Name: Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a generar clones de células de cáncer con etiquetas MS2 en subtelómeros específicos para visualizar transcritos TERRA en células vivas mediante microscopía confocal.

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Estamos muy agradecidos al personal de la facilidad avanzada de la proyección de imagen del CIBIO en la Universidad de Trento y la instalación de microscopía de luz de BioOptics en el Max F. Perutz laboratorios (MFPL) en Viena. La investigación conduce a estos resultados ha recibido no financiación de la Stiftung Mahlke Obermann y séptimo programa marco de la Unión Europea para la investigación, desarrollo tecnológico y demostración en convenio de subvención 609431 de la CE. CE es apoyado por una beca Montalcini del Ministerio italiano de la Universidad de la educación y la investigación (MIUR).

1. Selección de Clones resistentes a la neomicina
<ol><li>Cultivar células AGS en medio F-12_K del jamón (Kaighn) suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) a 37 ° C y 5% CO2. Transfectar las células en un 50-60% de confluencia con el sgRNA/Cas9 expresando el vector y el cassette de MS2 en un 1:10 cociente molar21. Nota: En un experimento paralelo, comprobar eficacia de transfección transferencia un vector de expresión de GFP (es decir, GFP Cas9 vector). Al menos debe alcanzar el 60-70% de eficiencia de transfección.</li>
	<li>Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo con medio que contiene neomicina en concentración final de 0.7 μg/mL (medio selectivo). Nota: División de las células y les siembra en medio selectivo el día después de la transfección acelerará el proceso de selección. Todas las células transfectadas no va a morir inmediatamente. Si realiza la transfección en 6 placas de pozos, en cuyo caso cada bien en un 60% confluencia contendría aproximadamente 0,7 x 106 células, que las células pueden dividirse de un pozo único a un medio selectivo que contiene 10 cm plato al día siguiente.</li>
	<li>Mantener las células en medio selectivo para 7-10 días, cambiando el medio cada uno o dos días, hasta que los clones solo son accesibles.</li>
	<li>Selección de clones de células<ol>
<li>Preparar un plato bien 96 con 10 μl de tripsina 0.25% en cada pozo. Nota: Prepare dos 96 placas bien en caso de que se espera que más de 96 clones recogidos.</li>
		<li>Con el uso de un microscopio, marque la posición de cada clon visible en el plato 10 cm haciendo un punto en la parte inferior del plato usando un marcador. Cada punto corresponderá a una colonia a ser recogido.</li>
		<li>Reemplazar el medio de cultivo con suficiente fosfato tampón salino (PBS) que forman una fina película de líquido sobre los clones y no dejar que las células secas durante la cosecha de clones.</li>
		<li>Escoge solo colonias con una pipeta de 10 μl. Fije la punta con 5 μl de tripsina a la Colonia y suelte lentamente la tripsina que permanecerá localizada en la Colonia. Permiten tripsina separar las células durante 1 minuto, luego raspar la Colonia con la punta y aspirar en la punta. Nota: Durante este procedimiento, cambiando el plato un poco de un lado así que disminuir el volumen de PBS alrededor de la Colonia burlan ayudará el proceso de selección evitando diluir la tripsina alrededor de la Colonia. Usando un anillo clon también puede ayudar a recoger solo clones.</li>
		<li>Coloque las células de la Colonia en un pocillo de la placa bien 96 con 10 μl de tripsina 0.25%.</li>
		<li>Incubar 5 min a temperatura ambiente, luego llene el pozo con 150 μL de medio selectivo (medio Ham F - 12K (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL. Nota: Durante el tiempo de incubación otros clones se pueden seleccionar. Se recomienda escoger tantos clones como sea posible. Se recogen los clones más mayor será las posibilidades de identificación positivas.</li>
		<li>Una vez que todos los clones son seleccionados y transferidos en la placa de la pozo 96, permite a las células a crecer durante unos días en medio selectivo F - 12K de Ham (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg / mL del medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL a 37 ° C y 5% CO2, hasta llegar a 90% de confluencia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Partir de los clones<ol>
<li>Preparar tres 96 placas bien cubiertas con gelatina por agregar 100 μl de gelatina por pozo, incubar durante 30 min a temperatura ambiente, luego lavar dos veces con PBS. Estas placas se utilizará para la extracción de ADN (placa de ADN) y clon congelación (placas de congelación). Nota: La gelatina promoverá la fijación de las células y del ADN en los pocillos. En particular, la capa de gelatina permitirá el ADN pegue en el fondo de los pozos durante la extracción de ADN y lavar procedimientos (discutidos abajo). Durante el procedimiento de separación de clon, es recomendable utilizar una pipeta multicanal.</li>
		<li>Una vez que clones alcanzan el 90% de confluencia, aspirar el medio de cada pocillo de la placa de la pozo 96, lavar con PBS, Añadir 30 μl de tripsina 0.25% por pozo e incubar 5 min a 37 ° C. Nota: Clones crecerá a tasas diferentes, que también dependerá del número de células recogidas por clon. Por lo tanto, este paso se realizará durante los días cuando los clones diferentes a 90% de confluencia.</li>
		<li>Añadir 70 μl de medio selectivo por pozo, desbaratar grumos de células mediante pipeteo arriba y abajo dentro de los pozos, luego transferir 30 μl de 100 μl a la placa de ADN gelatinizada prellenada con 120 μl de medio selectivo por pozo y 30 μL en el ingenio prellenada gelatinizado de congelación las placas h 50 μl de medio (sin selección).</li>
		<li>Colocar la placa de la DNA en la incubadora y permitir a las células para crecer a 37 ° C y 5% de CO2 hasta 90% de confluencia.</li>
		<li>Añadir 80 μl de helado recién hecho 2 x congelación medio (80% FBS y 20% dimetil sulfóxido (DMSO)) a cada pocillo de la placa de congelación, añadir parafilm (rociado con etanol al 70%) sobre la placa para sellar cada pocillo, coloque la tapa en la parte superior y envolver la placa con papel de aluminio. Coloque las placas de congelación a-80 ° C.</li>
		<li>Agregar 90 μl de medio selectivo por bien a la placa bien 96 original que contiene los clones que se han dividido y no se en cultura hasta resultados de PCR. Esta placa se utilizará como placa de respaldo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. selección de Clones resistentes a la neomicina
<ol><li>Extracción de ADN de la placa de ADN bien 96.<ol>
<li>Una vez que los clones cultivados en la placa de ADN llega a 90% de confluencia, lavar 2 veces con PBS y lyse con 50 μl de tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM de NaCl, 0.5% SDS y proteinasa K de 1 mg/mL). Cubra la placa con parafilm, sellando cada pocillo, coloque la tapa, cubierta con el abrigo de saran y colocar a 37 ° C durante la noche.</li>
		<li>Añada 100 μl de etanol frío (Et-OH) y una solución de NaCl (0,75 M de NaCl en 100% de etanol) a cada uno bien, precipitar por 6 horas o durante la noche a temperatura ambiente. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
		<li>Quitar el Et-OH/NaCl solución invirtiendo la placa y lavar 3 veces con 200 μL de etanol al 70% por pozo.</li>
		<li>Añadir 25 μl de ARNasa A solución en agua destilada e incubar a 37 ° C durante 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice 3 μl de ADN genómico para la amplificación por PCR. Realizar investigación de la polimerización en cadena de los clones seleccionados usando las cartillas recocido dentro del gen de resistencia a neomicina y subteloméricas 15q. Amplificación por PCR se realiza utilizando enzimas de polimerasa estándar y protocolos PCR21. Nota: Las condiciones PCR para cartillas de MS2 (cartilla MS2-subtel15q-primer-S y MS2 como) y cartillas del CTR (primer CTR S y cartilla CTR como) son los siguientes: 98 ° C por 20 s como paso de desnaturalización y luego 34 ciclos a 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , en 25 μl de enzima polimerasa reacción mezclar (véase Tabla de materiales). Secuencias de la cartilla se indican en la tabla 1.</li>
	<li>Ejecutar reacciones de PCR en gel de agarosa y extracto de bandas PCR obtenidas de clones positivos mediante procedimientos de extracción de gel estándar (véase Tabla de materiales reactivos de extracción de gel).</li>
	<li>Realizar análisis de la secuencia de ADN del gel extraído del producto de PCR para la confirmación de la presencia de las secuencias de MS221. Nota: El análisis de secuencia pueden realizarse utilizando los cebadores utilizados para la detección de PCR.</li>
	<li>Proyección de la mancha blanca /negra meridional de clones positivos de PCR<ol>
<li>Crecen los clones positivos en PCR y detección de la secuencia de la original 96 bien placa (la copia de seguridad) a 6 platos bien en medio Ham F - 12K (Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio), estreptomicina (0.2 μg por mL de medio) y que contienen neomicina en una concentración de 0,7 μg/mL a 37 ° C 5% CO2. Nota: Como alternativa, si algunos de estos clones se han perdido, deshielo de una de las placas de congelación (véase protocolo 2.6).</li>
		<li>Una vez que los clones están en 90% de confluencia en la placa bien 6, lavan las células con PBS y añadir 250 μl de tampón de lisis que contienen 0,5 μg de proteinasa K por pozo.</li>
		<li>Raspar las células usando un raspador celular y transferir el lisado en un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C por 16 h.</li>
		<li>Añadir 1 mL de etanol al 100%, agitar con fuerza y permitir el ADN precipitado por lo menos 2 horas o toda la noche a-20 ° C. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
		<li>Vuelta a 13.400 x g a 4 ° C por 10 min, descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%. Deje que el pellets aire seco a temperatura ambiente. Como alternativa, utilice un concentrador de vacío.</li>
		<li>Resuspender el pellet de DNA en 50 μl de agua destilada conteniendo Rnasa A e incubar 1 h a 37 ° C.</li>
		<li>Digerir el 5-10 μg de DNA genómico con enzimas de restricción Brochothrix y BamHI (dos digestiones independiente) en el volumen de reacción de 100 μl por incubación de las reacciones de digestión a 37 ° C durante la noche.</li>
		<li>Ejecutar 4 μL de la digestión en gel de agarosa (agarosa 0,8%) para la confirmación de la digestión completa.</li>
		<li>Añadir 1/10 volumen de sodio acetato 3 M solución pH 5.2 y 2 los volúmenes de etanol al 100% a las reacciones de digestión de restricción e incubar por lo menos 2 horas o durante la noche a-20 ° C para precipitar el ADN. Nota: El protocolo se puede detener aquí.</li>
		<li>Centrifugue a 13.400 x g a 4 ° C por 20 min, descartar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70%. Dejar secar el pellet al aire a temperatura ambiente. Como alternativa, utilice un concentrador de vacío.</li>
		<li>Resuspender el pellet en 20 μl de agua destilada y el ADN digerido en un gel de agarosa al 0,8% de la carga. Nota: Para una mejor resolución del ADN digerido, preparar un gel por lo menos 15 cm de largo y correr toda la noche en baja tensión (̴30 v). Debe optimizarse la electroforesis establecida.</li>
		<li>Al día siguiente, teñir el gel con un agente etiquetado ADN, como el bromuro de etidio en concentración final de 1 μl/10 mL, 30 min a temperatura ambiente y tomar una foto con una regla cerca el gel en un gel de instrumento de proyección de imagen.</li>
		<li>Establecer a la transferencia de ADN a una membrana de nylon y realizar hibridación de la membrana con una sonda de secuencia-específica de MS2 utilizando procedimientos estándar21.</li>
		<li>Descongelar los clones que son positivos en PCR, ADN secuenciada y Southern blot de una de las dos placas de congelación (ver siguiente paso).</li>
	</ol></li>
	<li>Descongelación de clones<ol>
<li>Preparar un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de precalentado Ham F - 12 K medio (de Kaighn) suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina, penicilina (0,5 unidades por mL de medio) y estreptomicina (0.2 μg / mL de medio) por cada clon que se descongelarán.</li>
		<li>Retire una de las placas de congelación de-80 ° y añadir 100 μl de precalentado F12K medio completo al bien que contiene la copia positiva que se descongelarán. Nota: Este procedimiento debe realizarse rápidamente y la placa de la pozo 96 debe colocarse en hielo seco después de cada clon se descongele, para permitir que los otros clones que permanecen congelados. Esto es particularmente importante si necesitan ser descongelado del mismo plato bien 96 múltiples clones.</li>
		<li>Transferencia de las células al tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medio y centrifugue a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire el medio resuspender las células en 500 μl de medio de F12K completo precalentado y transferir cada clon a un único pozo de una placa bien 12.</li>
	</ol></li>
	<li>Eliminación del gen de resistencia a neomicina del cassette de MS2 integrado en subteloméricas 15q.<ol>
<li>Permita que los clones a crecer de una placa bien 12 a un plato de 10 cm en el medio F12K completo. Nota: Neomicina no se incluyera en el medio a menos que se indique lo contrario.</li>
		<li>Añadir el adenovirus Cre-expresar las células cultivadas en un plato de 10 cm en confluencia de 70% en 10 mL de medio completo F12K. Nota: Utilizando un adenovirus expresando GFP Cre permitirá la evaluación de la eficacia de la infección, que debe acercarse al 100%. El adenovirus replicación defectuosa se perderán después de pocos pasos en la cultura.</li>
		<li>48 horas después de la infección, dividir las células en tres platos de 10 cm. Dos platos se utilizará para la verificación de la eliminación del gen neomicina por selección negativa, cultivo de las células que contienen neomicina medio (primer plato) y por Southern blot (segundo plato).</li>
		<li>El tercer plato que contiene el clon para congelación de células y la extracción de RNA de la cultura.</li>
	</ol></li>
</ol>3. verificación de la TERRA-MS2 transcripción expresión por RT-qPCR
<ol><li>Previa verificación de la eliminación del gen de neomicina, realizar extracción de RNA total de clones de TERRA-MS2 con solventes orgánicos (fenol y guanidina isothiocynate solución)21.<ol>
<li>Resuspender el ARN extraído de un plato de 10 cm en 100 μl de agua de dietil pirocarbonato (DEPC).</li>
		<li>Ejecutar 3 μl de ARN en un gel con ácido (MOPS) propanesulfonic denaturating (1% formaldehído que contienen) 1 x 3-(N-Morpholino) para verificar la concentración y la integridad del ARN. También analizar la concentración de RNA usando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Tratar 3 μg de ARN con DNasa I con 1 unidad de la ADNsa I enzima en el volumen de reacción final de 60 μL.</li>
		<li>Incubar la reacción por 1 h a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revertir la reacción y qPCR análisis de transcripción<ol>
<li>Añadir los siguientes componentes a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas: 2 μl de un 1 primer específico de TERRA μm, 1 μl de mezcla de dNTPs (10 mM), 6 μl de DNasa tratados con ARN (correspondientes a ̴300ng RNA). Ajustar el volumen a 13 μl con 4 μL de agua DEPC. Nota: Para que cada RNA a analizar, un segundo tubo que contiene los mismos reactivos pero una cartilla específica de referencia, en vez de primer específico de TERRA, debe estar preparado.</li>
		<li>Calienta la mezcla a 65 ° C durante 5 minutos e incubar en hielo durante al menos 1 minuto.</li>
		<li>Recoger el contenido de los tubos por centrifugación breve y añadir 4 μL de la enzima RT X 5 Buffer, 1 μl 0.1m dithiothreitol (DTT), 1 μl (4 unidades) de inhibidor de la Rnasa y 1 μl de transcriptasa reversa (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Incubar las muestras a 42 ° C durante 60 min, luego use 2 μl de la reacción de RT para análisis de qPCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la mezcla de reacción de qPCR en un volumen final de 20 μl de 10 μl de la mezcla principal de 2 x qPCR, 2 μl de cDNA plantilla, 1 μl de cebador forward (10 μm), 1 μl de cebador reverso (10 μm) y 6 μl de agua.</li>
	<li>Realizar la reacción de qPCR en un termociclador usando protocolos estándar21.</li>
</ol>4. producción de un Retrovirus expresando GFP MS2
<ol><li>Para generar el retrovirus expresando GFP MS2, transfectar 80% confluente phoenix packaging de células con una proteína de fusión de MS2-GFP expresar vectores de retrovirus (pBabe-MS2-GFP PURO) y un gen env expresando el vector (por ejemplo, pCMV-VSVG) con una relación molar de 4:1 de los dos vectores.</li>
	<li>Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo (DMEM había suplementado con 10% SFB, 2 mM L-glutamina y pluma/Strep) con fresco medio que contiene 10mM butirato.</li>
	<li>Incubar durante 8 h a 37 ° C, 5% CO2, a continuación, sustituir el medio por medio fresco de cultivo desde que el virus será recogido.</li>
	<li>Después de 48 h, retire el medio de retrovirus que contienen las células de phoenix. Este medio puede ser utilizado directamente para la infección de clones de TERRA-MS2, en cuyo caso el medio del filtro a través de un filtro de 0.45 μm, agregar polibreno (concentración final de 30 μg/mL) y agregar a las células (en este caso el protocolo continúa en el paso 5). Por otra parte, retrovirus se puede precipitar en un tubo falcon de 50 mL agregando 1/5th volumen 50% PEG-8000/900 mm solución de NaCl y incubando toda la noche a 4 ° C en una rueda de rotor.</li>
	<li>Al día siguiente, las partículas de retrovirus de pellets por centrifugación a 2.000 x g durante 30 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en F12K medio sin suero. Nota: Las partículas de virus pueden se resuspendió en 1/100th del volumen de sobrenadante original. Una prueba de infección debe realizarse para verificar el volumen mínimo de retrovirus necesaria para infectar eficientemente las células.</li>
</ol>5. visualización de TERRA-MS2 transcritos en células vivas
<ol><li>TERRA-MS2 clones y células AGS WT en platos con fondo de cristal de la placa. En el día de la infección, añadir polibreno el medio (concentración final de 30 μg/mL) y los retrovirus expresando GFP MS2.</li>
	<li>Después de 24 horas, descartar el medio que contiene el virus y añadir medio fresco sin rojo de fenol.</li>
	<li>Analizar las células en un microscopio invertido usando el microscopio adecuado. Imagen de las células con un 100 X u objetivo de 60 X con apertura numérica grande (1.4 X) y usando una cámara sensible (EMCCD). Utilizar un sistema de control ambiental para mantener las muestras a 37 ° C y 5% CO2 durante la proyección de imagen.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros que compiten

En este artículo presentamos un método para generar clones de células de cáncer humano que contiene secuencias de MS2 integradas en subteloméricas 15q. Usando estos clones, las moléculas etiquetadas MS2 TERRA transcritas de subteloméricas 15q son detectadas por microscopía de fluorescencia por la expresión de una proteína de la fusión de GFP MS2. Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de TERRA expresado desde una sola células del telómero en la vida de21. En este protocol...

La larga noncoding TERRA de ARN es transcrito desde la región subteloméricas de los cromosomas y su transcripción procede hacia los extremos del cromosoma, que termina dentro de la zona de repetición telomérica1,2. Por esta razón, las transcripciones TERRA consisten en secuencias subtelomeric deriva en su extremo 5' y terminan con repeticiones teloméricas (UUAGGG en vertebrados)3. Importantes roles han sido propuestos para TERRA, incluyendo la formación de la heterocromatina en telómeros4,5, ADN replicación6, promoviendo la recombinación homóloga entre cromosoma termina7,8 , 9, regulación de telomere estructura10y telómeros longitud homeostasis2,11,12,13. Por otra parte, las transcripciones TERRA interactúan con numerosos sitios de extratelomeric para regular la expresión génica generalizada en ratón de células madre embrionarias (ES)14. En consonancia con estas pruebas en situ hibridación de RNA fluorescencia (RNA-pescado) los análisis han demostrado que sólo un subconjunto de las transcripciones TERRA localizar en los telómeros1,2,15. Además, TERRA se ha divulgado para formar agregados nucleares de la localización en los cromosomas X e Y en células de ratón2,16. Estos resultados indican que las transcripciones TERRA experimentan dinámicas complejas dentro del núcleo. Comprender la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción.
El sistema MS2-GFP ha sido ampliamente utilizado para visualizar las moléculas de ARN en las células vivas de varios organismos17,18. Este sistema se ha utilizado previamente la etiqueta y visualizar moléculas TERRA solo telómeros en S. cerevisiae12,19. Mediante este sistema, fue demostrado recientemente que las transcripciones TERRA de levadura localización dentro del citoplasma durante la fase de post-diauxic cambio, sugiriendo que TERRA puede ejercer funciones extranuclear20. Recientemente hemos utilizado el sistema MS2-GFP para estudiar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células de cáncer21. Para ello, se emplea la herramienta de edición de genoma CRISPR/Cas9 para integrar secuencias MS2 en un telómero solo (telomere 15q, de ahora en adelante Tel15q) y se obtuvieron clones expresando tagged MS2 endógeno Tel15q TERRA (TERRA-MS2 clones). La expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (MS2-GFP) que reconoce y se une MS2 ARN secuencias permite visualización de transcripciones TERRA telómero solo en la vida de las células de21. El propósito del protocolo ilustrado aquí es describir en detalle los pasos necesarios para la generación de clones de TERRA-MS2.
Para generar clones de TERRA-MS2, un cassette de MS2 se integra dentro de la región subtelomeric del telomere 15q, aguas abajo del TERRA promotor región y transcripción Inicio. El cassette de MS2 contiene un gen de resistencia a neomicina flanqueado por sitios lox-p, y su integración en subteloméricas 15q se realiza utilizando el sistema CRISPR/Cas9 del22. Después de transfección de MS2 cassette, solo los clones seleccionados e integración subtelomeric del cassette es verificado por PCR, ADN secuenciada y Southern blot. Clones positivos se infectan con un adenovirus que expresan Cre para quitar el marcador de selección en el cassette, dejando solamente secuencias de MS2 y un sitio de solo lox-p en subteloméricas 15q. Expresión de las transcripciones de MS2-tagged TERRA de Tel15q se verifica por RT-qPCR. Por último, se expresa la proteína de la fusión de GFP MS2 en TERRA-MS2 clones mediante infección retroviral para poder visualizar las transcripciones MS2-TERRA por microscopía de fluorescencia. Transcripciones TERRA pueden ser fácilmente detectadas por RNA-peces y proyección de imagen de células vivas mediante telomeric repeat-específico sonda1,2,15,23. Estos enfoques proporcionan información importante sobre la localización de la población total de moléculas TERRA en la resolución de la célula. La generación de clones que contienen secuencias de MS2 en un subteloméricas solo permitirá a los investigadores a estudiar la dinámica de las transcripciones TERRA solo telómeros en las células vivas, que ayudarán a definir la función y mecanismos de acción de TERRA.

<table><tbody><tr><td>Células AGS</td><td>-</td><td>-</td><td>Regalo de Christian Baron (Universit&eacute; de Montr&eacute; al).</td></tr><tr><td>F12K Nut Mix 1X</td><td>GIBCO</td><td>21127022</td><td>Medio de cultivo para células AGS</td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>MT25005CI</td><td>Componente del medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Solución de penicilina y estreptomicina</td><td>CORNING</td><td>30-002-CI</td><td>Componente del medio de cultivo</td></tr><tr><td>celular Suero fetal bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>Componente del medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>GIBCO</td><td>21068028</td><td>medio de cultivo para célula fénix</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>utilizado en la transfección de células fénix</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS) y la precipitación de retrovirus</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S3264</td><td>utilizado en la transfección de células fénix (solución HBS)</td></tr><tr><td>SOLUCIÓN DE TRIPSINA EDTA 1X</td><td>CORNING</td><td>59430C</td><td>utilizado en la división de células</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190250</td><td>solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>Componente del medio de congelación celular (80% FBB y 20% DMSO)</td></tr><tr><td>G-418 Disulfato</td><td>para medio</td><td>G4185</td><td>fármaco de selección para&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución de gelatina Biorreactivo</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G1393</td><td>contenido de placa de ADN de 96 pocillos y placa de congelación</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>10376743</td><td>componente de tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Componente de tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71729</td><td>Componente del tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2546</td><td>Componente del tampón de lisis celular para la extracción de ADN genómico</td></tr><tr><td>ARNasa A</td><td>Thermo Fisher</td><td>12091021</td><td>Degradación del ARN durante la extracción de ADN</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Preparación de gel de ADN</td></tr><tr><td>Atlas ClearSight</td><td>Bioatlas</td><td>BH40501</td><td>Reactivo de tinción utilizado para detectar muestras de ADN y ARN en etanol de gel de agarosa</td></tr><tr><td></td><td>Bioreactivos Fisher BP28184</td><td></td><td>precipitación de ADN</td></tr><tr><td>Acetato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td>Utilizado para la precipitación de ADN a una concentración de 3M pH5.2</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel y sistema de limpieza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Extracción de fragmentos de PCR de gel de agarosa durante el cribado por PCR de clones positivos para neomicina</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>AMBION</td><td>15596018</td><td>Disolvente orgánico utilizado para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>89836</td><td>degradación del ADN genómico a partir de ARN&nbsp;</td></tr><tr><td>La mezcla de dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>utilizada en reacciones RT y PCR</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>707265ML</td><td>utilizada en reacciones RT</td></tr><tr><td>pirocarbonato de dietilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>utilizada para inactivar ARNasas en agua (dilución 1:1000)</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td>Inhibidor de RNasa</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9381</td><td>preparación de gel de ARN</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>15710</td><td>Preparación de gel de ARN desnaturalizante (1% de PFA en 1x MOPS)</td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093 Reacción de</td><td>retrotranscripción</td></tr><tr><td>ADN polimerasa Pfu (recombinante)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0501</td><td>Reacción de PCR</td></tr><tr><td>2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td><td>PCR Reacción</td> de <td>qPCR</td><td>de PB 20.14</td> de BIOSYSTEMS</tr><tr><td>El adenovirus Cre-GFP</td><td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td><td>1174-HT</td><td>se utiliza para infectar clones de TERRA-MS2 con el fin de eliminar el gen neomycn</td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td>utilizado para promover la producción de partículas de retrovirus en células fénix</td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>Precipitación de partes de retrovirus</td></tr><tr><td>35&micro;-Fondo de vidrio</td><td>para platos Ibidi</td><td>81158</td><td>utilizado en análisis de imágenes de células vivas de clones de TERRA-MS2</td></tr></tbody></table>

generación de clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica arn terra de un telómero solo en las células vivas

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Los telómeros se transcriben, dando lugar a telomeric repeat-con larga noncoding RNAs (TERRA), que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la biología telomérica, incluyendo formación de heterocromatina y homeostasis de longitud telomérica. Recientes descubrimientos revelaron que las moléculas TERRA también interactúan con regiones cromosómicas internas para regular la expresión génica en las células madre embrionarias (ES) de ratón. En consonancia con esta evidencia, RNA fluorescencia en situ del hibridación (pescado de RNA) análisis han demostrado que sólo un subconjunto de TERRA transcripciones localización en los extremos del cromosoma. Una mejor comprensión de la dinámica de las moléculas TERRA le ayudará a definir su función y mecanismos de acción. Aquí, describimos un método para marcar y visualizar las transcripciones TERRA solo telómeros en las células cancerosas mediante el sistema MS2-GFP. Para ello, presentamos un protocolo para generar clones estables, utilizando la línea celular del cáncer de estómago humano AGS, con secuencias de MS2 integradas en una sola subteloméricas. Transcripción de TERRA de telomere tagged MS2 se traduce en la expresión de moléculas etiquetadas MS2 TERRA que se visualizan por microscopia de fluorescencia de células vivas sobre la expresión de una proteína de unión a RNA de MS2 fusionada a GFP (GFP-MS2). Este enfoque permite a los investigadores a estudiar la dinámica de las moléculas TERRA solo telómeros en células cancerosas, y puede ser aplicado a otras líneas celulares.

Figura 1 representa un resumen de la estrategia experimental. Los principales pasos del protocolo y un calendario indicativo para la generación de clones de TERRA-MS2 en células AGS se muestran (figura 1A). En el día 1, múltiples pocillos de una placa bien 6 son transfectados con el cassette de MS2 y sgRNA/Cas9 expresando vectores (se muestra en la figura 1B</st...

Aquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre los telómeros, como la localización de ARN TERRA telomérica de levadura, y puedo insistir en que es telómero de origen o en trans, un cromes-mants diferente La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores visualizar moléculas TERRA expresas desde un solo telómero en células vivas. Demostrando el procedimiento serán Claudio Oss Pegorar y Nicole Bettin, dos estudiantes graduados de mi laboratorio. Para comenzar a crecer celdas AGS de acuerdo con el protocolo de texto.Luego, cuando las células alcanzan 50 a 60%confluencia transpect ellos con sgRNA Cas9 expresando vector y el casete MS2. Al día siguiente reemplace el medio de cultivo por un medio que contenga Neomicina. Después de esto añadir 10 microlitros de 0.25%Tripsyn a cada pozo de una placa de 96 pozos.Usando un microscopio y un marcador, marque la posición de cada clon visible en el plato. Sustituya el medio de cultivo de Neomycin por suficiente PBS para formar una película delgada de líquido en los clones. Usando una pipeta de 10 microlitros que contenga cinco microlitros de Tripppsin, libere lentamente el púpsido en la colonia.Permita que el Trypsin desenganche las células durante un minuto. Raspa la colonia con la punta, y succiona la punta. Después de esto, transfiera las células de la colonia a un pozo de la placa de 96 pozos.Incubar el plato durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, llene el pozo con 150 microlitros de medio selectivo. A continuación, añadir 100 microlitros de gelatina a cada pozo de tres placas de 96 pozos.Incubar las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos y lavar las placas con PBS dos veces. Después de que los clones alcancen el 90% de confluencia, aspirar el medio de cada pozo de la placa, y lavar la placa con PBS. Luego agregue 30 microlitros de Trypsin a cada pozo, e incubar la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos.A continuación, añadir 70 microlitros de medio selectivo a cada uno de los pozos. Interrumpir las células pipeteando arriba y abajo. Transfiera 30 microlitros de la mezcla al pozo de la placa de ADN gelatinizada que contiene 120 microlitros de medio selectivo.A continuación, transfiera 30 microlitros de la mezcla a la placa de congelación gelatinizada que contiene 50 microlitros de medio. Coloque el ADN en la incubadora y permita que las células crezcan a 37 grados centígrados hasta que alcancen el 90% de confluencia. Después de esto, agregue 80 microlitros de medio de congelación de hielo a cada pozo de la placa de congelación.Selle la placa con parafilm, reemplace la tapa y envuelva la placa en papel de aluminio. A continuación, mantenga las placas de congelación a 80 grados centígrados. Después de que los clones en la placa de ADN alcancen el 90% de confluencia, lave la placa con PBS dos veces.Luego lice las células con 50 microlitros de tampón de lysis. Cubra la placa con parafilm, reemplace la tapa y envuelva la placa en una envoltura de saran. Después de esto, incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente añadir 100 microlitros de solución de cloruro de sodio de etanol a cada pozo, y permitir la precipitación de ADN durante seis horas o durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, invierta la placa y lávela tres veces con 200 microlitros de etanol 70% por pozo. Añadir 20 microlitros de RNase Una solución a cada pozo de la placa, e incubar la placa a 37 grados centígrados durante una hora.Después de esto, utilice tres microlitros de ADN genómico para amplificación de PCR, y configure la máquina PCR. Haga crecer los clones positivos de PCR en seis placas de pozos de acuerdo con el protocolo de texto. Una vez que los clones alcanzan el 90%confluencia, lavar las células con PBS, y añadir 250 microlitros de tampón de lysis con Proteinase K a cada pozo.Utilice un rascador de células para raspar las células y transfiera el lysate a un tubo de 1,5 mililitros. Incubar el lysate a 37 grados centígrados durante 16 horas. Añadir un mililitro de etanol al lysate, y agitar vigorosamente.Permita que los clones crezcan en medio F-12K de acuerdo con el protocolo de texto. Luego agregue el adenovirus que expresa Cre a las células una vez que alcancen el 70% de confluencia. 48 horas después de la infección, dividir las células en tres platos de 10 centímetros.A continuación, cultivo de los terceros platos para la congelación celular, y la extracción de ARN. En primer lugar, plato los clones TERRA-MS2 y las células de tipo salvaje AGS en platos de fondo de vidrio. A continuación, añada Polybrene y el MS2-GFP expresando retrovirus al medio.Después de 24 horas desechar el medio que contiene el retrovirus, y añadir medio fresco sin rojo fenol a las células. Por último, utilizando un microscopio invertido y una cámara sensible imagen de las células con el objetivo y la apertura adecuados. En este protocolo se crearon y crearon imágenes clones de células cancerosas que contenían una etiqueta de secuencia MS2 en un solo sublomere.Los clones resistentes a la neomicina fueron examinados con PCR. Los clones positivos fueron cultivados en lysed para la extracción de ADN genómico y el análisis de manchas del sur. Los clones positivos para pcR y análisis de manchas meridionales se infectaron con el CRE-GFP que expresa adenovirus con el fin de eliminar el gen de neomicina presente en el casete MS2.Una vez confirmada la eliminación del gen de resistencia a la neomicina, se hizo pruebas de ARN extraídos de los clones para la expresión de transcripciones TERRA-MS2. Con el fin de visualizar las transcripciones TERRA-MS2 en células vivas mediante microscopía confocal, los clones seleccionados se infectaron con un retrovirus que expresaba una proteína de fusión MS2-GFP. Las transcripciones y telómeros TERRA-MS2 se visualizaron simultáneamente en células vivas mediante microscopía confocal mediante la co-expresión de la proteína de fusión MS2-GFP y una proteína de unión a telómeros fusionada con mCherry, TRF2, en los clones seleccionados.Al intentar este procedimiento es importante hacer todo lo posible para seleccionar un solo clon en lugar de una población mixta de clones. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como un FISH de ADN en los spreads cromosómicas, para visualizar la integración del casete MS2 en células fijas. Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de los telómeros exploren la localización celular de moléculas de TERRA de telómeros individuales en células humanas vivas.No olvide que trabajar con vectores virales y materiales radiactivos puede ser extremadamente incierto. Y siempre se deben tomar precauciones, como usar abrigos de laboratorio, guantes y el uso de escudos de plexiglás para minimizar la radiación al realizar este procedimiento.

generation-cancer-cell-clones-to-visualize-telomeric-repeat

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo.  También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares.  En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

Los telómeros y la telomerasa juegan un papel esencial en el envejecimiento y la tumorigénesis. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo generar dos alelos knock-in de telomerasa inducibles en murinos y cómo utilizarlos en los estudios de degeneración/regeneración de tejidos y cáncer.

Utilizando murino Inducible telomerasa alelos en los Estudios de la degeneración del tejido / Regeneración y Cáncer

Aquí, describimos un método de microscopía de lapso de tiempo a largo plazo para rastrear longitudinalmente células individuales en respuesta a terapias contra el cáncer.

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

Reportamos un procedimiento conciso de hibridación fluorescente in situ (FISH) en la gónada y embriones de Caenorhabditis elegans para observar y cuantificar secuencias repetitivas. Observamos y cuantificamos con éxito dos secuencias repetitivas diferentes, las repeticiones de telómeros y la plantilla de alargamiento alternativo de telómeros (TALT).

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) sintetiza la DNA telomeric, pero también ARN bicatenario a través de la actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente. Aquí, describimos un análisis recién creado para detectar actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente del terc endógena.

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Hemos convertido con éxito el ensayo estándar de protocolo de amplificación de repetición de telómeros (TRAP) que se empleara en las reacciones de la cadena de polimerasa digital de gotas. Este nuevo ensayo, llamado ddTRAP, es más sensible y cuantitativo, lo que permite una mejor detección y análisis estadístico de la actividad de la telomerasa dentro de varias células humanas.

TRAMPA digital de gota (ddTRAP): adaptación del Protocolo de amplificación de repetición de telómeros a la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Este protocolo describe una técnica para la generación cíbrida a partir de células cancerosas en suspensión como una herramienta para estudiar el papel de las mitocondrias en el proceso tumorigénico.

Generación cíbrida transmitocondrial utilizando líneas celulares cancerosas

Presentamos un método para estudiar la rediseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares que implica un protocolo quirúrgico para la fotoconversión selectiva de metástasis pulmonares, seguido de la identificación de células tumorales rediseminadas en órganos terciarios.

Seguimiento de la diseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares mediante fotoconversión

Este informe describe un método bioingeniería para diseñar y construir nuevos factores de empalme artificiales (ASFS) que modulan específicamente el empalme de genes diana en células de mamífero. Este método se puede ampliar para diseñar diversos factores artificiales para manipular otros aspectos del metabolismo del RNA.

Factores artificiales de ingeniería para manipular específicamente empalme alternativo en células humanas

Aprende a generar clones de células de cáncer con etiquetas MS2 en subtelómeros específicos para visualizar transcritos TERRA en células vivas mediante microscopía confocal.

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas (Video) | JoVE Journal

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

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