Name: Diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung mediante biopsias de succión rectal Inmunostaining para calretinina, proteína S100 y producto genético de proteína 9,5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprende un protocolo de inmunotinción para biopsias de succión rectal que diagnostica la enfermedad de Hirschsprung mediante calretinina, proteína S100 y PGP9.5. Este método ofrece alta sensibilidad y especificidad en pacientes pediátricos.

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Los autores agradecen a Weibing Tang por su gran ayuda en el suministro del laboratorio de filmación. Este artículo es apoyado por la investigación de bienestar público, y los fondos especiales fueron recibidos de la salud nacional y planificación familiar de China (Grant no. 201402007).

Este protocolo fue aprobado por la Junta de ética de la investigación del hospital de la Unión de la Universidad de ciencia y tecnología de Huazhong.
1. biopsia de succión rectal
<ol><li>Realiza la biopsia de succión rectal por un cirujano pediátrico bien entrenado y un asistente usando un sistema de biopsia rectal de succión Rbi2 después de obtener el consentimiento informado del tutor.<ol>
<li>Realizar RSB en pacientes que tienen las siguientes indicaciones: incapacidad para pasar meconio en lactantes o hinchazón a largo plazo con o sin estreñimiento en niños; niños con estreñimiento a largo plazo que necesiten aceite de parafina para completar la defecación; obstrucción intestinal o perforación intestinal con razones desconocidas en niños sometidos a una enterostomía. Nota: las contraindicaciones para la RSB son las siguientes: los niños que tienen síntomas severos, que están en mal estado físico, o que no pueden tolerarse la RSB; niños con enterocolitis en etapa aguda; niños sometidos a anastomosis intestinal sin curación completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar un enema de retención salina normal como preparación intestinal 36 h antes del procedimiento para evitar heces sueltas y edema excesivo de la mucosa. Añadir solución de sulfato de magnesio si el niño tiene estreñimiento severo. Administrar vitamina K (1 mg/kg) a neonatos. Nota: no realice análisis de sangre preoperatoria ni administre antibióticos, ya que no son necesarios.</li>
	<li>Ponga paciente en la posición de la litotomía. Cubra la superficie del tubo con aceite de parafina. Inserte el tubo de punta Romo de 4-7 cm en el recto con el orificio lateral hacia las paredes posterior o lateral.</li>
	<li>Aplicar una presión suave sobre el tubo para facilitar la adherencia adecuada del orificio lateral a la pared rectal. Presione el gatillo y retire la herramienta inmediatamente.</li>
	<li>Utilice el instrumento de la biopsia para obtener 4 biopsias de succión con un diámetro de 2 mm a 3 cm y 6 cm por encima de la línea dental, anteriormente y posteriormente. Utilice una aguja para colocar la muestra en la gasa humedecida con solución salina.</li>
	<li>Observe al paciente hasta las 2 h después del procedimiento para descartar el sangrado rectal. Evite las manipulaciones rectales y anales en las primeras 24 h después de la RSB.</li>
</ol>2. preparación de las secciones de la RSB
<ol><li>Colocar las biopsias de succión rectal en un 4% de paraformaldehído durante 6 h para fijar el tejido. Utilice un volumen fijador 5 veces más que el volumen del tejido.</li>
	<li>Deshidratar el tejido con el deshidratador de tejido patológico durante 11 h. Todo el proceso programado consta de los siguientes 5 pasos:<ol>
<li>Colocar el tejido en formaldehído y fijarlo por 1 h.</li>
		<li>Colocar el tejido en etanol al 75% durante 4 h.</li>
		<li>Colocar el tejido en etanol absoluto (dos cambios, 1 h cada uno).</li>
		<li>Colocar el tejido en etanol absoluto (dos cambios, 30 min cada uno).</li>
		<li>Colocar el tejido en xileno (tres cambios, 1 h cada uno).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar el tejido en cera de parafina (58-60 ° c) (tres cambios, 1 h cada uno). Incrustar los tejidos de la RSB en bloques de parafina.</li>
	<li>Recorte los bloques de parafina utilizando un microtomo hasta que el tejido quede completamente expuesto con un plano de sección completo.</li>
	<li>Corte los bloques en secciones de 0,4 μm con un microtomo.</li>
	<li>Colocar las secciones en 45-50 ° c de agua durante unos segundos cada una para permitir que las secciones se esparcir en una placa plana.</li>
	<li>Transfiera las secciones de parafina a las diapositivas.</li>
	<li>Hornear las diapositivas en un horno de 60 ° c para 3-5 h. Evite hornear durante demasiado tiempo, lo que puede conducir a la pérdida de los antígenos.</li>
	<li>Coloque las diapositivas del deparaffinized en xileno (2 cambios, 15 min cada uno).</li>
	<li>Hidratar las diapositivas en etanol absoluto, 95%, 80% y etanol al 75% durante 5 min cada una. A continuación, enjuáguelos en osmosis inversa (RO)-agua purificada durante otros 5 min.</li>
</ol>3. recuperación de antígeno
<ol><li>Hacer diluciones de trabajo para la recuperación de calretinin mezclando 4 mL de tampón de recuperación de antígeno EDTA con 200 mL de agua purificada de RO. Hacer diluciones de trabajo para la recuperación de S100 y PGP 9.5 mezclando 1 mL de tampón de citrato sódico de ácido cítrico (100x) con 99 mL de agua purificada de RO. Nota: el calretinin se puede recuperar preferentemente mediante la solución de recuperación EDTA. Sin embargo, el tampón de citrato de sodio ácido cítrico es más adecuado para la recuperación de S100 y PGP 9.5.</li>
	<li>Coloque las diapositivas en un frasco de tinción de cubeta tipo Coplin. Llene el frasco con la solución de recuperación y colóquelo en un baño de agua hirviendo precalentado. Después de hervir durante 20 minutos, retire el frasco del baño de agua y deje enfriar a temperatura ambiente. El proceso de enfriamiento tarda aproximadamente 10 min. Retire las diapositivas y enjuáguelas suavemente una vez con suero salino (PBS) amortiguado con fosfato.</li>
	<li>Dibuje un círculo con un rotulador alrededor del tejido y prepare una caja húmeda para los siguientes procedimientos.</li>
</ol>4. bloqueo
<ol><li>Hacer diluciones de trabajo mezclando 3 mL de 30% H2O2 con 27 ml de agua purificada de ro.</li>
	<li>Añadir dos o tres gotas de 3% H2o2 solución gota a gota en el tejido para bloquear peroxidates. Agregue la solución H2O2 de inmediato para asegurarse de que la solución no se desbordará del círculo. Realizar el bloqueo de peroxidates en una incubadora de 37 ° c durante 20 min.</li>
	<li>Enjuague las diapositivas suavemente con PBS (tres lavados, 5 min cada uno).</li>
	<li>Bloquee las diapositivas durante 20 min a 37 ° c con un 5% de albúmina sérica bovina (BSA, preparada mezclando 1,5 g de polvo de BSA con 30 mL de agua purificada de RO). Nota: el bloqueo con 3% H2O2 puede prevenir el 95% de manchas no específicas y el bloqueo con 5% de BSA puede prevenir el otro 5% de manchas no específicas. Combine los dos métodos para obtener un resultado fiable.</li>
</ol>5. antígeno-reacción de anticuerpos
<ol><li>Retire el 5% de BSA y agregue 50 μL de anticuerpo primario (calretinin, S100, o PGP 9.5) a la diapositiva. Incubar durante la noche a 4 ° c.</li>
	<li>Lave el portaobjetos con PBS (tres veces, 3 min cada uno).</li>
	<li>Añadir 50 μL de potenciador de polímero (reactivo a; ver tabla de materiales) a la sección e incubarlo durante 20 min en una incubadora de 37 ° c. A continuación, lave el portaobjetos con PBS (tres veces, 3 min cada uno).</li>
	<li>Añadir 50 μL de anticuerpo secundario B (anticuerpo secundario IgG de cabra anticonejo/ratón) a la sección e incubar durante 30 min en una incubadora de 37 ° c. Lavar la sección con PBS (tres veces, 5 min cada una).</li>
</ol>6.3, 3-diaminobenzidina y tinción de hematoxilina
<ol><li>Añadir 850 μL de agua purificada de RO a un tubo de 1,5 mL y añadir los reactivos de tinción (ver tabla de materiales) en la orden a, B y C. Añadir 50 μl de cada reactivo para obtener un total de 1 ml de solución de trabajo de 3, 3-diaminobenzidina (DAB). Si hay precipitados, utilice la solución después de la filtración.</li>
	<li>Agregue una gota de solución de trabajo DAB a la sección de tejido y mancha durante 3-10 min. Incubar las diapositivas en DAB a temperatura ambiente hasta que se detecte la coloración marrón. Monitoree cuidadosamente usando un microscopio de campo claro. Mantenga la solución de trabajo DAB alejada de la luz. A continuación, lave la corredera con PBS durante 5 min.</li>
	<li>Agregue una gota de hematoxilina para contrarrestar los núcleos durante aproximadamente 1 min. A continuación, sostenga el frasco de cubeta tipo Coplin y lávelo bajo un goteo de agua durante aproximadamente 30-40 s hasta que se elimine el exceso de tinte. Tenga cuidado de no dañar las secciones de tejido.</li>
	<li>Sumergir las diapositivas RSB en un frasco de cubeta tipo Coplin que contiene PBS para 25-30 s. A continuación, diferenciar en 1% ácido clorhídrico-etanol para 10 s. Lave los portaobjetos con PBS durante 1 min.</li>
	<li>Deshidratar las diapositivas en orden inverso de hidratación: 75%, 80%, 95%, y etanol absoluto (5 min cada uno).</li>
	<li>Exponga las diapositivas a xileno (2 cambios, 5 min cada uno).</li>
	<li>Monte el cobertramiento con un montaje Ultraclean. Deje secar las diapositivas antes de la visualización con un microscopio.</li>
</ol>

<ol><li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung%27s+disease%3A+A+bridge+for+science+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li>
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<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).</li>
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<li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li>
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<li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Stop+Looking%3F+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry%3A+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li>
<li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li>
<li>Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis%3A+a+%26%2334%3Bpositive%26%2334%3B+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &#34;positive&#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).</li>
<li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un procedimiento que utiliza tres anticuerpos inmunohistoquímicos diferentes para teñir secciones de RBS para el diagnóstico de la EH. La sensibilidad de nuestro protocolo de diagnóstico fue del 96,49% (95% CI, 0,88-0.99), y la especificidad fue de 100% (95% IC, 0,97-1.00).
Los pasos más críticos del protocolo son la RSB y la reacción antígeno-anticuerpo. El tamaño de la biopsia determina la precisión de la coloración. Una pequeña biopsia no proporcionará suficiente tejido par...

La enfermedad de Hirschsprung (EH) es un trastorno intestinal congénita común caracterizado por la falta de células ganglionada en diferentes segmentos del tracto intestinal distal1. El sistema nervioso entérico humano se forma cuando se completa la invasión de las células neuronales embrionarias. Si hay una perturbación del proceso y la invasión no se completa, el intestino distal del recién nacido se convierte en aganglionic2. Esta afección potencialmente mortal se denomina enfermedad de Hirschsprung. La proliferación, la motilidad y el crecimiento intestinal son los tres componentes principales de la colonización exitosa.
La tinción de hematoxilina y eosina tradicional (H & E) de una biopsia submucosa limitada no puede alcanzar un resultado tan satisfactorio como la tinción de H & E de un tejido de espesor completo Obtenido de la cirugía. Adicionalmente, la acetilcolinesterasa (AChE) la tinción del tejido de succión rectal es teóricamente desafiante debido a su sensibilidad inadecuada, que es 91%, y el procesamiento complejo de las secciones congeladas3,4. Varios otros marcadores inmunohistoquímicos de células ganglionadas y fibras nerviosas que se pueden teñir en muestras fijas de formol y de parafina se están convirtiendo gradualmente en el principal diagnóstico de la EH. La calretinina es una proteína de unión al calcio dependiente de la vitamina D que no se expresa en el plexo mientérico y submucosa de los segmentos afectados por la EH5. La proteína S100 se expresa en células derivadas de la cresta neural, como las fibras nerviosas y las células gliales, que a menudo presentan hipertrofia neuronal en el tejido submucosa de los segmentos afectados por la EH6. El producto genético de proteína 9,5 (PGP 9.5) Mancha de forma fiable las fibras nerviosas y las células ganglionadas; La tinción PGP 9.5 actúa como un suplemento a la tinción de calretinin, especialmente en casos de hipoganglionosis aislada. La tinción doble con S100 y PGP 9.5 puede disminuir la tasa de falsos negativos y aumentar la sensibilidad. Como requisito previo, el estudio actual tiene como objetivo garantizar la especificidad adecuada y la alta sensibilidad de este novedoso método de diagnóstico. Nuestro nuevo protocolo usó los tres marcadores para la discriminación del intestino agangliónico y las fibras nerviosas hipertróficas. Un estudio prospectivo de 318 niños fue realizado por nuestro laboratorio y publicado previamente sin un protocolo detallado7. El protocolo detallado y las precauciones se discuten en este artículo. Los neonatos que sufrieron un grave problema de defecación desde el nacimiento o los niños con estreñimiento crónico, excluyendo otras enfermedades comunes, son candidatos potenciales para la biopsia de succión rectal (RSB). Nuestro nuevo protocolo es adecuado para la tinción no sólo de RSBs, sino también de biopsias de espesor completo o especímenes quirúrgicos para hacer un diagnóstico final.

<table><tbody><tr><td>anticuerpo de calretinina</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MAB-0716 170416405c</td><td>anticuerpo: anticuerpo primario</td></tr><tr><td>S-100 anticuerpo</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>Kit-0007</td><td>anticuerpo: anticuerpo primario</td></tr><tr><td>anticuerpo PGP9.5</td><td>Shanghai long island antibody Co. Ltd</td><td>R-0457-03</td><td>anticuerpo:</td></tr><tr><td>reactivo potenciador</td> de anticuerpos primarios <td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-A 170416405a</td><td>anticuerpo: anticuerpo secundario A</td></tr><tr><td>anticuerpo secundario IgG anti-conejo/ratón</td> de <td>cabra MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-B</td><td>anticuerpo: anticuerpo secundario B</td></tr><tr><td>Kit de tinción DAB (que contiene reactivo A, B y C)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>DAB-0031</td><td>kit de tinción</td></tr><tr><td>Incubadora de calor</td><td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td><td>DHP-9082</td><td>instrumento</td></tr><tr><td>Rbi2 succión biopsia rectal sistema</td><td>Aus Systems Pty Ltd, Australia del Sur, Australia</td><td>CP1200 HP1000 SS1000</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo</td> de instrumento <td>Leica</td><td>leica RM2016</td><td>instrumento</td></tr><tr><td>tampón de citrato de sodio de ácido cítrico(100X)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MVS-0101</td><td>tampón de recuperación de antígenos</td></tr><tr><td>deshidratador de tejido patológico</td><td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td><td>instrumento</td> <td>JT-12F</td></tr></tbody></table>

diagnóstico de la enfermedad de hirschsprung mediante biopsias de succión rectal inmunostaining para calretinina, proteína s100 y producto genético de proteína 9,5

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

La enfermedad de Hirschsprung (EH) es una enfermedad intestinal congénita que se manifiesta clínicamente como una incapacidad para pasar meconio en lactantes o como estreñimiento a largo plazo en niños. La biopsia de succión rectal (RSB) para determinar la ausencia de células ganglio y la hipertrofia neuronal es la prueba más precisa para el diagnóstico de la EH en la actualidad. La tinción de hematoxilina-eosina tradicional carece de sensibilidad y especificidad. La tinción de la acetilcolinesterasa no puede ser ampliamente utilizada debido a su complejo proceso. Nuestro novedoso protocolo de inmunostón para calretinina, proteína S100 y producto genético 9,5 (PGP 9.5), que realizamos en RSBs, exhibe tasas de alta sensibilidad y especificidad de 96,49% (intervalo de confianza de 95%, 0,88-0,99) y 100% (95% de confianza intervalo, 0,97-1.00), respectivamente. Los segmentos afectados por la EH a menudo se presentan como la ausencia de la expresión de calretinina, proteína S100, y PGP 9.5, que son marcadores de hipertrofia neuronal en el tejido submucosa. Este protocolo describe el proceso operativo detallado de este nuevo método de diagnóstico.

En total, 318 pacientes fueron inscritos en nuestro estudio. Todos los pacientes fueron sometidos a RSB, y los tejidos fueron manchados para calretinin, S100, y PGP 9.5. El diagnóstico basado en nuestro nuevo protocolo fue HD en 97 casos, no HD en 213 casos, y sospecha de EH en 8 casos. Entre los 132 pacientes quirúrgicos, 99 pacientes fueron diagnosticados con EH por inmunostaining de especímenes de espesor completo después de la cirugía. Las manchas S100 y PGP 9.5 mostraron que el 92% y...

Este protocolo describe el proceso de inmunostaining de las biopsias de succión rectal para la calretinina, la proteína S100 y el producto genético de proteína 9,5. Este novedoso método de diagnóstico adyuvante para la enfermedad de Hirschsprung tiene tasas de sensibilidad y especificidad preferibles.

Diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung mediante biopsias de succión rectal Inmunostaining para calretinina, proteína S100 y producto genético de proteína 9,5

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

Este método puede ayudar a responder preguntas en el diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung. El método y las funciones de esta técnica, si sigue el protocolo, exhiben alta sensibilidad y las tasas de especificidad que se procesan al mismo tiempo. Demostrando el procedimiento estará Mijing Fang, un técnico de mi laboratorio.Comience por fijar las biopsias de succión rectal en cinco veces el volumen del tejido en 4%paraformaldehído durante seis horas a temperatura ambiente. Deshidratar los tejidos fijos en un deshidratador de tejido patológico durante 11 horas e incrustar los tejidos de biopsia de succión rectal procesados en bloques de parafina. Recorte los bloques de un microtoma hasta que se exponga un plano de sección completo del tejido.A continuación, utilice el microtoma para obtener una sección de 0,4 micrómetros del tejido incrustado. Colocar en 45 a 50 grados Celsius agua para permitir que las secciones se propaguen en un plano plano. Transfiera las secciones aplanadas en toboganes de vidrio y hornéelos en un horno Celsius de 60 grados durante tres a cinco horas.Coloque los portaobjetos desparafinados en dos cambios de xileno de 15 minutos seguidos de su hidratación en inmersiones secuenciales de etanol de cinco minutos. A continuación, enjuague los portaobjetos con agua purificada de ósmosis inversa durante cinco minutos adicionales. Para la recuperación de antígenos, coloque los portaobjetos en un frasco de tinción de Coplin de solución de recuperación y coloque el frasco en un baño precalentado de agua hirviendo.Después de 20 minutos, deje que el frasco se enfríe a temperatura ambiente durante unos 10 minutos y enjuague suavemente los portaobjetos con PBS. Luego usa un marcador hidrófobo para rodear cada sección del tejido y coloca los portaobjetos en una caja húmeda. Para bloquear cualquier peroxida, agregue dos o tres gotas de 3% de solución de peróxido de hidrógeno en cada tejido y coloque los portaobjetos a 37 grados Celsius durante 20 minutos.Al final de la incubación, enjuague los portaobjetos con tres lavados PBS de cinco minutos seguidos de bloqueo con albúmina sérica bovina al 5% durante 20 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, deseche el exceso de albúmina sérica bovina y etiquete las células con 50 microlitros del anticuerpo primario de interés a 4 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague los portaobjetos con tres lavados de tres minutos en PBS y agregue 50 microlitros de potenciador de polímero a cada diapositiva.Después de 20 minutos a 37 grados Centígrados, lave las diapositivas tres veces en PBS y agregue 50 microlitros de anticuerpo secundario B a cada sección del tejido. Después de 30 minutos a 37 grados centígrados, enjuague las secciones con tres lavados de cinco minutos en PBS y agregue una gota de solución de trabajo DAB recién preparada a cada diapositiva. Cuando se detecte el nivel adecuado de tinción marrón mediante microscopía ligera, enjuague los portaobjetos en PBS durante cinco minutos y manche los núcleos con una gota de hematoxilina durante un minuto.Retire el exceso de mancha bajo un goteo de agua durante aproximadamente 30 a 40 segundos seguido de un lavado de 25 a 30 segundos en PBS fresco. Diferencie los tejidos en etanol ácido clorhídrico al 1% durante 10 segundos seguido de un lavado PBS de un minuto. Deshidrata los portaobjetos con inmersiones de cinco minutos en el orden inverso de hidratación y expone los portaobjetos a dos cambios de xileno de cinco minutos.A continuación, monte el resbalón de la cubierta con un montaje ultra limpio y deje que las diapositivas se sequen antes de su visualización en un microscopio de luz. En este estudio representativo de 318 pacientes con biopsia de sección rectal, 99 pacientes fueron diagnosticados inicialmente por biopsia de sección rectal. Se observaron muchas células ganglionares que expresan calretinin en biopsias de tejido normal.Sin embargo, no se detectaron células ganglionares en ninguna zona del tejido de los segmentos de la enfermedad de Hirschsprung. La inmunostaining S-100 y PGP9.5 reveló troncos nerviosos hipertrofiados en la submucosa del tejido enfermo con sólo tinción granular de algunas ramas del nervio pequeño observadas en el intestino normalmente internado. Al intentar este procedimiento, es importante recordar prestar atención a detalles como el tamaño de las biopsias de succión rectal y el grosor de las secciones.Después de que se desfragmente, esta técnica allanará el camino para las investigaciones en el campo de la cirugía pediátrica para apoyar un diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung.

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Evaluación de la colitis inducida por químicos mediante análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido del colon

Este video muestra la tinción inmunohistoquímica para la proteína S-100 en secciones de biopsia por succión rectal. Las secciones recuperadas de antígeno se bloquean y se tratan con anticuerpos primarios, seguidos de anticuerpos secundarios contra S-100, un marcador de la enfermedad de Hirschsprung. Se añade sustrato cromogénico para teñir las células objetivo. Las muestras se deshidratan y se montan antes de visualizarlas bajo el microscopio.

Tinción inmunohistoquímica de la proteína S-100 en secciones de biopsia por succión rectal humana

Fuente: Ear, P. H., et. al. Establecimiento y caracterización de esferoides tumorales neuroendocrinos del intestino delgado. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra la tinción por inmunofluorescencia de esferoides tumorales neuroendocrinos del intestino delgado. Los esferoides se fijan, permeabilizan y bloquean y luego se incuban con anticuerpos primarios y secundarios. Se añade un tinte a los núcleos de tinción antes de montarlos y visualizarlos bajo un microscopio fluorescente.

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Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

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Un modelo de pouchitis en ratas después de proctocolectomía y anastomosis anal con bolsa ileal y anastomosis con sulfato de dextrano sódico

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Aprende un protocolo de inmunotinción para biopsias de succión rectal que diagnostica la enfermedad de Hirschsprung mediante calretinina, proteína S100 y PGP9.5. Este método ofrece alta sensibilidad y especificidad en pacientes pediátricos.

Diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung mediante biopsias de succión rectal Inmunostaining para calretinina, proteína S100 y producto genético de proteína 9,5 (Video) | JoVE Journal

Diagnóstico de la enfermedad de Hirschsprung mediante biopsias de succión rectal Inmunostaining para calretinina, proteína S100 y producto genético de proteína 9,5

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