Name: Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a evaluar la citotoxicidad de células T CAR contra esferoides tumorales 3D en tiempo real mediante imagen avanzada. Este método permite estudiar respuestas inmunitarias en modelos de cáncer colorrectal.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo de investigación noruego bajo becas #244388, 254817 # y #284983; la sociedad de cáncer Noruega (#6829007); La región de salud de Noruega del sudeste bajo la subvención #17/00264-6 y #2016006.

1. generación de esferoides de línea celular de cáncer colorrectal
<ol><li>Monocapas de células de lavado HCT 116 (transduced estable para expresar del racimo de la diferenciación 19 (CD19) y la proteína de fluorescencia verde (GFP)) con el fosfato tampón salino (PBS, 5 mL de 25 cm2 o 10 mL para un frasco de 75 cm2 ). Añadir tripsina (0,5 mL de 25 cm2 o 1 mL para un frasco de 75 cm2 ) e Incube las células a 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Compruebe separación de células bajo un microscopio y neutralizar la enzima de disociación celular con medio completo del Roswell Park Memorial Institute 160 (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL de 25 cm2 o 20 mL para un frasco de 75 cm2 ).</li>
	<li>Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con 5 mL de medio RPM1 1640 completo.</li>
	<li>Contar las células mediante exclusión del azul tripán en un contador de células compatibles.</li>
	<li>Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender en Medio RPMI para obtener 5 x 103 células/mL.</li>
	<li>Transferir la suspensión a un depósito estéril y dispensar 200 μL/pocillo en un 96-bien alrededor de las placas inferiores utilizando una pipeta multicanal.</li>
	<li>Transferir la placa al aparato de proyección de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).</li>
	<li>Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione Programa para adquirir | Lanzamiento añadir buque | Exploración en calendario | Crear buque: nuevo.</li>
	<li>
Seleccione Análisis tipo: esferoide. Seleccionar los canales de interés: fase + Brightfield (para seguir el crecimiento de esferoides), verde (para seguir la señal del tumor, adquisición tiempo 300 ms) y rojo (para seguir el apoptosis, adquisición tiempo 400 ms).
	<ol>
<li>Seleccione la deseada ampliación: 10 x.</li>
		<li>Elige el modelo de placa y su posición en el cajón. Seleccione la posición de los pozos a la imagen. Escriba la descripción del experimento: nombre, tipo de células, número de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la configuración de análisis, seleccione Diferir el análisis hasta más tarde. Haga clic derecho sobre la línea de tiempo y seleccione la opción Set seleccionado analizar grupo intervalo y establecer añadir exploraciones cada a 4 h y un total de 24 h. ajustar la hora de inicio deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de proyección de imagen automatizado).</li>
	<li>
Iniciar sesión en el software de imágenes para comprobar cada 2 días para el crecimiento de esferoides.
	<ol>
<li>Elija la opción Más reciente explora y haga doble clic en el experimento deseado. Seleccione trasmitida en el panel de canales de imagen y luego utilice la herramienta de características de imagen de medida para medir el diámetro de los esferoides. Tarda 6 días para un esferoide alcanzar el tamaño deseado: 0,5 mm de diámetro. Añadir 50 μl de Medio RPMI completo por pozo en el día 4 para limitar el efecto de evaporación media.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generación de células CD19 coche T
<ol><li>
Expansión de células CD19 coche T Nota: La expresión estable de células CD19 coche T fue adquirida por transducción retroviral a granel del donante sano PBMCs como se describió anteriormente16. La codificación del constructo retroviral para CD19 coche es un coche de segunda generación y consiste en fmc63 fragmentos cadena, bisagra de CD8 y dominio transmembrana, un dominio coestimuladoras 4-1BB y finalmente un dominio de CD3ζ.<ol>
<li>Para expandir, cultura T transduced las células en presencia de bolas magnéticas anti-CD3/28 con un celular a proporción de grano de 1:1 para 10-11 días. Durante la expansión, las células están en medio completo (VIVO X 15, 5% suero de reemplazo y IL-2 humana recombinante de 100 U/mL). Nota: La densidad ideal para una expansión eficaz es de 1 a 2 x 106 células/mL. Dependiendo del número inicial, las células pueden ampliarse en frascos (frascos de 25 cm2 a 20 mL, frascos de 75 cm2 a 40 mL de volumen total) en una incubadora de cultivo celular (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).</li>
		<li>Como grupo de control negativo para los siguientes ensayos, son no-transduced PBMCs (se hará referencia como Mock) en el protocolo de expansión paralelo a las células CD19 coche T.</li>
		<li>El día 3, añadir medio fresco cada día y las células se dividen en frascos de cultivo más si es necesario.</li>
		<li>Día 10 – 11, centrifugar las células a 500 x g por 5 min Quite el sobrenadante y combinar todas las celdas en un tubo de 50 mL y resuspender las células en 30 mL de medio completo fresco.</li>
		<li>Coloque el tubo de 50 mL que contiene las células resuspendidas en un soporte magnético para separar las bolas magnéticas en el medio de cultivo.</li>
		<li>Espere de 2 a 3 minutos para las cuentas a cobrar en el lado del tubo.</li>
		<li>Retire el medio de cultivo con una pipeta y transfiéralo a un tubo nuevo sin tocar las zonas de recogida de grano magnético.</li>
		<li>Repita los pasos con respecto a la eliminación de grano (2.1.5–2.1.7) una vez más para limitar el número de granos en el medio de cultivo final.</li>
		<li>Resuspender y contar las celdas, ajustar la densidad a 1 ó 2 x 106 células/mL en medio completo.</li>
		<li>Resto de las células de al menos 4 h hasta la noche. Directamente les congelar abajo a-80 ° C y transferir los frascos a un tanque de nitrógeno líquido en el día siguiente para almacenamiento a largo plazo. Alternativamente, uno puede prolongar el resto hasta la noche para su uso inmediato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Control de la expresión de CD19 coche en células T primarias
	<ol>
<li>Contar el número de células T ampliadas como los números pueden variar un poco después de la cultura durante la noche o moderado después de la congelación/descongelación.</li>
		<li>Transferencia de 5 x 105 células de ambos coches de CD19 y mofa de las células T primarias para separar los tubos de citómetro de flujo.</li>
		<li>Lavar las células con 200 μL de tampón de flujo (2% FBS en PBS) y centrifugar los tubos a 500 x g durante 5 minutos repiten los pasos de lavado para eliminar cualquier artefactos causados por el medio de cultivo.</li>
		<li>Preparar el anticuerpo primario (biotina cabra anti-ratón IgG, F(ab') ₂ fragmento específico) al realizar la dilución 1: 200 en flujo tampón.</li>
		<li>Resuspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos por el tubo e incubar en hielo por 15 minutos Repita el paso anterior de lavado dos veces para quitar exceso del anticuerpo.</li>
		<li>Preparar el anticuerpo secundario (estreptavidina-PE) como dilución 1: 400 en flujo tampón.</li>
		<li>Resuspender las células en 100 μL de la mezcla de anticuerpos por el tubo e incubar en hielo para 15 minutos Repita el paso anterior de lavado dos veces para eliminar el exceso del anticuerpo.</li>
		<li>Resuspender las células en 200 μL de tampón de flujo por tubo y analizar en un citómetro de flujo.</li>
		<li>Utilizamos las células de T burlan la puerta negativa y positiva y analizar CD19 coche transduced las células de T por consiguiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D Tumor esferoide asesinato ensayo
<ol><li>
Después de 6 días o una vez esferoides alcance el tamaño deseado, retire la placa de la incubadora. Usando una pipeta multicanal, suavemente Retire 100 μL/pocillo de medio RMPI 1640 completo de las placas de esferoide.
	<ol>
<li>Para este paso, ángulo de las puntas hacia el interior pared de la placa de 96 pozos, evitando el contacto con el fondo del pozo con el fin de minimizar la alteración de los esferoides. Restante de volumen debe ser alrededor de 100 μl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución de 1: 200 de anexina V rojo mezclando 50 μl de anexina V rojo con 9,95 mL de Medio RPMI 1640 completo.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo de la solución de la anexina V rojo de 1: 200.</li>
	<li>Transferir la placa a una incubadora (37° C, 5% CO2, 95% de humedad) de 15 minutos.</li>
	<li>Cosechar las células CD19 del coche T transduced en un tubo de 15 mL y centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con 2 mL de medio RPM1 1640 completo.</li>
	<li>Contar las células mediante exclusión del azul tripán en un contador de células compatibles.</li>
	<li>Suspensión de células de centrifugar a 500 x g por 5 min retirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender en Medio RPMI para obtener 2 x 105 células/mL.</li>
	<li>Transferir la suspensión a un depósito estéril y dispensar 100 μL/pocillo en un 96-pozo redondo inferior esferoide placa con una pipeta multicanal.</li>
	<li>Transferir la placa al aparato de proyección de imagen automatizado dentro de una incubadora (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).</li>
	<li>
Inicie sesión en el software de adquisición, seleccione programa para adquirir.
	<ol>
<li>Haga clic en la línea de tiempo de exploración y seleccione Editar línea de tiempo. Haga clic derecho en el grupo de exploración y elimínelo. Haga clic en la línea de tiempo y seleccione la opción Set seleccionado analizar grupo intervalo y añadir exploraciones cada a 1,5 h y para un total de 24 h.</li>
		<li>Establezca la hora inicial deseada (al menos 1 h después de la incubación en el aparato de proyección de imagen automatizado). Seleccione guardar análisis de programación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de la imagen automatizado
<ol><li>Ingresa en adquisición, escoger la opción Más reciente explora y seleccione la opción Iniciar análisis . Seleccione crear nueva definición de análisis | Tipo de análisis: esferoide. Marque los canales de imagen para analizar (fase + Brightfield, verde y rojo).</li>
	<li>Seleccionar al menos 10 imágenes representativas: por lo general, 1 por estado y por lo menos 3 puntos del tiempo (principio, medio y final de la adquisición).</li>
	<li>Vista previa por defecto analizar procedimiento en la pila de toda la imagen.</li>
	<li>Modificar los parámetros para la máscara del brightfield. Parámetros típicos son: sensibilidad 10, agujero relleno 1.000 μm2, min area 1.000 μm2. Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.</li>
	<li>Modificar los parámetros de la máscara verde (GFP). Parámetros típicos son: segmentación de sombrero con radio 200 μm y umbral 3 GCU, borde escindido, agujero llenar 5.000 μm2, ajuste tamaño -2 píxeles, área mínima 3.000 μm2. Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.</li>
	<li>Modificar los parámetros de máscara roja (anexina V). Parámetros típicos son: segmentación de sombrero con radio 150 μm y umbral 2 GCU, borde escindido, agujero llenar 5.000 μm2, ajuste tamaño 0 pixeles, área mínima 1.000 μm2. Vista previa en la pila de toda la imagen y comprobar que los parámetros seleccionados detectan con precisión los esferoides.</li>
	<li>
Inicie el analizador.
	<ol>
<li>Una vez hecho el análisis, extraer la medición de interés. Seleccione el archivo analizado y luego la opción Gráfico de mediciones . Seleccionar las métricas de interés, la exploración y el pozo. Normalmente, total intensidad de roja y verde dentro de los límites de brightfield dar las medidas más precisas mediante la restricción de la señal de fluorescencia a los límites de esferoides determinado por la máscara de brightfield (figura 3). Extracto de las métricas en varios formato haciendo clic en "Exportar datos".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proceder a la extracción de las imágenes y películas seleccionando el archivo analizado y luego seleccione la opción exportar imágenes y películas . Dos opciones están disponibles, ya sea "como muestra" para recuperar imágenes y películas como visto en el software de proyección de imagen (imágenes compuestas generalmente), o "almacenada" para recuperar datos de raws para análisis externo a través de software de tercera parte.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso de esferoides como una innovadora herramienta para validar el tratamiento futuro contra el cáncer se ha convertido en un campo de creciente interés en los últimos años. Esferoides representan un paso intermedio entre el clásico 2D análisis in vitro y en vivo. El método más sostiene una gran promesa en cuanto a su potencia en términos de tumor micro-ambiente imitando así como gene perfiles7. El protocolo presentado en esta publicación es una adaptación del Saheen et al<sup class="xr...

Transferencia celular adoptiva (ACT) representa el tratamiento de cáncer de próxima generación. Se basa en la inyección de células efectoras (células T o NK) en un paciente. Estas células pueden ser modificadas genéticamente con un receptor que se guía a su destino, el tumor y lo destruyen. Este enfoque fue demostrado recientemente para ser factible cuando un Receptor de antígeno quimérico (coche) dirigido contra el marcador de células B CD19 fue introducido en las células T del paciente para matar su cáncer1. En el caso del coche, que es un receptor artificial, el diseño consiste de fragmentos de anticuerpos específicos, el antígeno vinculante dominio reducido a un fragmento variable de cadena única designada de entidad (scFv), vinculados a los dominios de señalización del T-cell. Aunque existen varios diseños, las versiones más utilizadas que se refiere como diseños de coches de segunda generación, consisten en CD3z para señalización del TCR y un dominio coestimuladoras (CD28, 4-1BB, OX40, etcetera.) 1 , 2. el campo de la inmunoterapia dirigida la mayor parte de su atención a esta nueva forma de acto cuando las células CD19 coche-T eficazmente trataron numerosos pacientes con neoplasias de células B3,4. Tras este éxito, los investigadores intentaron explotar los diseños similares apuntando a otros epitopos para tumores sólidos con éxito limitado. Lamentablemente, la escasez de antígenos específicos de tumor y los microambientes de tumor más prestados del coche T células menos eficaces hacia tumores sólidos5.
En la actualidad, las estrategias de validación más comúnmente utilizado en vitro dependen de sistemas bidimensionales (2D) que sólo se refieren a un fragmento de los desafíos ya mencionados tumor sólido. Clásico, 2D en vitro sistemas implican una mezcla de células T auto y líneas celulares de cáncer destino como monocapas para evaluar la funcionalidad y la especificidad de estas células efectoras. Aunque estas estrategias son parte importante y vital de los estudios, no toman en consideración la compleja morfología y estructura tridimensional (3D) de las células de cáncer6. Las células cancerosas cultivadas en sistemas 3D, denominados esferoides, adquieren nuevos rasgos fenotípicos a través de cambios en el gene expresión perfil7, que puedan influir en el reconocimiento por células efectoras redirigida. Birgersdotter y colegas demostraron que una línea de células de linfoma (HL) de Hodgkin cuando se cultiva solamente en un modelo 3D de la cultura adquiere un perfil de expresión génica que es similar al de las muestras del tumor primario8. Por lo tanto, esferoides o similar 3D cultura oferta de metodologías más relevantes modelos in vitro frente a los sistemas 2D estándar. Estos sistemas también son similares a estudios in vivo que se ven como el último paso en el proceso de validación de un determinado coche. Teniendo en cuenta que los sistemas 2D no imitan la morfología de racimos de cáncer, esferoides ofrecen formaciones similares para evaluar la funcionalidad de las células de T automóvil antes modelos en vivo. En un estudio, Pickl et al identificaron que un modelo esferoide del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) overexpressing células cancerosas demostraron perfiles de señalización similares a modelos en vivo9. Esto apoya aún más que los esferoides ofrecen más relevantes y cerrar-a-en vivo la evaluación de las células de T del coche. Además, validación de coche T-cell contra esferoides podría ayudar a evaluar más críticamente su eficacia y evitar algunos de los diseños que se mueva para estudios in vivo prematuramente10; contribuyendo a la investigación ética preocupada por sacrificar menos animales. Además, protocolos con esferoides no son más caros que los sistemas 2D clásicos y mucho más rápido en comparación con los estudios clásicos en vivo . Tomados en conjunto, se puede predecir que la inclusión de estudios esferoide se convertirá pronto en práctica estándar para vincular los estudios in vitro e in vivo.
Presentamos la preparación de esferoides de la línea de células de cáncer de colon HCT 116. Esta línea celular fue modificada para expresar la molécula CD19 humana para hacerla sensible a las células CD19 coche T y para proporcionar una evaluación clara de la matanza con una construcción de coche clínicamente validada.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><<td>strong>Número de lote:</fuerte> RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; matraces de área de crecimiento</td><td>VWR</td><td></td> <td>430639Número de lote:</fuerte> 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; matraces de área de crecimiento</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>Número de lote:</fuerte> 3718006</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Número de lote:</fuerte> SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamina, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Número de lote: 1926384</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Número de lote: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Número de lote: 1904924A</td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripano, 0.4%</td><td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>Número de lote:</fuerte> 1886513</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos, fondo redondo</td><td>VWR</td><td>734-1797</td><td>Número de lote:</fuerte> 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Activador T humano CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 con gentamicina L-Gln, rojo fenol, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Número de lote: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Immune Cell Serum Replacement</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Número de lote: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Número de lote: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Número de lote: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Depósito de reactivos</td><td>VWR</td><td>89094-672</td><td>Número de lote:</fuerte> 89094-672</td></tr><tr><td>Tubos de 15 mL VWR</td><td></td><td>734-1867</td><td>Número de lote:</fuerte> 19317044</td></tr><tr><td>antihumano CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Número de lote: 4016990 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>Biotina-SP (espaciador largo) AffiniPure F(ab')2 Fragmento de cabra Anti-Ratón IgG</td> Jackson <td>ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Número de lote: 129474: RRID: AB_2338583</td></tr><tr><td>Estreptavidina-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>Lot Number: 5191579: RRID: </fuerte> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Línea de Carcinoma Colorrectal</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de la matanza de esferoide por las células de t automóvil

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

La inmunoterapia se ha convertido en un campo de creciente interés en la lucha contra el cáncer de otra manera intratable. Entre todos los métodos de inmunoterapia, receptor del antígeno quimérico (coche) redirigido las células de T obtenidas los resultados más espectaculares, en particular con leucemia linfoblástica aguda-B pediátrica (B-ALL). Métodos de validación clásica de células T auto confían en el uso de especificidad y ensayos de funcionalidad de las células de T automóvil contra las células de la blanco en suspensión y en modelos de xenoinjerto. Por desgracia, observaciones in vitro a menudo se desemparejan de resultados obtenidos en vivo y un montón de esfuerzo y animales podría salvarse mediante la adición de un paso: el uso de la cultura 3D. La producción de esferoides de potenciales células Diana que imitan la estructura 3D de las células tumorales cuando son engrafted en el modelo animal representa una alternativa ideal. Aquí, Divulgamos un método asequible, fiable y fácil de producir esferoides de una línea de células transduced de colon como una herramienta de validación para la terapia celular adoptiva (ejemplificada aquí por las células CD19 coche T). Este método es junto con un avanzado sistema de proyección de imagen vivo que puede seguir el crecimiento del esferoide, efectoras células de citotoxicidad y tumor apoptosis de las células.

Como puede verse en la figura 1, es crucial para controlar mediante citometría de flujo, el nivel de expresión de CD19 en células T (figura 1A) y el nivel de CD19 en líneas celulares de tumor HCT116 (figura 1B). Figura 2 ejemplifica el resultado de un experimento típico del esferoide. El aparato de proyección de imagen automatizado toma fotografías en cuatro canales dife...

Este protocolo está diseñado para evaluar la citotoxicidad de T-cell (T-cell de coche) redireccionada inmunoterapéutico contra células cancerosas estructuradas 3D (esferoides) en tiempo real.

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de la inmunoterapia sobre la evaluación de la citotoxicidad de las células inmunitarias contra las células tumorales de la estructura 3D. Las principales ventajas de este método son que es sencillo y combina tecnología de imagen avanzada y un ensayo inmunológico sensible. Comience lavando la línea de interés de la célula de cáncer colorrectal con cinco mililitros de PBS y retirando las células del fondo del matraz con 0,5 mililitros de trippsina durante cinco minutos a 37 grados centígrados.Después de confirmar el desprendimiento bajo un microscopio, neutralice la enzima de disociación celular con 10 mililitros de medio completo y recoja las células por centrifugación. Resuspender el pellet en cinco mililitros de medio fresco completo para contar y resuspender las células a una concentración de 1,5 veces 10 a las terceras células por mililitro. A continuación, sembrar 200 microlitros de células en cada pozo de placa inferior redonda de 96 pozos y colocar la placa en un aparato de imágenes automatizado dentro de una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de CO2 y 95% de humedad.Inicie sesión en el software de adquisición del aparato y seleccione Programar para adquirir, Lanzar añadir buque, Escanear a la programación y Crear buque nuevo. A continuación, seleccione el tipo de escaneo Esferoide y seleccione los canales de interés y de campo brillante apropiados. Ajuste el aumento a 10 veces y seleccione el modelo de placa y su posición dentro del cajón del aparato de imágenes.Seleccione la posición de los pozos a ser objeto de una imagen e introduzca la descripción del experimento, incluido el nombre, el tipo de celdas y el número de celdas. Para la configuración del análisis, seleccione Aplazar análisis hasta más tarde, haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo y seleccione Establecer intervalo de grupo de análisis seleccionado y establezca Agregar exploraciones cada cuatro horas y Para un total de 24 horas. A continuación, establezca la hora de inicio en al menos una hora después de la incubación en el aparato de imágenes automatizado.Para comprobar el progreso del crecimiento del esferoide, cada dos días, inicie sesión en el software de imágenes y seleccione Ver análisis recientes. Haga doble clic en el experimento de interés y seleccione Campo de iluminación en el panel Canales de imagen. A continuación, utilice la herramienta Medir entidades de imagen para medir el diámetro de los esferoides, añadiendo 50 microlitros de medio completo por pozo en el cuarto día para limitar cualquier efecto de evaporación media.Cuando los esferoides alcancen el tamaño experimental adecuado, angulo cuidadosamente la placa y utilice una pipeta multicanal para eliminar suavemente 150 microlitros de medio completo de cada pozo sin alterar los esferoides. A continuación, sustituya el medio desechado por 50 microlitros de una solución de uno a 200 de Annexin V Red y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular durante 15 minutos. Centrífuga transdujo células T CAR CD19 en un tubo cónico de 15 mililitros y resuspend el pellet en dos mililitros de medio completo.Después de contar, diluir las células a dos veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media completa. A continuación, agregue 100 microlitros de células T CAR CD19 a cada pozo que contenga esferoides y devuelva la placa al aparato de imágenes automatizado. En el software de adquisición, seleccione Programar para adquirir y haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo del análisis.Seleccione Editar línea de tiempo y haga clic con el botón derecho en el grupo de análisis para eliminarlo. Haga clic con el botón derecho en la línea de tiempo de nuevo y seleccione Establecer intervalo de grupo de análisis seleccionado y establezca Agregar exploraciones cada 1 1/2 horas y Para un total de 24 horas. A continuación, establezca la hora de inicio de la imagen en al menos una hora después del inicio de la incubación en el aparato de imágenes automatizado y seleccione Guardar escaneos de programación.Para el análisis automatizado de imágenes, en el software de escaneo, seleccione Ver análisis recientes y Análisis de inicio. Seleccione Crear nueva definición de análisis y tipo de análisis Spheroid y establezca los canales de imagen que se analizarán. Seleccione al menos 10 imágenes representativas y obtenga una vista previa del procedimiento de análisis predeterminado en toda la pila de imágenes.Modifique los parámetros de la máscara de campo brillante y previsualice la pila de imágenes, confirmando que los parámetros seleccionados detectan los esferoides con precisión. Modifique los parámetros de la máscara verde y previsualice la pila de imágenes para confirmar que los parámetros seleccionados detectan los esferoides con precisión. Modifique los parámetros de la máscara roja y previsualice la pila de imágenes para confirmar que los parámetros seleccionados detectan los esferoides con precisión.Tenga cuidado de lograr la mejor señal sobre el ruido y la sensibilidad sobre las proporciones de especificidad, teniendo en cuenta que no será capaz de encontrar un conjunto de parámetros que permitirán capturar cada evento en cada momento. A continuación, inicie el analizador. Una vez completado el análisis, extraiga la medida de interés y seleccione el archivo analizado y la opción de métricas de gráficos.Seleccione las métricas de interés, el análisis y el pozo. Haga clic en Exportar datos para extraer las métricas seleccionadas en varios formatos de archivo. A continuación, para extraer las imágenes, seleccione el archivo analizado y seleccione Exportar imágenes y películas.La expresión CD19 CAR en células T transducidas y la expresión CD19 en células de cáncer colorrectal transducidas se pueden confirmar mediante citometría de flujo. Aquí, se puede observar el resultado de un experimento esferoide típico. A diferencia de las células T simuladas, las células T CD19 CAR son capaces de matar específicamente los esferoides derivados de la línea de células de cáncer colorrectal, disminuyendo en gran medida el número de células tumorales vivas.El seguimiento de la evolución de las señales verdes y rojas totales dentro de los límites del esferoide con el tiempo revela que poco después de la inyección de células T CD19 CAR, el tamaño de los esferoides se reduce rápidamente a medida que la señal de apoptosis aumenta rápidamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ensayos de toxicidad, ensayos de migración celular o mediciones de la estructura esferoides para responder preguntas adicionales sobre el cribado de fármacos, la motilidad de las células T o la formación de esferoides, respectivamente.

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Los esferoides son un tipo de modelo de cultivo celular en 3D que se utiliza para representar con mayor precisión el entorno de una célula en comparación con los modelos monocapa de cultivo celular en 2D. En el protocolo de ejemplo, veremos a los científicos generar esferoides a partir de una línea celular de cáncer colorrectal y aplicar imágenes de células vivas para rastrear el crecimiento de los esferoides.

Generación de esferoides a partir de líneas celulares: un método de cultivo celular tridimensional (3D)

En este video, demostramos el ensayo de desafío tumoral repetitivo para evaluar el potencial de destrucción tumoral repetitiva de las células CAR-T durante altas cargas de células tumorales. Además, las células CAR-T se pueden analizar mediante citometría de flujo para determinar las diferentes subpoblaciones de células CAR-T en la muestra.

Ensayo de provocación tumoral repetitiva: un ensayo de cultivo in vitro para evaluar las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) para determinar el potencial de destrucción tumoral repetitiva

Este video muestra un método para monitorear la actividad de las células CAR-T contra células cancerosas a través de mediciones de impedancia eléctrica en tiempo real. El seguimiento de los cambios en la impedancia evalúa la eficacia de las células CAR-T en la inducción de la citólisis de las células cancerosas, proporcionando información sobre sus capacidades citotóxicas.

Un ensayo de citólisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células CAR-T

Este video muestra un ensayo in vitro que evalúa los efectos citotóxicos de las células CAR-T en esferoides tumorales 3D que expresan proteínas fluorescentes. Esta evaluación utiliza la sonda fluorescente roja de anexina V, que se une a los residuos de fosfatidilserina expuestos en la valva externa de las células cancerosas apoptóticas después de las interacciones con las células CAR-T. La fluorescencia roja emitida por la sonda ayuda a distinguir estas células de las sanas que emiten...

Un ensayo in vitro para evaluar la citotoxicidad de las células CAR-T frente a esferoides tumorales

Este video muestra un ensayo in vitro para validar la actividad de las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). Las células de linfoma de células B que expresan el antígeno CD19 y la luciferasa citoplasmática se cultivan conjuntamente con células CAR-T específicas de CD19. La unión de CAR a CD19 en un tumor induce a las células CAR-T a liberar citocinas y toxinas que causan citotoxicidad en las células tumorales. La actividad de las células CAR-T se evalúa cuantificando la citocina...

Ensayo in vitro para evaluar la actividad antitumoral de las células CAR-T específicas de tumores

Se describe una sola célula de alto rendimiento de ensayo para medir la citotoxicidad de las células T cuando se incuba con las células diana tumorales. Este método emplea una matriz densa, elastómero de sub-nanolitros pozos (~ 100.000 pozos / matriz) para confinar espacialmente las células T y las células diana en proporciones definidas, y está acoplado a la microscopía de fluorescencia para monitorizar efector-diana conjugación y posterior apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Describimos la evolución de un modelo tridimensional, basado en el esferoide en vitro que nos permite poner a prueba el estándar actual de los regímenes de terapia experimental para cabeza y cuello de células escamosas en líneas celulares, con el objetivo de evaluar la terapia susceptibilidad y resistencia en células primarias de muestras humanas en el futuro.

Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Aprende a evaluar la citotoxicidad de células T CAR contra esferoides tumorales 3D en tiempo real mediante imagen avanzada. Este método permite estudiar respuestas inmunitarias en modelos de cáncer colorrectal.

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

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