Name: Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprende a evaluar la virulencia y patogenicidad de Aeromonas usando Caenorhabditis elegans como modelo. Este método permite comparar niveles de toxicidad entre especies bacterianas y comprender mejor las interacciones huésped-patógeno.

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Estamos muy agradecidos por la ayuda de la instalación de base de C. elegans en Taiwán y en la microbiología de diagnóstico y aísla los antimicrobianos resistencia laboratorio de nacional Cheng Kung University Hospital para proporcionar la Aeromonas . También reconocemos el centro de genética de Caenorhabditis (CGC) y la WormBase. También agradecemos a Savana Moore para editar el manuscrito.
Este estudio fue parcialmente financiado por becas del Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán (más 105-2628-B-006-017-MY3) y el Hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKUH-10705001) a P.L. Chen.

1. preparación de medio de cultivo
Nota: Ver tabla 1 para la preparación de la solución.
<ol><li>Para preparar el medio M912, disolver 1.5 g de KH2PO4, 5,66 g de Na2HPO4y 2.5 g de NaCl en 500 mL de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 min esperar hasta que haya enfriado a temperatura ambiente y añadir 0,5 mL de 1 M MgSO4 antes del primer uso.</li>
	<li>Para preparar el crecimiento de nematodos medio (NGM)12, disolver 3 g de NaCl, 2.5 g peptona bacteriana y agar 20 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 min esperar hasta que se enfríe a 55 ° C en un baño de agua y luego añadir 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de colesterol 5% en etanol y 25 mL de tampón fosfato. Agite para mezclar bien.</li>
	<li>Vierta unos 5 mL de NGM en cada plato de Petri de 6 cm. Evitar la producción de burbujas en la superficie de la placa. Dejar las placas a temperatura ambiente durante 1 noche y paquete para guardar a 4 ° C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Para preparar enriquecido NGM (ENGM), disolver 3 g de NaCl, peptona bacteriana 5 g, 1 g extracto de levadura y agar de 30 g en 1 L de agua desionizada. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos a esperar hasta que se enfríe a 55 ° C en un baño de agua y agregar 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de colesterol 5% en etanol y 25 mL de tampón fosfato. Agite para mezclar bien.</li>
	<li>Vierta aproximadamente 10 mL ENGM en cada plato de Petri de 9 cm. Evitar la producción de burbujas en la superficie de la placa. Dejar las placas a temperatura ambiente durante 1 noche y paquete para guardar a 4 ° C. Llevar a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Para preparar medio S12, mezcla de citrato de potasio de 40 mL S Basal, 0,4 mL de 1 M, rastro de 0,4 mL metales solución 0,12 mL de 1 M CaCl2, 0,12 mL de 1 M MgSO4, 40 μl de colesterol 5% en etanol y 1 mL de 8 mM FudR antes de usar.</li>
</ol>2. sincronización de C. elegans6,9,12
<ol><li>Lave unos 2.000 lombrices en la etapa adulta grávida con 10 mL de agua desionizada estéril en un tubo de 15 mL. Lavar las bacterias 3 x mantener los gusanos en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Centrifugar la muestra durante 1 minuto a 500 x g para tirar abajo los gusanos. Quite el sobrenadante y mantener los gusanos en 3,5 mL de agua desionizada.</li>
	<li>Añadir 1 mL de NaOCl (10 – 15%) y 0.5 mL 5 M de KOH en el tubo. Mezcla uniformemente agitando para < 6 min a lyse los cuerpos del gusano.</li>
	<li>Después se liberan los huevos de los gusanos, agregar 10 mL de agua desionizada para evitar la lisis. Centrifugar por 1 min a 1.200 x g tire hacia abajo de los huevos y retirar el sobrenadante tanto como sea posible. Lavar con 15 mL M9 media por lo menos 3 x. Nota: Véase el paso 1.1 para la composición del medio M9.</li>
	<li>Mantener los huevos en medio M9 de 1 mL. Transporte de huevos en un plato de 3,5 cm para la incubación a 20 ° C por una noche (de 12 a 18 h). Nota: Después de la incubación, los huevos eclosionan para gusano de la larva que se llama como la primera etapa de la larva (L1).</li>
	<li>Pipetear a 10 μl de gusanos L1 en medio M9. Contar el número de gusanos y calcular que la concentración de L1 gusanos en medio M9.</li>
	<li>Semilla a más de 10.000 incubaron gusanos de fase L1 con una pipeta en una placa de 9 cm ENGM con Escherichia coli OP50.<ol>
<li>En este paso, propagación 0,5 mL cultivados durante la noche OP50 de e. coli con caldo de Luria-Bertani (LB) en la placa de 9 cm ENGM. Incubar la placa a 37 ° C durante 16-18 h. Nota: Para evitar la contaminación, el paso que se separa debe realizarse en una campana de flujo laminar.</li>
		<li>Enfriar a temperatura ambiente antes de sembrar lombrices de L1. Semilla a más de 10.000 incubaron gusanos de fase L1 de la placa de la ENGM con e. coli OP50.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar los gusanos a 20 ° C durante 44 h o hasta que crecen a la etapa de larva (L4) 4 demayo . Nota: Consulte el paso 1.3 para la composición del medio ENGM. Un gusano tiene un punto blanco en forma de media luna en la mitad del lado del cuerpo en la etapa de L4.</li>
	<li>Utilice el L4 sincronizado escenario gusanos en los siguientes ensayos. En el ensayo de supervivencia de C. elegans con Aeromonas dhakensis y el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas dhakensisgusanos uso salvaje tipo N2. Usar gusanos de RW1596 (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) en el ensayo de necrosis de músculo de C. elegans con Aeromonas dhakensis.</li>
</ol>3. Análisis de supervivencia de C. elegans con Aeromonas6,9
<ol><li>En el día de la siembra de lombrices de la L1 en la ENGM separarse con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o e. coli OP50 cultura con 2 mL de caldo de libras respectivamente, a 37 ° C por 16 h. Nota: Para evitar la contaminación, este paso debe realizarse en una campana de flujo laminar. Aquí, se utilizaron las siguientes cepas bacterianas: Escherichia coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Medir la absorbancia de600 OD de caldo bacteriano y ajustar el caldo bacteriano OD600 = 2.0 con caldo LB.</li>
	<li>Punto y extensión 30 μl de caldo bacteriano de cada placa NGM de 6 cm. La cultura las placas a temperatura ambiente durante la noche. Nota: Consulte el paso 1.2 para la composición del medio NGM.</li>
	<li>En el día que los gusanos L1 crecen hasta la etapa de L4, aleatoriamente escoger y transferir 50 gusanos en una placa de NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o e. coli OP50.</li>
	<li>Incubar las placas NGM a 20 ° C hasta que termine el ensayo.</li>
	<li>Transferir todos los gusanos de vida a una placa NGM recién preparada con bacterias y cuenta los números de viven, muerta, y sensor gusanos todos los días hasta el último gusano está muerto. Nota: Transferencia de gusanos a una placa NGM preparado fresco todos los días para el mantenimiento de la infección, aunque utilizando gusanos estériles (p. ej.glp-4, o con FudR).</li>
	<li>Trazar las curvas de supervivencia basadas en el cálculo de datos diario.</li>
</ol>4. ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas7
Nota: Para evitar la contaminación, pasos deben realizarse en una campana de flujo laminar.
<ol><li>El día después de la siembra de las lombrices de la L1 en la placa de la ENGM con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y e. coli OP50, cultura con 5 mL de LB caldo cada a 37 ° C por 16 h. Nota: En el protocolo, se utilizaron las siguientes cepas de bacterias: e. coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Medir la absorbancia de600 OD del caldo de las bacterias.</li>
	<li>Centrifugar el caldo bacteriano a 3.500 x g durante 15 min quitar el caldo LB. Resuspender las bacterias y ajustar el caldo bacteriano OD600 = 3.0 con medio S. Añadir 195 μl de caldo bacteriano en medio S a por lo menos 8 pocillos de una placa de 96 pocillos. Nota: Consulte el paso 1.6 para la composición del medio de S.</li>
	<li>Lave los gusanos L4 en la placa ENGM con e. coli OP5 con medio M9. Ajustar la solución de gusano a una concentración de 5 gusanos por μl y añadir 5 μl de la solución de gusano a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que hay aproximadamente 25 lombrices por pozo.</li>
	<li>Incubar la placa de 96 pocillos en un agitador a 200 rpm a 25 ° C.</li>
	<li>Contar el número de gusanos vivos y gusanos muertos después de 24, 48 y 72 h. calculan las tasas de supervivencia de cada pocillo con la siguiente fórmula: (Total gusanos vivos gusanos) × 100%.</li>
	<li>Dibujar un gráfico de diagrama de dispersión con el cálculo diario de datos.</li>
</ol>5. ensayo de Necrosis de músculo de C. elegans con Aeromonas6
Nota: Para evitar la contaminación, estos pasos deben realizarse en campana de flujo laminar.
<ol><li>En el día que los gusanos L1 se siembran en la ENGM extendido con e. coli OP50, escoge una sola Colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y e. coli OP50 cultura con 2 mL LB caldo cada a 37 ° C por 16 h. Nota: Aquí, se utilizaron las siguientes cepas de bacterias: e. coli OP50, la alimentación normal de C. elegans. Dhakensis a. AAK1, el primer completamente secuenciado patógenos clínicos dhakensis a. aislar. A. hydrophila A2-066, A2-007 a. veronii y a. caviae A2-9307121 son aislados clínicos representativo del National Cheng Kung University Hospital.</li>
	<li>Medir la absorbancia de600 OD del caldo de bacterias y ajustar el caldo de las bacterias a OD600 = 2.0 con caldo LB. Punto y 30 μl de caldo bacteriano en las placas de NGM de 6 cm de extensión. La cultura las placas a temperatura ambiente durante la noche.</li>
	<li>En el día los gusanos L1 crecen hasta la etapa de L4, transferencia 50 gusanos en cada placa de NGM con cada una de las cuatro cepas de Aeromonas o OP50 de e. coli . Incubar las placas NGM a 20 ° C. Transferencia de gusanos cada 24 h para placas NGM recién preparadas con bacterias.</li>
	<li>Tomar imágenes músculo utilizando un microscopio de fluorescencia.<ol>
<li>Seleccionar al azar 10 gusanos en un gel de agarosa al 2% en medio M9 en un portaobjetos. Paraliza los gusanos con 2 μl de azida de sodio al 1% en medio M9 en agarosa para menos de 5 minutos antes de tomar imágenes.</li>
		<li>Coloque un cubreobjetos y capturar las imágenes de músculo con un verde filtro de proteínas fluorescentes (GFP) en un microscopio de fluorescencia con cámara de dispositivo de carga acoplada. Capturar las imágenes de músculo a las 24, 48 y 72 h post la etapa L4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar análisis y figura la preparación de imagen con un software de procesamiento de imágenes. Nota: Las definiciones de las puntuaciones y los niveles de daño muscular se muestran en la figura 3, para que los criterios son las siguientes: 3 puntos por falta de las fibras musculares; 2 puntos para las fibras de músculo rotas o quebradas; 1 punto para el doblado de las fibras musculares; 0 puntos para las fibras de músculo sanas.</li>
</ol>6. estadísticos análisis
<ol><li>Realizar todos los experimentos un mínimo de tres veces de forma independiente.</li>
	<li>Utilice el método de Kaplan-Meier para evaluar los ensayos de supervivencia de C. elegans y usar el test de log-rank en el análisis de las diferencias de supervivencia. Establecer significancia estadística al 0.05.</li>
	<li>Utilizar la prueba t de Student para analizar los resultados estadísticos de los ensayos de toxicidad líquida de C. elegans a los dos grupos diferentes. Utilice la prueba ANOVA unidireccional en el análisis de las diferencias entre tres o más valores de una variable independiente. Establecer significancia estadística al 0.05.</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+soft-tissue+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).</li>
<li>Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tract+infections+caused+by+Aeromonas+species%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Biliary tract infections caused by Aeromonas species.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).</li>
<li>Chuang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+clinical+characteristics+among+Aeromonas+hydrophila%2C+Aeromonas+veronii+biovar+sobria+and+Aeromonas+caviae+monomicrobial+bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Korean+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia.</a> Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).</li>
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<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Disease+Model+of+Muscle+necrosis+caused+by+Aeromonas+dhakensis+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 2058(2016).</li>
<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
<li>Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+infection+models+in+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29+to+study+the+pathogenesis+of+Aeromonas+hydrophila%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1219(2016).</li>
<li>Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIOK-1+Is+a+Suppressor+of+the+p38+MAPK+Innate+Immune+Pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Frontiers in Immunology. 9, 774(2018).</li>
<li>Powell, J. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+Caenorhabditis+elegans+infection+by+bacterial+and+fungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens.</a> Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).</li>
<li>Chou, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157%3AH7+Shiga-like+toxin+1+is+required+for+full+pathogenicity+and+activation+of+the+p38+mitogen-activated+protein+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Engelmann, I., Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in C. elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).</li>
<li>Feinbaum, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Pseudomonas+aeruginosa+virulence-related+genes+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

C. elegans es un nematodo de bacterivorous que naturalmente las bacterias de las tomas como alimento y ha desarrollado una inmunidad innata complicado a las bacterias durante su proceso evolutivo. Dos de los principales órganos mantener y apoyar la inmunidad son la epidermis y el intestino9,13. La epidermis y bandas de músculo de C. elegans se asemejan a las estructuras de tejido blando en los mamíferos y los seres humanos6</su...

El patógeno humano, Aeromonas, se ha demostrado clínicamente para causar gastroenteritis, infecciones de heridas, septicemia y las infecciones de vías urinarias1,2. Más enfermedades humanas asociadas se han divulgado para ser asociado a cuatro especies bacterianas: Aeromonas caviae , Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophilay Aeromonas veronii 2,3 , 4 , 5. entre las enfermedades infecciosas Aeromonas , infecciones de tejidos blandos pueden causar morbilidad grave y mortalidad en los seres humanos. De nota, la necrosis del músculo es la forma más severa de infección de tejidos blandos6. Observación de la supervivencia y la necrosis del músculo de elegans de Caenorhabditis después de la infección es un método conveniente especular la toxicidad de Aeromonas.
Los científicos ya han desarrollado numerosos organismos modelo para estudiar las infecciones bacterianas. En estudios previos, ratones, zebrafishes y nemátodos se utilizaron como modelos animales para estudiar la patogénesis y virulencia de Aeromonas6,7,8. Cada animal tiene su ' ventajas y aplicaciones. El organismo modelo Caenorhabditis elegans, es un nematodo de bacterivorous que las bacterias de las tomas como foodnaturally. C. elegansha desarrollado un complicado sistema inmune innato contra la infección bacteriana en el transcurso de su evolución. Bajo el estrés de una infección bacteriana, C. elegans ha demostrado para ser un modelo de infección excelente para el estudio de la patogenia bacteriana de Aeromonas6,7,9 y otros patógenos como hongo10 y enterohemorrágica Escherichia coli O157: H711. Sin embargo, todavía hay ninguna publicación que se centra en la metodología en el uso de C. elegans como modelo para el estudio de la virulencia de Aeromonas.
Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas con C. elegans como modelo animal: Análisis de supervivencia, líquida toxicidad y necrosis muscular. Estos métodos son una manera conveniente para evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y mejorar la comprensión de la patogenesia de Aeromonas.

<table><tbody><tr><td>Incubadora agitadora</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>Incubación de bacterias</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021519455</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05 Preparación del</td><td>medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>SIGMA</td><td>M7506</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>agar</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>colesterol</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>etanol</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 6 cm</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>preparación de la placa de agar</td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>ensayo líquido</td></tr><tr><td>peptona bacteriana</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>ácido cítrico y toro; H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>citrato tripotásico y toro; H2O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>FudR&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA disódico</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td></td><td>215422 Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4 H2O</td><td>SIGMA</td><td></td><td>221279 Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td></td><td>204986 Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>triptona</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>Preparación del medio de cultivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de microscopio</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipasa Ti invertida&nbsp;</td><td>Imágenes de microscopio</td></tr><tr><td>Cámara CCD científica</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>Retiga-2000R Rápido 1394&nbsp;</td><td>Imágenes de microscopio</td></tr></tbody></table>

evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por aeromonas en un modelo elegans de caenorhabditis

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

El patógeno humano Aeromonas se ha demostrado clínicamente para causar gastroenteritis, infecciones de heridas, septicemia y las infecciones del tracto urinario. Enfermedades más humanas se han divulgado para ser asociado de cuatro especies de bacterias: Aeromonas caviae, Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophilay Aeromonas veronii. El organismo modelo Caenorhabditis elegans es un bacterivore que proporciona un modelo de infección excelente por que estudiar la patogénesis bacteriana de Aeromonas. Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas utilizando un modelo de C. elegans , incluyendo supervivencia, toxicidad líquida y ensayos de necrosis muscular. Los resultados de los tres métodos de determinación de la virulencia de Aeromonas eran constantes. A. dhakensis fue demostrado para ser el más tóxico entre las 4 principales especies de Aeromonas causando infecciones clínicas. Estos métodos aparecen para ser una forma conveniente para evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y contribuir a la comprensión de la patogenia de la infección por Aeromonas .

Siguiendo los protocolos descritos anteriormente, es fácil diferenciar la toxicidad de las cuatro cepas de Aeromonas . El ensayo de supervivencia de C. elegans se muestra en la figura 1. Las tasas de supervivencia de C. elegans infectados con especies de Aeromonas , se muestra en la orden de alta a la baja fueron: a. caviae, a. veronii y a. hydrophila y a. dhakensis. Aunque existe diversidad en cuanto a la...

Aquí, presentamos tres diferentes experimentos para estudiar la infección por Aeromonas en C. elegans. Usando estos métodos convenientes, es fácil evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas .

Evaluación de la virulencia y patogenia de la infección por Aeromonas en un modelo elegans de Caenorhabditis

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción huésped-patógeno, como la patogenicidad y la virulencia de la infección bacteriana. La principal ventaja de esta técnica es que podemos evaluar la toxicidad entre y dentro de las especies de Aeromonas y contribuir a nuestra comprensión de la patogénesis de la infección de Aeromonas. Para comenzar a lavar aproximadamente 2.000 gusanos adultos gravid con agua estéril desionizada.Repita el lavado tres veces manteniendo los gusanos en la parte inferior del tubo. Después de centrifugar los gusanos quitar el sobrenadante y mantener los gusanos en 3.5 mililitros de agua desionizada. Añadir un mililitro de hipoclorito de sodio y 0,5 mililitros de hidróxido de potasio al tubo.A continuación, agitar el tubo durante seis minutos para anlicer los cuerpos del gusano. Después de que se liberen los huevos, agregue 10 mililitros de agua desionizada para detener la lelisis. A continuación, centrifugar el tubo para tirar hacia abajo de los huevos y eliminar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible.Lavar los huevos con 15 mililitros de M9 mediano al menos tres veces. Transfiera los huevos a un plato de 3,5 centímetros e i incubarlos a 20 grados centígrados durante una noche. Después de esto retire 10 microlitros de gusanos L1 y medio M9 de la placa.Contar los gusanos y obtener la concentración de gusanos L1 en el medio M9. Con una pipeta, tome 0,5 mililitros de caldo E.coli OP50 LB y extiéndalo en una placa ENGM. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius durante 16 a 18 horas.Enfríe el ENGM a temperatura ambiente. A continuación, la semilla incuba gusanos L1 en una placa ENGM con E.coli OP50. Incubar los gusanos a 20 grados centígrados hasta que lleguen a la etapa L4.En primer lugar, seleccione una sola colonia de cada una de las cuatro cepas de Aeromonas y escúlelas de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, mida la absorbancia OD 600 del caldo bacteriano y ajústelo hasta que la absorbancia sea igual a 2.0. Siguiente punto y esparcir 30 microlitros de caldo bacteriano de cada cepa en placas NGM.Seleccione y transfiera aleatoriamente los gusanos L4 previamente preparados a las placas NGM con las cepas Aeromonas. Luego incubar las placas a 20 grados centígrados hasta que el ensayo esté completo. Todos los días transfieren todos los gusanos vivos a una nueva placa NGM con bacterias.Cuenta el número de gusanos vivos, muertos y sensores todos los días hasta que el último gusano esté muerto. Después de cultivar las cepas de Aeromonas y medir su absorbancia como se describió anteriormente, centrifugar el caldo bacteriano a 3.500 g durante 15 minutos. Ajuste el caldo bacteriano con S Medium.Y añadir 195 microlitros de caldo bacteriano en el medio S a ocho pozos de una placa de 96 pozos. Lavar los gusanos de la placa ENGM con ellos M9 medio. A continuación, ajuste la concentración de la solución de gusano a cinco gusanos por microlitro.Agregue cinco microlitros de la solución de gusano a cada uno de los pozos de la placa de 96 pozos. Incubar el plato en una coctelera, y contar el número de gusanos vivos a las 24, 48 y 72 horas. Después de cultivar las cepas de Aeromonas y ajustar la absorbancia de acuerdo con el punto del protocolo de texto y esparcir el caldo bacteriano en las placas NGM.Después de esto, transfiera 50 gusanos L4 a cada placa NGM. Cada 24 horas transfiere los gusanos a placas NGM frescas. Seleccione aleatoriamente 10 gusanos y transfiéralos a un gel de 2% de agarosa en un medio M9 en una diapositiva.Finalmente coloque un cubreobjetos en el gel y capture imágenes musculares con un filtro de proteína fluorescente verde en un microscopio fluorescente equipado con una cámara. En este protocolo se evaluaron las toxicidades de cuatro cepas de Aeromonas. La tasa de supervivencia de C.elegans infectados con especies de Aeromonas fue más alta en ensayos usando A.caviae, y más baja en ensayos usando A.dhakensis.En un ensayo de toxicidad líquida la supervivencia de C.elegans disminuyó significativamente cuando se infectó con A.dhakensis o A.hidrofilia. En el ensayo de necrosis muscular los grados de daño muscular variaron entre las especies de Aeromonas. A.caviae causó el menor daño muscular, mientras que A.dhakensis produjo la mayor cantidad de daño muscular.Los métodos descritos en este video ofrecen una manera conveniente de diferenciar la diversidad de la virulencia entre y dentro de las especies de Aeromonas. Además, también es un modelo fiable para estudiar la interacción entre un patógeno y el huésped.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Anderson, Q. L., et al. Un patosistema de C. elegans de alto rendimiento, alto contenido y base líquida. J. Vis. Exp. (2018)El video demuestra un ensayo a base de líquido donde las larvas de C. elegans modificadas genéticamente se exponen a bacterias patógenas en una microplaca. Las toxinas bacterianas secretadas en el medio inducen el estrés y la muerte del huésped. Un tinte fluorescente tiñe los gusanos muertos, lo que permite la cuantificación de la mortalidad basada en imágenes para...

Evaluación de la mortalidad inducida por bacterias patógenas en larvas de C. elegans

Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo muestra un ensayo de supervivencia utilizando C. elegans para modelar la patogénesis de Aeromonas , donde la ingestión oral de la bacteria provoca infección intestinal y mortalidad, permitiendo una evaluación cuantitativa de la virulencia bacteriana en un sistema huésped vivo.

Modelado de la patogénesis de Aeromonas en C. elegans mediante un ensayo de supervivencia

Fuente: Chen, Y., et al. Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo muestra el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans con Aeromonas, un método utilizado para evaluar la virulencia bacteriana midiendo la supervivencia de gusanos en un entorno líquido con pocos nutrientes. El ensayo revela patogenicidad específica de la cepa basada en la extensión del daño y mortalidad inducidos por toxinas en C.

Evaluación de la virulencia bacteriana utilizando el ensayo de toxicidad líquida de C. elegans

Fuente: Chen, Y. et al., Evaluación de la virulencia y patogénesis de la infección por Aeromonas en un modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo muestra un ensayo de necrosis muscular en C. elegans (Caenorhabditis elegans) utilizando cepas patógenas de Aeromonas . Al alimentar con gusanos que expresan proteína fluorescente verde (GFP) en placas con semillas de Aeromonas, el ensayo modela la infección bacteriana y revela daños tisulares mediante imágenes de fluorescencia.

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Aprende a evaluar la virulencia y patogenicidad de Aeromonas usando Caenorhabditis elegans como modelo. Este método permite comparar niveles de toxicidad entre especies bacterianas y comprender mejor las interacciones huésped-patógeno.

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