescente.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

Se presenta un protocolo detallado de un modelo de ratón para enterohemorrágica e. coli (EHEC) colonización utilizando bacterias etiquetado bioluminiscencia. La detección de estas bacterias bioluminiscentes por un no-invasivo en vivo sistema de animales vivos de imagen puede avanzar nuestra comprensión actual de la colonización de EHEC.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

Aquí divulgamos los métodos comunes para analizar la función fagocitaria de los macrófagos alveolares murinos y de remoción bacteriana de los pulmones. Estos métodos de estudian de fagocitosis in vitro de granos de isotiocianato de fluoresceína y la fagocitosis in vivo de la proteína fluorescente verde de Pseudomonas aeruginosa . También se describe un método para despejar a p. aeruginosa en ratones.

Fagocitosis del macrófago alveolar y remoción de bacterias en los ratones

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Aquí, describimos un procedimiento que permite la detección de bacterias patógenas en todo el órgano durante la infección y la cuantificación de las actividades de los reporteros fluorescentes.

Tomografía tridimensional de órgano entero de alta resolución de infecciones microbianas

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Aprende a evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando Escherichia coli con EGFP. Este método rápido permite comparar la función inmune innata entre grupos de diferentes edades mediante microscopía de fluorescencia.

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón (Video) | JoVE Journal

Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón

Explorar más videos