Name: Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprende a evaluar agentes reactivadores de latencia en VIH mediante un protocolo de alto rendimiento que analiza transcripción y splicing del ARN mensajero viral. Este método permite estudiar la reactivación del virus y el aclaramiento de reservorios latentes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto APP1129320 y la beca del programa APP1052979 de la NHMRC de Australia. Agradecemos al Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson y Michelle Y. Lee para proporcionar asesoramiento y construcciones esenciales para la realización de este trabajo. También agradecemos al personal del establecimiento de flujo DMI para su asesoramiento y asistencia generosa para mantener el citómetro de flujo utilizado en este estudio.

Nota: Procedimientos de clonación, transformación y la secuencia son discutidas en otra parte18,19. Los protocolos aquí a partir de la transfección de los vectores de expresión mamíferos (figura 3).
1. construcción de transfección de células HEK293T con la reportera de Color Dual
<ol><li>Cultivar células HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL) en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Después de descongelar, los experimentos de células HEK293T de paso 2 - 3 veces antes de usarlos en la transfección. Esto le daría el tiempo de las células para recuperarse del procedimiento de descongelación. PRECAUCIÓN: Contaminación por micoplasma de cultivos celulares sigue siendo un grave problema. Buenas prácticas de laboratorio y la prueba rutinaria de cultivos celulares son esenciales para disminuir el riesgo de contaminación por micoplasma y evitar difusión20.</li>
	<li>Dividir las celdas 1:2 un día antes de sembrar y transferirlas en medio DMEM fresco. Cultivar las células durante 24 h en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.</li>
	<li>El día antes de la transfección, quitarlo del medio del frasco de aspiración y lavar las células con tampón fosfato (DPBS) solución salina de Dulbecco libre de calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg2 +) para eliminar los restos de suero.</li>
	<li>Dispensar 5 mL de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) en el recipiente de la cultura y colocar a 37 ° C en un incubador 5% CO2 para 2 a 5 min.</li>
	<li>Cuando las células son separadas, añadir 5 mL de DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS para inhibir aún más la actividad de tripsina, que puede dañar las células.</li>
	<li>Resuspender suavemente transfiriendo la suspensión de células hacia arriba y hacia abajo para romper los grumos.</li>
	<li>Diluir las células 1:10 en tinción de azul de tripán (0.4%).</li>
	<li>Contar las células vivas que no toman trypan azules usando un microscopio (objetivo de 10 x) y una hematimetría.</li>
	<li>Calcular el número de células viables por mililitro tomando el promedio de lo recuento de células y multiplicando por 10.000 y por el factor de dilución (1:10) desde el trypan blue stain.</li>
	<li>Placa de 2 x 104 células en 100 μL de medio DMEM suplementado con 10% de SBF sin antibióticos en una placa de 96 pozos de fondo plano para 24 h.</li>
	<li>Para cada bien, diluir 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng de pCMV-RevNL4.3 y 100 ng de pCMV Tat101AD8-bandera ADN en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente. Para los experimentos sin Tat, use un vacío emparejado Tat vector pcDNA3.1 (-). Nota: Se recomienda el uso de ADN libre de endotoxinas. Por eso, preparar ADN libre de endotoxina mediante un kit de purificación de ácidos nucleicos midi o maxiprep. Determine la pureza de ADN midiendo la relación 260/280 de OD, que debe estar entre 1.7 y 1.9.</li>
	<li>Mezclar el reactivo de lípidos antes de su uso, luego diluir 0.65 μL en 50 μL de medio libre de suero. Mezclar suavemente e incubar 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Combinar el ADN diluido con el reactivo de lípidos diluidos.</li>
	<li>Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente. La solución puede aparecer turbia. Nota: Proceda al paso 1.15. dentro de 30 minutos.</li>
	<li>Dispensar 100 μL por pocillo de los complejos de ADN reactivo lipídico mediante goteo sobre las células.</li>
	<li>Mezclar suavemente, meciendo la placa hacia adelante y hacia atrás.</li>
	<li>
Incube la placa durante 5 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.
	<ol>
<li>Cada mezcla de reacción es suficiente para la transfección de un solo bien (96 pocillos). Ajustar la cantidad y volumen de los componentes según el número de fármacos y la combinación que sería probado y cuentas para variaciones de pipeteo. Todas las condiciones se prueban generalmente en triplicado.</li>
		<li>Transfectar pozos adicionales con 100 ng de plásmido EGFP y DsRed-Express ADN CMV-conducido por compensación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tratamiento de HEK293T Transfected las células con latencia agentes de inversión
Nota: Antes de cada ensayo, determinar la condición fisiológica de cada LRA por la medición de la viabilidad de las células después de la exposición a dosis altas y bajas de la droga en ensayo de proliferación celular.
<ol><li>Diluir cada ERS la concentración adecuada de trabajo con medio de cultivo (por ejemplo,, 1 μM para JQ1(+)). PRECAUCIÓN: Reconstituir los fármacos liofilizados con el solvente apropiado a una concentración de 10 mM. Guarde todo stock LRAs a-80 ° C en una alícuota de solo uso (5 μ) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.</li>
	<li>Cuidadosamente aspirar el medio de transfección con un multicanal y reemplace por 100 medio μL conteniendo ERS apropiado (tabla 1). Añadir medio muy suavemente junto a la pared del pozo para evitar el desprendimiento de las células HEK293T transfected, que desprenda fácilmente de la superficie de la placa de cultivo.</li>
	<li>Incube la placa durante 48 h en una 5% CO2 humidificada incubadora a 37 ° C.</li>
</ol>3. tinción de células Transfected con el tinte de viabilidad pueden corregir para el análisis de citometría de flujo
PRECAUCIÓN: Eliminación de desechos y células muertas es esencial para eliminar los falsos positivos y obtener resultados de alta calidad.
<ol><li>Separar las células en los medios de comunicación con 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por pozo y transfiriendo suavemente hacia arriba y abajo (~ 5 veces) con un multicanal, evitando la formación de espuma de los medios de comunicación. Si es necesario, separar las células de la placa utilizando 35 μl por pocillo de solución de tripsina-EDTA (0.05% - 10 m m en PBS) e incubar 5 min a 37 ° C, antes de neutralizar con medio que contiene el suero.</li>
	<li>Transferir las células a una placa de 96 pocillos fondo V.</li>
	<li>Girar las células durante 5 minutos a 500 x g a 4 ° C, y luego aspirar con cuidado el medio/PBS sin tocar las células.</li>
	<li>Lavar las células al menos 1 vez con 200 μL de PBS libre de suero, proteína.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C, luego deseche el sobrenadante inclinando la placa y retirando el tampón de lavado sin tocar las células.</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo de viabilidad pueden corregir tinte diluyendo la viabilidad tinte 1: 1000 en PBS libre de suero, proteína. Preparar 50 μl de la mancha diluida por pozo. Nota: Tintes de viabilidad están disponibles en una gama de colores adecuadas para el uso con láser azul, rojo y violeta. Preparar una solución stock de viabilidad pueden corregir tinte resuspender un frasco de la tintura liofilizada (componente A) con 50 μL de DMSO anhidro (componente B). Conservar a-20 ° C en un solo uso alícuota (1 μL cada), protegido de la luz.</li>
	<li>Añadir 50 μL de colorante diluido viabilidad a cada pozo y mezclar las células pipeteando arriba y abajo con un multicanal.</li>
	<li>Tinción para 10-15 min a 4 ° C, protegido de la luz.</li>
	<li>Lavar 1 - 2 veces con 150 μL de tampón de lavado (PBS con 1% bovinos albúmina sérica y 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Fijar las células con 100 μL de formaldehído al 1% recién preparado en tampón de lavado durante 10-15 min a 4 ° C en la oscuridad. PRECAUCIÓN: El formaldehído es muy tóxico. Preparar la solución de formaldehído 1% en una campana de humos para evitar la inhalación mientras que usa guantes y gafas de seguridad para la protección.</li>
	<li>Lavar las células 1 - 2 veces con 100 μL de tampón de lavado.</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 70 μL de tampón de lavado. Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí. Células fijas podrían ser almacenadas a 4 ° C en la oscuridad para el análisis al día siguiente en el citómetro de flujo.</li>
</ol>4. EGFP y mediciones DsRed por citometría de flujo y análisis de datos
Nota: Analizar la transcripción del VIH (% EGFP) y empalme (% DsRed) en un citómetro de flujo. Filtrar la muestra antes de la carrera con un celular-filtro 70 μm o 100 μm de malla de nylon para evitar la obstrucción de la boquilla.
<ol><li>Poner en marcha el citómetro y la computadora por lo menos 10 minutos antes para calentar los láseres.</li>
	<li>Antes de correr las muestras y comenzar la adquisición de datos, llenar el depósito de la vaina con solución salina 0.9% y aseguran que una pastilla de hipoclorito de sodio se agrega al tanque de residuos.</li>
	<li>Compruebe la célula de flujo para las burbujas de aire.</li>
	<li>Verificar que los detectores y los filtros son adecuados para el experimento. Nota: Para EGFP, uso del láser azul (488 nm) y 530/30 paso de banda, mientras que DsRed Express óptimo se detecta usando el laser amarillo (561 nm) y paso de banda de 610/20. Un láser azul (488 nm) y paso 610/20 también puede ser utilizado para detectar DsRed expresión.</li>
	<li>Comprobar el funcionamiento del citómetro y sensibilidad a través de detectores ejecutando el cuentas de calibración.</li>
	<li>Ajustar el avance (FSC-A) y voltajes de scatter (SSC-A) de lado con mancha muestra que la población principal es en la pantalla y claramente discernible. Nota: FSC (luz dispersada hacia delante) es una medida de la luz difracción en un ángulo plano, que depende del volumen de la célula (célula superficie o tamaño), mientras que SSC (lado dispersada luz) es una medida de la difracción de la luz en un ángulo recto, que es proporcional a granularidad de la célula y complejidad interna.</li>
	<li>Realizar compensación manual o automática mediante las muestras teñidas solo asegurar mínimo contagio de EGFP + población en el detector DsRed y viceversa. PRECAUCIÓN: Por compensación, utilice una muestra de las células que expresan cada una de la proteína fluorescente de color único como células teñidas con el tinte de viabilidad pueden corregir individualmente. No utilice cuentas de compensación FITC y PE para compensaciones de proteínas fluorescentes de EGFP y DsRed debido a diferentes características espectrales. Controles de compensación deben ser lo suficientemente brillantes para resolver positiva y negativa de la población.</li>
	<li>Crear parcelas y fijar las puertas usando la fluorescencia menos uno controla (FMO).</li>
	<li>Adquirir y registrar un mínimo de 10.000 eventos de células viables por muestra. Ejecutar ejemplos a velocidad media o baja para evitar dobletes pasando por la intercepción de láser. Utilizar pulso de compuerta geometría como SSC-A frente a SSC-H para eliminar dobletes. Comprobar la estabilidad del funcionamiento mediante el trazado de tiempo versus SSC-A ver cómo incluso el flujo es durante el funcionamiento.</li>
	<li>Al final de la carrera, limpiar los fluidos de citometría de flujo con detergentes concentrados y agua durante 5 minutos.</li>
	<li>Apagar el sistema, deseche la basura y volver a llenar el tanque de la vaina después de la adquisición.</li>
	<li>Analizar los datos utilizando un software de análisis de datos de citometría de flujo. Excluyen restos celulares y mata (dobletes) basado en la dispersión hacia delante y lateral, a continuación, eliminar las células muertas con la mancha de tinte de viabilidad (negativa población = células vivas). Identificar las células que expresan EGFP y DsRed (figura 4), así como el porcentaje de producto empalmado DsRed /(DsRed + EGFP) (figura 5).</li>
	<li>Determinar el efecto del LRA en la transcripción del VIH y empalmar mediante la comparación de las células no tratadas y las células expuestas al individuo o a una combinación de LRAs (figura 5).</li>
</ol>

<ol><li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li>
<li>Khoury, G., et al. Ch. 8. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhoury%2C+G+%22HIV+vaccine+and+cure+-+The+Path+Towards+Finding+an+Effective+Cure+and+Vaccine%22">HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine</a>. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4%2B+T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li>
<li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li>
<li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+Vacc-4x%2C+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination%2C+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+%28REDUC%29%3A+a+single-arm%2C+phase+1B%2F2A+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panobinostat%2C+a+histone+deacetylase+inhibitor%2C+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy%3A+a+phase+1%2F2%2C+single+group%2C+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li>
<li>Søgaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li>
<li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodomain+and+extra-terminal+%28BET%29+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+%28P-TEFb%29+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li>
<li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li>
<li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development%3A+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li>
<li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).</li>
<li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected%2C+resting+CD4%28%2B%29+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li>
<li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li>
<li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+in+isolated+patient+CD4%2BT+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation%2C+completion%2C+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li>
<li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li>
<li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36(2018).</li>
<li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency%3A+experimental+systems+and+molecular+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li>
<li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17(2014).</li>
<li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li>
<li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li>
<li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li>
<li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li>
<li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60(2011).</li>
<li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li>
<li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li>
<li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li>
<li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4%28%2B%29+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li>
<li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li>
<li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Dada la dificultad en la medición de la reactivación del virus ex vivo, una amplia gama de vitro se desarrollaron modelos sobre el tiempo para estudiar la latencia del VIH incluyendo latente infectados líneas de células T (J-Lats, ACH2, U1), modelos primarios de la infección latente de descanso) Modelos o ' Doherty, Lewin, Greene y espina) o pre-activado de células T CD4 + (Sahu, Marini, Planelles, Siliciano, modelos de Karn) sola ronda o replicación competente reportero virus22. Para modelar las ...

A pesar de terapia antirretroviral a largo plazo eficaz, el VIH persiste en estado latente como un provirus integrado en la memoria de las células T CD4 +1. La estructura de la cromatina de los VIH-1 5' promotor de repetición terminal larga (LTR) y modificaciones epigenéticas como la metilación de histonas y desacetilación de ADN metiltransferasas (DNMT) e histona deacetilasas (HDAC) son mecanismos importantes que conducen a represión transcripcional y post integración latencia2,3. Una gran variedad de agentes de inversión de latencia (LRAs) ha sido investigada por su eficacia inducir la producción de virus in vitro y en vivo de latente infectados descanso CD4 + T células4,5,6,7 ,8. Entre las LRAs probado, HDACi (inhibidores de la HDAC) y apuesta bromodominios inhibidores (BETis) inducen la decondensation de la cromatina y la liberación de la transcripción positivo alargamiento factor b (P-TEFb) respectivamente, dando lugar a posteriores aliviar de la transcripcional represión en el LTR 5' y la activación del VIH expresión9,10,11,12,13. Sin embargo, la magnitud de reactivación alcanzada por estos LRAs fue limitada como sólo un modesto aumento en células asociadas unspliced VIH mRNA (RNA), indicativo de la transcripción viral, observó ex vivo14,15. Importante, estos LRAs también no pudieron inducir una reducción en la frecuencia de las células infectadas latente.
Expresión de VIH puede ser más restringido por empalme ineficiente16 así como defectos en la exportación nuclear de multiplicar empalmado HIV RNA (RNA MS)17. Así, se necesitan identificables nuevas clases de LRAs que son más potentes y pueden afectar distintos aspectos de la integración después de la producción de virus. Además, se requiere el desarrollo de nuevos ensayos que ayudan a definir los compuestos óptimos para invertir eficientemente latencia.
Aquí, se presenta un protocolo, que utiliza un enfoque de alto rendimiento para la evaluación funcional del impacto de intervenciones basadas en LTR del VIH transcripción y splicing. En Resumen, un nuevo dual basada en LTR color reportero sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (figura 1) se utiliza para evaluar reactivación de VIH mediante citometría de flujo. En este reportero fluorescente, la expresión de mRNA de VIH unspliced (4 kb) conduce a la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), mientras que la expresión de mRNA empalmado (2 kb) daría lugar a la expresión de la proteína fluorescente Discosoma SP rojo (DsRed). Brevemente, hemos utilizado una proteína fluorescente de fusión Env-EGFP, gp140unc. EGFP, donde la secuencia de codificación de EGFP fue colocada en el marco de forma truncada y no hendida de la envoltura (Env). Cambios fueron introducidos para ablar del sitio de la hendidura evitando la disociación de la Env gp120 y gp41-EGFP y truncar la proteína gp160 antes el dominio de la transmembrana creando un análogo soluble de la Env, que facilita el plegamiento correcto y expresión de EGFP. A la expresión dentro de una célula, Rev se localiza en el núcleo donde interviene en la exportación nuclear-citoplásmico de la env de 4 kb mRNA mediante la interacción con el elemento de respuesta rev (RRE). El truncamiento de la Env no comprometiera RRE, que se encuentra entre gp120 y gp41 y el A7 3' sitio del empalme. En este sistema, que empalma en el VIH-1 empalme donante 4 (SD4) y el empalme aceptador 7 (SA7) resultados en la producción de 2 kb mRNA que codifican una proteína Rev no funcional truncada en el aminoácido 38 unida a proteína fluorescente DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed fue insertado en el exón 2nd de Rev en el aminoácido 38 por superposición extensión18. Para facilitar la exportación nuclear de mRNA unspliced, un vector de expresión mamífero codificación Rev (pCMV-RevNL4.3) fue co transfectado con el constructo de reportero fluorescente (figura 2). Esta construcción única reportera aquí descrita es útil en la evaluación de alto rendimiento de la transcripción del VIH y empalme, sin necesidad de usar vectores virales.

<table><tbody><tr><td><Cultivo > células fuertes</células ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T fuertes (células de riñón embrionario humano)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Replica vectores portadores de la región de replicación SV40.</td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4,5 g/L de D-glucosa + 110 mg/L de piruvato de sodio</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>Origen Australia</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Tinción azul de tripán, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reactivo de transfección lipídica</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) medio sérico reducido</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Medio libre de suero</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>PEGFP-N1 plásmido</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>Expresión de EGFP en células de mamíferos, promotor CMVIE.</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech (TaKaRa)</td><td>632429</td><td>Expresión de DsRed-Express en células de mamíferos, promotor CMVIE.</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>Stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11232</td><td>Stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Acetato de miristato de forbol (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>stock a 100 &mu; g/mL en DMSO; concentración de trabajo 10 nM</td></tr><tr><td>Fitohemaglutinina (PHA)</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>Stock a 1 &mu; g/&mu; L en PBS; concentración de trabajo 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Vorinostat (VOR)</td><td>Stock de 10009929 Químicos de las Islas Caimán</td><td></td><td>a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 0,5 &mu; </td></tr><tr><td>M Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td></td><td>P180500 stock a 10 mM en DMSO; concentración de trabajo 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>Kit de detección de micoplasma, basado en PCR</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>strong<>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Flow cytometry reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>Citómetro de flujo (4 láseres: azul, rojo, violeta y amarillo)</td>Citómetro de flujo LSR II BD Biosciences (3 láseres: azul, rojo y violeta)VIVO/MUERTO Muerto en infrarrojo cercano reparable <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kit de tinción celular</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>Colorante de viabilidad: para excitación de 633 o 635 nm, 400 ensayos. Los componentes A y B se proporcionan en el kit.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído 37/10 (37%)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS& T Research Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>Perlas de calibración</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow Calibration Particles (8 picos)</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3,0 - 3,4 mm</td></tr><tr><td>Solución de vaina</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 g de NaCl en 10 L</td></tr><tr><td>de agua HAZ-Tabs</td><td>Guest Medical</td><td>H8801</td><td>Pastillas de liberación de cloro para la desinfección</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N/A</td><td>Agentes de limpieza concentrados del citómetro de flujo. Solución de trabajo Decon 90 5%.</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sodio (solución al 12-13%)</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>Agentes de limpieza concentrados de citómetro de flujo. Solución de trabajo lejía 1%.</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>Agentes de limpieza concentrados de citómetro de flujo. Solución de trabajo 7x 1%.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos (75 cm2, cuello inclinado, tapa ventilada)</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos (fondo plano de 96 pocillos con tapa)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos (96 pocillos con fondo en V sin tapa)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (10 mL)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 mL)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Serológico Pipeta (25 mL), estéril</td><td>Corning</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica (10 mL), estéril</td><td>Corning</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica (5 mL), estéril</td><td>Corning</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos (50 mL), estéril</td><td>Corning</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con tapón de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>Estilo de 12 x 75 mm, malla</td></tr> de <tr><td>nailon</td> de 70 mm <td>SEFAR</td><td>03-100/32</td> Tubo de titulación de <td>100 mm</td></tr><tr><td>Microtubos de ensayo, a granel</td><td>BIO-RAD</td><td>2239391</td><td>tubos microfacs Tubo de</td></tr><tr><td>ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL, sin tapón</td><td>Tapones a presión Corning</td><td>352008</td><td>12x75 mm estilo</td></tr><tr><td>Snap para tubos de ensayo de 12x75 mm</td><td>Corning</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento, Neubauer mejorada de doble regla de red, línea brillante (Hemocitómetro, LO-Laboroptik)</td><td>ProSciTech</td><td>SVZ4NIOU</td><td>3x3 cuadrados grandes de 1 mm2; Profundidad 0,100 mm; volumen 0,1 mL; superficie mínima 0,0025 mm2</td></tr><tr><td>cubreobjetos (Menzel-Gl&auml; Grale</td> <td>Scientific</td><td>HCS2026</td><td>Microscopio de 20 x 26 mm</td></tr><tr><td></td><td>Nikon TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5811000487 con rotor A-4-81 incluyendo adaptadores para tubos cónicos de 15/50 mL</td></tr><tr><td>Lector de microplacas FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>Lector de placas para ensayo de proliferación celular. Filtro 490 nm.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Programa de adquisición y análisis de datos de citómetros de flujo, versión 8.0.1</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>Programa de análisis de datos del citómetro de flujo, FlowJo Engine v3.05481</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>FLUOstar control de lector multiusuario, versión 5.11</td></tr><tr><td>Omega - Análisis de datos</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><<td>em>FLUOstar análisis de datos, versión 3.20R2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td>Microsoft Excel:mac 2011</td><td>versión 14.0.0</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad</td><td>Prisma 7</td><td>versión 7.0c</td></tr></tbody></table>

alto rendimiento en la evaluación de vitro de latencia inversión a en vih transcripción y splicing

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

VIH sigue siendo incurable debido a la existencia de un reservorio de células que alberga de forma estable y latente del virus, que permanece invisible al sistema inmune y no está dirigido por la actual terapia antirretroviral (carro). Transcripción y splicing han demostrado reforzar la latencia del VIH-1 en la reclinación de las células T CD4 +. Revocación de la latencia por el uso de agentes de reversión de latencia (LRAs) en el enfoque de "choque y muerte" se ha estudiado extensivamente en un intento de purgar este embalse pero hasta ahora no ha mostrado éxito en ensayos clínicos debido a la falta de desarrollo de pequeños adecuada moléculas que eficientemente pueden perturbar este embalse. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente evaluación de agentes de reversión de latencia (LRAs) sobre la transcripción del VIH y empalme. Este enfoque se basa en el uso de un reportero de color dual basada en litros que puede medir simultáneamente el efecto de un LRA en transcripción y splicing mediante citometría de flujo. El protocolo descrito aquí es adecuado para células adherentes, así como las células en suspensión. Es útil para probar un gran número de medicamentos en un sistema de alto rendimiento. El método es técnicamente rentable y fácil de implementar. Además, el uso de citometría de flujo permite la evaluación de la viabilidad celular y así la toxicidad de la droga al mismo tiempo.

Resultados representativos se muestran en la figura 5 para la expresión del VIH-1 unspliced (EGFP) y empalma (DsRed) productos después del tratamiento con el inhibidor de bromodominios JQ1. JQ1(+) y Tat aumentaron significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP (FC 2.18 y 4,13 sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de unspliced transcripciones. Por otra parte, JQ1(+) aumentó significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed (...

Un protocolo de alto rendimiento para la evaluación funcional de reactivación eficaz del VIH y la separación de provirus latentes es descrito y aplicado por el impacto de las intervenciones sobre la transcripción del VIH la prueba y empalme. Se proporcionan resultados representativos del efecto de latencia inversión a agentes sobre la transcripción basada en litros y empalme.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar in vitro, el impacto de los agentes que revierten la latencia en el procesamiento del ARNm del VIH. El protocolo proporciona un método simple y fiable para evaluar, simultáneamente el efecto del LRA en la transcripción y el empalme del VIH. Esta técnica proporcionó una idea de la capacidad de los LDA para inducir la reactivación del virus y el aclaramiento del reservorio latente.Después de cultivar las células, colocar 20.000 de ellas en 100 microlitros de DMEM medio, complementado con 10%FBS, y sin antibióticos en los pozos de una placa inferior plana de 96 pozos durante 24 horas. Al día siguiente diluir la construcción del reportero de doble color. ADN de Tat y Rev en 50 microlitros de medio libre de suero, y mezclar suavemente.Mezclar suavemente el reactivo lipídico y luego diluir 0,65 microlitros del que se filtra por reacción en 50 microlitros de medio libre de suero. Mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Combine el reactivo lipídico diluido con el ADN diluido y mezcle suavemente.Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, dispensar 100 microlitros de este complejo de ADN de reactivo de lípidos gota sabia, en la parte superior de las células en cada pozo. Mece suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para mezclar.E incubar la placa en una incubadora humidificada, a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de esto, transfectar pozos adicionales con 100 nanogramos de EGFP impulsado por CMV y plásmido de ADN exprés DsRed para fines de compensación. Para comenzar, diluya cada agente de inversión de latencia a la condición de trabajo adecuada con el medio de crecimiento.Con un cabezal de tubería multicanal, aspire cuidadosamente el medio de transfección y sustitúyalo por 100 microlitros de medio que contengan el agente de inversión de latencia adecuado. Incubar en una incubadora humidificada a 37% celsius con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Para comenzar a tinr las células, utilice un cabezal de tubería multicanal para agregar 100 microlitros de PBS a cada pozo.Suavemente la cabeza de la tubería hacia arriba y hacia abajo aproximadamente cinco veces. Mientras se asegura de evitar la espuma para separar las células en los medios. A continuación, transfiera las células a los pozos de una placa inferior en V de 96 pozos.Centrifugar a 500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar el medio y el PBS sin tocar las células. Lavar las células al menos una vez con 200 microlitros de proteínas y PBS libres de suero.Centrifugar a 500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Incline la placa para desechar el sobrenadante y retire el tampón de lavado sin tocar las células. Después de esto diluir el tinte de viabilidad fija en PBS libre de proteínas y suero en una proporción de 1 a 1000, para preparar una solución de trabajo.Agregue 50 microlitros del tinte diluido a cada pozo, y la cabeza de la tubería hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar a cuatro grados centígrados. Mientras esté protegido de la luz usando papel de aluminio durante 10 a 15 minutos.Luego lave las células una o dos veces con 150 microlitros de tampón de lavado. Después de esto, centrifugar a 500 veces la gravedad, y cuatro grados celsius durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Para fijar las células, agregue 100 microlitros de 1% de formaldehído recién preparado y tampón de lavado.E incubar a cuatro grados centígrados mientras está protegido de la luz durante 10 a 15 minutos. Después de esto, lave las células una o dos veces con 100 microlitros de tampón de lavado. Centrifugar a 500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en 70 microlitros de tampón de lavado. Después de comprobar el rendimiento y la sensibilidad de los ajustes del citómetro mediante la ejecución de perlas de calibración, ajuste los voltajes de dispersión hacia delante y lateral con la muestra no manchada, de modo que la población principal esté en pantalla y claramente discernible. Realice una compensación manual o automática utilizando las muestras de una sola mancha, asegurando un derrame mínimo sobre la población positiva de EGFP en el detector DsRed y viceversa.Usando la fluorescencia menos uno controles, cree trazados y establezca las puertas. A continuación, ajuste los voltajes de dispersión hacia adelante y hacia el lado con la muestra no mantenida, de modo que la población principal esté en pantalla y claramente discernible. Adquiera y registre un mínimo de 10.000 eventos celulares viables por muestra.Después de esto, utilice el software de análisis de datos de citometría de flujo para analizar los datos como se describe en el protocolo de texto. Los resultados representativos de la expresión del VIH-1, los productos sin empalme y empalmados, después del tratamiento con el inhibidor del bromodomain JQ1, muestran que tanto JQ1 positivo como Tat, aumentan significativamente el porcentaje de células que expresan EGFP. Lo cual es indicativo de transcripciones sin empalmar.JQ1 positivo también se considera que aumenta significativamente el porcentaje de células que expresan DsRed. Y aumentar la proporción de producto empalmado a niveles similares como Tat. Esto confirma la capacidad de JQ1 positivo para activar la transcripción y el empalme del VIH.Sin embargo, el tratamiento con un control estereoisómero JQ1 negativo, abolió el efecto positivo JQ1 en la transcripción y el empalme del VIH. Una vez masterado, este método se puede llevar a cabo utilizando drogas individualmente o en combinación. Pruebas para su capacidad de sinergizar eficientemente.Lo que llevaría a una dosis más baja de la droga y toxicidad. Después de cada desarrollo, esta técnica allanó el camino para probar combinaciones de fármacos eficientes en modelos primarios de latencia en muestras de pacientes ex vivos.

high-throughput-vitro-assessment-latency-reversing-agents-on-hiv

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Uncoating es un paso esencial en la fase temprana del ciclo de vida del VIH-1 y se define como el desmontaje de la cápside y la liberación de los complejos de ribonucleoproteína viral (vRNP). En este sentido, demostrar las técnicas para el aislamiento de los núcleos intactos del VIH-1 viriones y cuantificar sus...

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Aquí se describe la citotoxicidad celular y ensayos de infectividad redondas individuales que permiten la detección rápida y precisa de los compuestos para determinar su citotoxicidad celular (CC 50) y los valores de IC50 contra WT y VIH-1 resistente drogas.

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

La patogénesis del VIH-1 se define tanto por las características virales como por los factores genéticos del huésped. Aquí describimos un método robusto que permite mediciones reproducibles para evaluar el impacto de la variación de la secuencia del gen gag en la capacidad de replicación in vitro del virus.

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

Describimos un protocolo para amplificar los sitios de integración retroviral a partir del ADN genómico de las células infectadas, secuenciar las uniones virus-huésped amplificadas y luego mapear estas secuencias a un genoma de referencia. También describimos técnicas para cuantificar la distribución de los sitios de integración en relación con diversas anotaciones genómicas utilizando BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Se describen los métodos para evaluar la eficacia y toxicidad de las moléculas de ARN dirigidas a las etapas posteriores a la integración del ciclo de replicación del VIH-1. Estos métodos son útiles para el cribado de nuevas moléculas y la optimización del formato de las existentes.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Este informe describe un ensayo in vitro para medir la actividad de integración asociada al complejo de preintegración (PIC) del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en los extractos citoplasmáticos de células infectadas agudamente. La integración del ADN del VIH-1 asociado a PIC en el ADN diana heterólogo se cuantifica mediante el uso de una estrategia de reacción en cadena de la polimerasa anidada en tiempo real.

Medida de In Vitro Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

Se describe un ensayo basado en células para reportar VIH-1 la fusión a través de la expresión de la proteína verde fluorescente detectable por microscopía de flujo cytometry o fluorescencia. Puede ser utilizado para probar los inhibidores de entrada viral (específicamente en la etapa de fusión) en sistemas libres de células y células a la infección.

Un alto rendimiento Cre-Lox activado análisis de fusión de la membrana Viral para identificar inhibidores de la fusión de la membrana Viral VIH-1

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Aquí presentamos un enfoque de secuenciación profunda que proporciona una determinación imparcial de naciente 3'-termini, así como perfiles mutacionales de moléculas de ADN monocatenario. La principal aplicación es la caracterización de los nacientes DNAs complementarios retrovirales (cADN), los intermedios generados durante el proceso de transcripción inversa retroviral.

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Aquí, describimos algunos métodos establecidos para determinar el estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la respuesta proteica desplegada (UPR), con especial énfasis en la infección por VIH-1. Este artículo también describe un conjunto de protocolos para investigar el efecto del estrés del RE/UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión.

Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

Aprende a evaluar agentes reactivadores de latencia en VIH mediante un protocolo de alto rendimiento que analiza transcripción y splicing del ARN mensajero viral. Este método permite estudiar la reactivación del virus y el aclaramiento de reservorios latentes.

Alto rendimiento en la evaluación de Vitro de latencia inversión a en VIH transcripción y Splicing

Explorar más videos