La multiplexación enfocada ultrasonido estimulación con microscopía de fluorescencia

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la mecanobiología, como cómo las muestras biológicas responden a las fuerzas mecánicas producidas por la estimulación por ultrasonido de baja intensidad. La principal ventaja de esta técnica es que permite a un experimentalista aplicar de forma no invasiva fuerzas mecánicas a una muestra y medir varios perímetros biológicos en tiempo real. Para comenzar, taladre lentamente un agujero de 12 milímetros en la parte inferior de un plato de cultivo estándar de 35 milímetros usando un taladro de prensa vertical.

Una vez perforado, retire los trozos de plástico unidos a la parte inferior del plato usando una cuchilla, para crear una superficie lisa en el lado externo. A continuación, aplique una fina capa de epoxi o pegamento de grado marino en la superficie inferior externa del plato. En la parte superior del adhesivo, coloque una película de poliéster de dos puntos y cinco micras de espesor, presionando firmemente para asegurarse de que el adhesivo se extiende uniformemente entre la película y la superficie de plástico gruesa.

Tire suavemente de la película de una manera centrífuga con los dedos, para crear una superficie plana. Una vez que el adhesivo se haya secado, enjuague brevemente el plato inferior de poliéster con 95% de etanol. Luego, UV esterilizar el plato colocándolo bajo una fuerte fuente de excitación UV de 254 nanómetros.

Ajuste la duración y la intensidad para administrar una dosis UV de aproximadamente 330 miljoules por centímetro cuadrado. A continuación, diluir una mezcla de proteína de matriz extracelular disponible comercialmente con el medio de cultivo deseado en una proporción de uno a 100. Trabaje en hielo para prevenir la polimerización de la matriz y aplique rápidamente 100 microlitros de la mezcla media sobre la película de poliéster.

Vuelva a colocar la tapa sobre el plato para mantener la esterilidad. Una vez cubierto, incubar los platos inferiores de poliéster recubiertos de matriz en un cultivo celular, incubadora con dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante seis a 12 horas. Después de la incubación, aspirar el exceso de medio y sembrar directamente la superficie con las células en la densidad deseada.

Coloque un tanque de agua debajo del objetivo de un microscopio vertical. A continuación, utilizando componentes optomecánicos disponibles comercialmente, coloque el soporte de muestra entre el objetivo y el transductor. Asegúrese de que las partes móviles y los actuadores de las etapas de traducción estén fuera del tanque o por encima de la línea de agua para evitar daños por agua.

A continuación, llene el tanque con agua desionizada y desgasificado hasta el plano horizontal del soporte de muestra, antes de utilizar el transductor de inmersión. Utilizando componentes optomecánicos no corrosivos y disponibles comercialmente, asegúrese de que el transductor esté en posición oblicua con respecto a la trayectoria óptica. Esto asegurará que las ondas reflejadas se alejarán de la muestra.

Ajuste la frecuencia del generador de funciones a la frecuencia pico nominal del transductor. A continuación, cree un pulso de voltaje sinusoidal de la duración deseada y la frecuencia de repetición, utilizando el modo de ráfaga del generador de funciones. A continuación, ajuste el voltaje de pico a pico a un valor deseado.

Asegúrese de que la duración del pulso sea más corta que el tiempo transcurrido entre dos pulsos consecutivos. Conecte la salida del generador de funciones a la entrada de un osciloscopio. Utilice el osciloscopio para confirmar que la forma de onda corresponde a la señal deseada.

A continuación, conecte la salida del generador de funciones a la entrada de una potencia de un amplificador de RF del tamaño adecuado. Usando una sonda de hidrófono que funcione con un rango de frecuencia e intensidad acústica compatible con el del transductor de ultrasonido, ponga cuidadosamente la punta de la sonda en el foco dentro del campo de visión del objetivo en la posición de la muestra. Asegúrese de que tanto la sonda como el transductor estén sumergidos en el baño de agua y realice una prealineación bruta del transductor posicionando visualmente su eje acústico hacia la sonda de hidrófono.

Asegúrese de que la distancia entre los dos corresponde a la distancia focal del transductor. No golpee la punta del hidrófono con ningún objeto físico que no sea agua, ya que esto alterará su recubrimiento y afectará la medición. A continuación, conecte la salida del hidrófono a una de las entradas de señal del osciloscopio.

A continuación, conecte el disparador de sincronización desde el generador de funciones a otra entrada de osciloscopio. Visualice ambas señales simultáneamente en el osciloscopio. A continuación, conduzca el transductor con pocos ciclos de ultrasonido a un ciclo de trabajo bajo y baja amplitud para evitar dañar la sonda.

Consulte con el fabricante del hidrófono las condiciones de funcionamiento seguras para evitar dañar la punta del hidrófono. Ajuste la perilla de división S de acuerdo con el tiempo de viaje del ultrasonido desde la superficie del transductor hasta el hidrófono. Busque una señal de hidrófono en el osciloscopio después del disparador de sincronización.

A continuación, acciona lentamente el transductor utilizando una etapa XYZ motorizada o manual. Coloque el transductor en la posición que se correlaciona con la señal máxima del hidrófono. Con el haz ahora alineado, mida la amplitud pico a pico de la salida del hidrófono en el osciloscopio para varios voltajes que impulsan el transductor.

Asegúrese de no exceder el límite de presión del hidrófono. Sustituya el medio de cultivo de la célula por el búfer de imágenes deseado que contenga cinco micromolares de un tinte sensible al calcio y permeante de células, como Fluo-4 AM. Luego, incuba el plato de cultivo en una incubadora con dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, lave cuidadosamente las células con el mismo tampón libre de tinte.

A continuación, coloque el plato en el portacuchillas. Emociona las células usando iluminación de luz azul a 490 nanómetros. Ajuste la intensidad de excitación y la exposición de la cámara para evitar el blanqueo excesivo o la saturación de píxeles.

Realice imágenes de lapso de tiempo utilizando un objetivo de inmersión con una larga distancia de trabajo para una mejor calidad de imagen y para reducir los reflejos no deseados. Aquí, las células del glioblastoma se muestran en la película de poliéster recubierta de matriz extracelular en medio de cultivo estándar. Estas células han sido incubadas con un reportero fluorescente sensible al calcio.

En esta imagen, los puntos rojos representan celdas fluorescentes individuales, identificadas mediante un software de procesamiento de imágenes. Tras la estimulación durante 10 segundos con ultrasonido, se visualizaron elevaciones robustas de calcio en muchas regiones de interés. El número de regiones de interés activadas se muestra aquí a lo largo del tiempo.

Después de la activación de 10 segundos con ultrasonido, se encontró que aproximadamente el 70% de las regiones estaban por encima de los valores de umbral definidos por el usuario. Al intentar este procedimiento, es importante recordar alinear el haz de ultrasonido antes de realizar la medición de fluorescencia.