Name: Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 23 s
Description: Aprende a desarrollar una plataforma de ensayo de proteasas fluorescente con sustratos de fusión recombinante y cuentas magnéticas de agarosa. Este método permite el cribado de alta producción y se demuestra con la proteasa del virus HIV-1.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el proyecto de "Equipo PHARMPROT" GINOP-2.3.2-15-2016-00044 y, también, financiado por el programa de excelencia institucional de educación superior del Ministerio de capacidades humanas en Hungría, en el marco de la Programa temático de biotecnología de la Universidad de Debrecen. Los autores agradecemos a los miembros del laboratorio de bioquímica Retroviral por su ayuda científica durante el desarrollo del ensayo y también por su paciencia durante el ensayo (especialmente a Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz y Vanda Toldi, la película que aparecen en el fondo del vídeo). Los autores también desean decir especial gracias a Gedeon Richter Plc., especialmente al Dr. Zoltán Urbányi para permitir el trabajo de Beáta Bozóki en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular como investigador invitado. Los autores también desean extender su agradecimiento a György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi y Zoltán Király de la Multimedia y el centro técnico de E-learning de la Universidad de Debrecen la asistencia profesional en audio y video producción.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a las investigaciones industriales y académicas intensivas de enzimas proteolíticas y la constante demanda de plataformas de ensayo de proteasa de HTS-compatible de rápida y asequible en consecuencia, hemos desarrollado una proteasa fluorescente basado en grano magnético ensayo. El ensayo se basa en el uso de proteínas de fusión recombinantes que pueden ser nuevas alternativas a los sustratos ampliamente utilizado péptidos sintéticos.
En el formato de ensayo desarrollado, los substratos de la proteína de fusión se inmovilizan a las superficies de agarosa magnético recubierto de quelato Ni granos. La fijación del sustrato es proporcionada por la N-terminal su etiqueta de afinidad6 de la proteína de fusión, que está unida directamente a una etiqueta MBP para facilitar el plegado y mejorar la solubilidad en agua del sustrato13. La MBP es seguido por el escote de TEV PR y una proteasa de interés. El primero puede servir como un sitio de la hendidura de control en el ensayo, mientras que estos últimos pueden ser procesados por la proteasa para ser investigado. El sitio de la hendidura es intercambiable; una codificación de secuencia corta dsDNA en el sitio de clivaje de interés puede insertarse en el 'clonación casete flexible' del plásmido de expresión por la ligadura. Las proteínas de fusión recombinantes contienen una etiqueta altamente estable, monomérico proteína fluorescente en la terminal C, que permite la detección del punto final de las enzima liberada, fluorescentes C-terminal escote productos lanzados sobre clivaje proteolítico ( Figura 1A). Los sustratos intactos fluorescentes purificados en buffers diferentes también se utilizan para la calibración para evaluar las concentraciones molares de sustratos y productos de escote. Además, después de la fluorimetría, los componentes del ensayo pueden ser analizados por SDS-PAGE, también. Ambos nativos (nondenatured) y desnaturalizadas proteínas fluorescentes se pueden visualizar en el gel, inmediatamente después de la electroforesis o posterior renaturalización en gel, respectivamente. Este adicional procedimiento en combinación con un convencional azul brillante de Coomassie de tinción puede ser utilizado eficientemente para la verificación de los resultados del ensayo (figura 1B).
El procedimiento del ensayo consiste en pasos simples y fáciles de ejecutar en un formato de bajo volumen que puede ser totalmente adaptado a un entorno automático de alto rendimiento. Sin embargo, independientemente de la realización del análisis ya sea manualmente o con un sistema de automatización, las siguientes partes del ensayo se consideran crucial y necesitan una atención especial al realizar el procedimiento. i) homogeneidad de la solución grano magnético. Una solución homogénea de grano magnético debe utilizarse durante todo el ensayo, tanto en la purificación y pasos de lavado. Particularmente, la fiabilidad de los ensayos de proteasa depende en tomar correctamente las soluciones stock de grano magnético sustrato Unido (SAMB). Con el fin de aumentar la eficacia de la suspensión y dispersión, se recomienda establecer la concentración de grano entre 2% y 10% (v/v). Durante la preparación de la muestra, el uso de buffers complementados con detergente no iónico (como Tritón X-100 o Tween 20) hasta el 2% también puede disminuir la adherencia de las bolas magnéticas a las superficies de plástico. La adherencia de los granos a las paredes de las cubetas puede evitarse si las suspensiones de grano se aplican cuidadosamente a la parte inferior de los frascos en lugar de en las paredes de los tubos de muestra. La homogeneidad de las bolas magnéticas durante la reacción enzimática también es crítica y puede garantizarse agitando continuamente las muestras a 600 rpm durante la incubación. Granos correctamente se dispersan en mercancías plásticas redondeadas o fondo plano, aunque no se recomienda el uso de viales V-fondo. Un resultado subóptimo causado por la homogeneización inadecuada del grano está representado en la Figura 4B. II) terminación de las muestras de la reacción.  Otra ventaja del método es que la reacción enzimática puede ser terminada sin el uso de tratamiento de la desnaturalización de calor o cualquier potencialmente interferentes químicos15. La terminación puede realizarse simplemente separando las bolas magnéticas de la mezcla de reacción, utilizando un concentrador de partículas magnéticas convencionales. Mientras que el buffer de reacción quitado contiene la enzima activa y los productos generados de escote fluorescente C-terminal, los sustratos uncleaved permanecen adheridos a los granos. Debido a la presencia de la enzima activa en el buffer de reacción, el procedimiento de separación debe realizarse cuidadosamente para la detección del punto final confiable. Antes de colocar los frascos de muestra en el concentrador, se recomienda aplicar un centrifugado Centrifugado corto. Después de colocar los tubos en el concentrador, proporcionar por lo menos 15 s para los granos a recogerse. Leve movimiento de atrás y el separador puede facilitar la recolección de los granos. Por favor tener en cuenta que, durante una separación realizada manualmente, la terminación generalmente toma más tiempo que la iniciación de las reacciones. Por lo tanto, un retraso de minutos registrados aproximadamente 2 se recomienda entre las iniciaciones si al mismo tiempo de incubación debe ser aplicado a todas las muestras.
El principio del ensayo descrito proteolítico es relativamente simple; sin embargo, la versatilidad del sistema está garantizada por la estructura del sustrato flexible y estable. La optimización individual del ensayo puede ser limitada sólo por la compatibilidad de los granos de afinidad con las condiciones aplicadas, reactivos y aditivos. De acuerdo con el protocolo del fabricante, también se encontró que la afinidad de unión de los sustratos a las superficies de grano Ni-NTA sustancialmente debilita a pH ≤ 6.515. Por lo tanto, se recomienda aplicar las muestras en blanco de sustrato paralelas a las muestras de reacción y la tasa de disociación espontánea sustrato debe considerarse durante la evaluación de resultados.
En esos casos, donde no se puede realizar ensayos magnéticos del grano debido a la utilización de componentes de grano-incompatible o un pH bajo, puede aplicarse también en la solución digestión de los sustratos recombinantes purificadas. En estos casos, las mezclas de reacción pueden ser analizadas por electroforesis y se pueden visualizar las proteínas en el gel basado en el protocolo descrito. Para investigar actividad proteolítica, digestión en solución y en gel-detección de las proteínas también pueden ser herramientas alternativas de fluorimetría. Como novedad, el sistema de sustrato diseñado es la aplicación de un paso de renaturalización en gel después de desnaturalizantes SDS-PAGE. Mientras que las proteínas nativas de fluorescentes (nondenatured) su fluorescencia durante la electroforesis, se suprime la propiedad fluorescente sobre desnaturalización (figura 7B). Sin embargo, la fluorescencia de proteínas desnaturalizadas puede recuperarse parcialmente por la eliminación de la SDS del gel. Así, una separación de componentes de la reacción usando condiciones de desnaturalización permite no sólo basada en la fluorescencia pero la identificación molecular basada en el peso. Otra ventaja de la detección en gel fluorescente en comparación con el análisis de un gel teñido de Coomassie es que las proteínas fluorescentes (nativo o renatured) pueden ser fácilmente identificadas en el gel basado en su fluorescencia (ver figura 7). Esto puede ser importante si se realizan reacciones de escote en las muestras que contienen contaminantes nonfluorescent o proteínas muy parecidas a los pesos moleculares de cada uno.
Proteasa ensayos utilizando semejantemente diseñados sustratos ya han sido publicados con anterioridad8,9,10, y aunque el sitio de la hendidura de interés en esos casos también se encuentra entre una etiqueta de afinidad y un proteína fluorescente, el sistema de análisis presentado aquí no sólo repite las ideas descritas pero combina las distintas ventajas de las plataformas anteriores y también se completa con otras mejoras: i) la utilización de un socio de fusión MBP, ii) el presencia de un sitio de la hendidura de TEV PR control, iii) el uso de la nueva ingeniería FPs monomérica y iv) la aplicación de un procedimiento de calibración de sustrato único. El ensayo sí mismo fue diseñado especialmente para ser útil para la especificidad de la enzima y estudios cinéticos en un lugar seguro, forma y costo-eficiente, sin necesidad de instrumental costoso. El método pretende ser una herramienta conveniente y asequible para ambos propósitos de investigación académica e industrial. Debido a la flexibilidad de la cassette de clonación del plásmido de expresión, el sistema puede ser adecuado para la generación rápida y barata de bibliotecas sustrato recombinante. El ensayo descrito en el presente documento es una herramienta factible para la aplicación de la especificidad de sustrato, mutagénesis de la enzima, y la inhibición de estudios y, también, proporcionar una herramienta alternativa para realizar la cinética de la enzima. La plataforma de ensayo (de la interrupción de la célula bacteriana a la determinación de los parámetros cinéticos) puede ser adaptada a un entorno basado en HTS y automatización y, potencialmente, puede aplicarse en la detección de inhibidor de la proteasa industrial o antivirales desarrollo. Además, la adaptación del ensayo de proteólisis competitivo es también en el futuro alcance de nuestro laboratorio. En un ensayo competitivo dos diferentes sustratos, cada uno que contiene un sitio de la hendidura diferentes fundido a un diferente terminal C fluorescente etiqueta-están destinado a ser utilizados simultáneamente en la misma reacción de hendidura para investigar la preferencia de los estudiados enzima para las secuencias de dada. Además, el uso de una forma de análisis adaptado de placa de 96 pocillos (figura 8) también está siendo optimizado para investigación de la mutación usando una serie de sustratos con secuencias del sitio de escote modificado en el caso de las proteasas de cisteína.

Las enzimas proteolíticas pertenecen a los grupos más intensivamente investigados enzima debido a su importancia en las vías metabólicas y en aplicaciones industriales, así como. Su papel clave en enfermedades virales, la regulación de la coagulación, cáncer y cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas proteasas objetivos prominentes en el campo del descubrimiento de fármacos. Por lo tanto, la caracterización detallada de la especificidad de sustrato y perfiles de inhibidor de la proteasa (PR) de interés es fundamentales y se realizan preferiblemente por ensayos bioquímicos rápidos, costo-eficiente y robusto1,2, 3.
Hoy en día, la gran mayoría de proteasa in vitro ensayos en el campo del descubrimiento de fármacos para perfiles compuestos son homogéneo, fluorescente basados en péptidos y alto rendimiento screening (HTS)-plataformas compatibles4. Por otra parte, péptidos marcados no sólo son adecuados para la investigación de la biblioteca, pero también ofrecen excelentes herramientas para la determinación de la enzima parámetros cinéticos en los substratos seleccionados. En otros casos, donde no es posible etiquetado del sustrato, ensayos de separación pueden proporcionar una solución posible para evaluar las propiedades cinéticas de las reacciones proteolíticas3.
Generalmente, los ensayos in vitro de la proteasa se basan en el uso de dos tipos de sustrato: corta péptidos o proteínas enteras. En esos casos, donde la ruptura de secuencias peptídicas cortas reflejan las propiedades de escote suficientemente, son aplicables los métodos estándar siguientes: (i) examen de sustratos estándar de proteína como la insulina oxidada cadena B, (ii) pruebas sustratos disponibles en el mercado de otras proteasas, (iii) bibliotecas de péptidos sintéticos y fluorescencia etiquetada creadas por química combinatoria, o (iv) de detección mediante métodos genéticos, por ejemplo, biológico Mostrar tecnologías5, 6. Además de la clasificación convencional, otras novedosas plataformas están también disponibles para la generación de sustrato (por ejemplo, la formación de péptidos derivados del proteoma bibliotecas7 o subtipos especiales de métodos genéticos, como la fusión recombinante sustratos a base de proteína8,9,10,11,12).
Todos los análisis y tipos de sustrato antes mencionados tienen sus propias ventajas y limitaciones, y el desarrollo de formatos de ensayo combina y mejora las ventajas de las plataformas conocidas todavía está en demanda. Aquí se describe un protocolo para un ensayo fluorescente basado en la separación de la proteasa, que utiliza sustratos recombinantes. Estas proteínas de fusión consisten en su6 y etiquetas MBP fusionados a un sitio de la hendidura del control de la TEV, que es seguido por la secuencia de sustrato de interés que está conectado directamente a una proteína fluorescente C-terminal (FP) (figura 1A). La clonación de una secuencia de ADN que codifica para un sitio de la hendidura de interés dentro del cartucho de' clonación' puede ser realizada por una reacción de la ligadura sola en el plásmido de expresión, que ha sido linealizado previamente por endonucleasas de restricción.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> Figura 1: Principio de la prueba de la proteasa fluorescente. Proteasa (A) la representación esquemática de un sustrato fluorescente y su escote por el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se muestra. La flecha indica la posición de la hendidura dentro de la secuencia de sitio de clivaje de matriz/cápside de proteasa VIH-1 (VSQNY * PIVQ). (B) los fluorescentes substratos pueden utilizarse para analizar reacciones enzimáticas por el ensayo basado en grano magnético de Ni-NTA y por electroforesis en gel de poliacrilamida, así, como se muestra en el diagrama de flujo de trabajo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Aunque proteolíticos ensayos utilizando la proteína recombinante similar sustratos que contienen una etiqueta de afinidad, un sitio de clivaje proteolítico y un proteína fluorescente-tener ya se han descrito8,9,10, el sistema presentado aquí tiene la intención de integrar y mejorar las ventajas de estos métodos. Una diferencia importante es que los sustratos de la proteína de fusión en esta plataforma de análisis están equipados con MBP para mejorar la solubilidad de proteína13 y contienen un sitio de la hendidura de control para TEV PRs. Por otra parte, los sustratos contienen proteínas fluorescentes de nueva generación, que son muy estables y tienen una forma monomérica para prevenir la agregación de sustrato. Además de la aplicación previamente publicada de formas mTurquoise2 y arce-fusionados con14, aquí también mostramos resultados obtenidos con el uso de un sustrato recombinante que contiene un monómero mejorado etiqueta fluorescente de la proteína amarilla fluorescente (mEYFP). Por este medio nos demuestran la compatibilidad del sistema con otras proteínas fluorescentes y representan algunos tipos generales de resultados que pueden ser adquiridos por el ensayo de la proteasa.
Las proteínas de fusión recombinantes se expresan en células de e. coli BL21(DE3) y se utilizan como substratos para el ensayo en un ácido nitrilotriacético níquel (Ni-NTA)-cubierto de forma magnética agarosa-grano-conexión. Los productos de hendidura terminal C se liberan de la superficie del grano en el sobrenadante con escote por la proteasa de interés. Después de la separación del sobrenadante (que contiene la enzima y los productos de la hendidura) de las bolas magnéticas, la fluorescencia puede ser medida para determinar las propiedades de la hendidura de la enzima. En contraste con los métodos anteriormente descritos, en el sistema presentado aquí, las cantidades de sustrato y productos de hendidura terminal C son únicamente cuantificó basado en un procedimiento de calibración detallada del sustrato. El sistema de ensayo puede ser apoyado por un análisis de SDS-PAGE de las muestras de ensayo; una posterior visualización fluorescente de en gel puede ser aplicada inmediatamente después de la electroforesis o después de la renaturalización en gel de los componentes fluorescentes nondenatured y desnaturalizados, respectivamente14.
La flexibilidad y la estructura de la cinta' clonación' permite una inserción y costo-eficiente de una gran variedad de secuencias en la construcción y, por lo tanto, promueve la generación de bibliotecas de sustrato. Puesto que todos los pasos de análisis son automatización y HTS-compatible, el sistema puede ser especialmente atractivo para, por ejemplo, proteasa especificidad mediciones y estudios de mutagénesis o se puede también utilizar eficazmente para la detección de inhibidor de la proteasa industrial o desarrollo de drogas antivirales.
Parámetros cinéticos de la enzima (kcat, Km) pueden ser determinados por el análisis desarrollado basado en la separación; por lo tanto, puede ser conveniente llevar a cabo medidas cinéticas de la enzima individuales, tales como los estudios del curso del tiempo, dependiente del sustrato y la inhibición. Esto demuestra que los substratos de la proteína de fusión recombinante ofrecen buenas alternativas para los sustratos de oligopéptido sintético utilizado con frecuencia, y debido a su alta similitud a los sustratos de la poliproteína, que representan la natural las interacciones enzima-sustrato con mayor precisión.

<table><tbody><tr><td>Tubos 10K Amicon</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilamida/Bis solución 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>SERVA</td><td>11404.04</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Imager HP sistema de documentación de gel</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman Coulter Allegra X-22</td><td>Beckman Coulter</td><td>392185</td><td></td></tr><tr><td>Negro placas de media superficie</td><td>Greiner bio-One</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Tampón CutSmart (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>Para la linealización de plásmidos (paso 1.1.1)</td></tr><tr><td>Transiluminador Dark Reader</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-45M</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2&nbsp; partícula magnética&nbsp; concentrador</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3) células competentes&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merc-Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético&nbsp; (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td></td><td></td>798681</tr><tr><td>Tinte de carga de gel, púrpura (6X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>356350</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.) &nbsp;</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plásmido de alta velocidad</td><td>GeneAid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&NBSP;</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Jouan CR 412</td><td>Jouan</td><td>CR412</td><td></td></tr><tr><td>Labinco LD-76 Rotador&nbsp;</td><td>Labinco</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) caldo</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>MERCK eurolab baño ultrasónico</td><td>MERCK</td><td>USR54H</td><td></td></tr><tr><td>Millifuge Centrífuga de espín Eppendorf</td><td>Millipore</td><td>CT10</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Célula de electroforesis</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF endonucleasa de restricción</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131L</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de níquel (II) (NiSO4)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.) &nbsp;</td><td></td><td></td>656895</tr><tr><td>Perlas de agarosa magnética Ni-NTA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>36113</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Biosan</td><td>OS-20</td><td></td></tr><tr><td>PacI endonucleasa de restricción</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>PageBlue Solución de tinción de proteínas&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>24620</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonil-fluoruro (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Protein Lobind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Snijders Agitador Press-to-Mix&nbsp;</td><td>Gemini</td><td>34524</td><td></td></tr><tr><td>Trihidrato de acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.)&nbsp;</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Tinción de gel de ácido nucleico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>Promega</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Termo agitador</td><td>Biosan</td><td>TS-100</td><td>con bloque de accesorios SC-24</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.) &nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich (San Luis, MO, EE. UU.) &nbsp;</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>WALLAC VICTOR2 1420 mostrador multietiqueta</td><td>Wallac Oy, Turku, Finlandia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Las proteasas son enzimas estudiadas intensivamente debido a su papel esencial en varias vías biológicas de organismos vivos y en la patogenia; por lo tanto, son objetivos importantes de la droga. Hemos desarrollado una plataforma de ensayo magnético-agarosa-grano-basado para la investigación de la actividad proteolítica, que se basa en el uso de substratos de la proteína de fusión recombinante. Para demostrar el uso de este sistema de ensayo, un protocolo se presenta en el ejemplo de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) proteasa. La plataforma de ensayo introducido puede ser utilizada eficientemente en la caracterización bioquímica de las proteasas, incluyendo mediciones de actividad enzimática en mutagénesis, cinética, inhibición o estudios de especificidad, y que puede ser conveniente para alto rendimiento cribado del sustrato o puede ser adaptado a otras enzimas proteolíticas.
En este sistema de ensayo, los sustratos aplicados contienen maltosa vinculante proteínas (MBP) etiquetas y N-terminal hexahistidine (sus6), sitios de la hendidura para el tabaco etch virus (TEV) y las proteasas del VIH-1 y una proteína fluorescente C-terminal. Los sustratos pueden producir eficientemente en células de Escherichia coli y purificaron fácilmente usando granos recubiertos - quelato - níquel (Ni). Durante el ensayo, el clivaje proteolítico de sustratos de grano Unido conduce a la liberación de fragmentos fluorescentes escote, que puede ser medida por fluorimetría. Además, las reacciones de la hendidura pueden ser analizadas por electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE). También se describe un protocolo para la renaturalización en gel de los componentes del ensayo, como parcial renaturalización de proteínas fluorescentes permite su detección basado en peso molecular y de la fluorescencia.

Figura 1A se muestra la estructura esquemática de un sustrato de proteína recombinante fluorescente representativos que puede ser procesado por VIH-1 PR en su secuencia de sitio específico escote. Figura 1B representa la producción de sustrato y sus posibles aplicaciones en el análisis de la proteasa, incluyendo análisis basado en grano magnético de Ni-NTA o página.
Para obtener datos fiables por fluorimetría, un procedimiento de calibración se requiere, con el fin de determinar las cantidades de substratos fluorescentes y productos de escote. Para ello, los valores de intensidad de fluorescencia de los distintos sustratos en las condiciones de amortiguamiento diferentes necesitan ser medido y deban ser correlacionados a sus concentraciones en el intervalo de concentraciones ensayado (figura 3). Los valores de la pendiente de las curvas de calibración pueden aplicarse para determinar las cantidades de substratos y productos de escote en las muestras de ensayo. Las pendientes de las curvas de calibración son independientes de las secuencias del sitio de escote insertadas en los sustratos (tabla 11) y pueden potencialmente ser utilizadas para una serie de sustratos sobre el mismo tipo de proteína fluorescente. Zoom en los gráficos se muestran para que todos regresiones lineales, para ampliar las gamas más bajas de concentración así (figura 3). Es importante tener en cuenta que la calibración debe realizarse con cuidado ya que una adecuada distribución de los puntos de datos se requiere para una calibración confiable. Por esta razón, se aplica la doble dilución seriada para preparar las muestras para la calibración, porque el valor de R2 indica una buena correlación entre la concentración de proteína fluorescente y fluorescencia sólo si un número suficiente de puntos de datos se han utilizado para cubrir el rango de toda concentración. Además, los errores experimentales altamente pueden afectar la precisión de la calibración; por lo tanto, una evaluación gráfica de las líneas de regresión puede ser también necesaria.
Una variedad de mediciones enzimáticas puede realizarse por el análisis de la proteasa, incluyendo un examen del efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción (Figura 4A). Por regresión no lineal, los datos pueden ser utilizados para determinar parámetros cinéticos de la enzima (por ejemplo, vmax y Km). Una suspensión suficiente grano y dispersión y una terminación inadecuada reacción pueden provocar resultados subóptimos (Figura 4B), que no son adecuados para el cálculo de valores cinéticos de la enzima confiable.
Una dependencia de la formación del producto a tiempo puede determinarse por el análisis (figura 5A) (por ejemplo, durante la optimización de los parámetros de reacción de hendidura). La actividad enzimática en presencia de un inhibidor puede ser también investigados (figura 5B) para la determinación de la concentración de enzima activa y constante de inhibición. Utilizando la misma metodología, efectos de otros inhibidores de también pueden ser examinados por el análisis.
El ensayo de proteasa es útil al investigar los efectos del pH sobre la actividad enzimática, así. Figura 6A representa la dependencia de la actividad enzimática de pH por el ejemplo de la TEV, que tiene un pH óptimo amplio rango (pH 6-9). Si se estudia la dependencia del pH de la actividad de la enzima o enzimas con un grado óptimo pH ácido necesitan para medirse, es necesario considerar que la afinidad de unión de sustratos recombinantes a los granos puede estar restringida a un pH ligeramente ácido. Una elevada disociación de los substratos de los granos (Figura 6B) puede provocar una distorsión de los resultados del ensayo. Para considerar la disociación espontánea del substrato de los granos, los valores medidos para las muestras de reacción necesitan ser corregido por los de las muestras de B.
La figura 7 muestra que las proteínas fluorescentes nondenatured pueden ser distinguidas del gel basado en sus colores, con transiluminación luz azul (Figura 7A). Si es necesaria la determinación de los pesos moleculares de los fragmentos de sustratos/escote, desnaturalizar condiciones puede usarse para la preparación de la muestra, debido a proteínas fluorescentes pueden ser parcialmente renatured en el gel y pueden ser detectadas por iluminación UV (Figura 7B) o Coomassie tinción (figura 7). Si se analizan las muestras de R, solamente los productos de la hendidura del c-terminal son visibles (figura 7), mientras que los fragmentos de hendidura de la N-terminal y los sustratos uncleaved permanecen adheridos a los granos. En ocasiones, las proteínas pueden desnaturalizarse parcialmente a pesar de utilizar condiciones nondenaturing (figura 7), y mientras que las proteínas nondenatured son más abundantes, formas desnaturalizadas también detectables en la muestra. Este fenómeno no influye en la detección de clivaje proteolítico pero debe considerarse en el caso de densitometría cuantitativa de muestras nondenatured.
Aunque la descripción detallada se muestra solamente para un ensayo 2 mL tubo-basados, el ensayo puede ser adaptado para un 96 pocillos placa de sistema (figura 8), que ya ha sido probado con éxito en nuestro laboratorio (no mostrado). El formato adaptado de placa de 96 pocillos es totalmente compatible con el fluorimétrico y análisis electroforéticos, así, y también pueden evaluar los datos obtenidos basados en los métodos descritos en este documento.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> Figura 3 : Curvas de calibración. Curvas de calibración de sustrato representativo se demuestran con el ejemplo de dos sustratos recombinantes fusionado a diferentes etiquetas fluorescentes C-terminal: (A y B) su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 y (C y D de ) Su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zoom en figuras también aparecen para representar la regresión lineal de los puntos de datos en el 0.005 0 rango de concentración de sustrato de mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> Figura 4 : Determinación de parámetros cinéticos de la enzima. Se realizaron medidas cinéticas dependiente del sustrato por VIH-1 PR (en una concentración final activa de 41,2 nM). Los valores de velocidad inicial se traza contra la concentración del substrato y se realizó un análisis de regresión no lineal de Michaelis-Menten. Las barras de error representan SD (n = 2). (A) A un resultado óptimo representante se muestra con el ejemplo de su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple sustrato de proteína de fusión. (B) un representante resultado subóptimo se muestra también su6- MBP-KARVL * sustrato AEAM-mTurquoise2, donde el ajuste de concentraciones de sustrato adecuado era problemático debido a una insuficiente homogeneización de la solución madre de SAMB , mientras que los errores relativamente altos fueron causados por la terminación de la reacción incorrecta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> Figura 5 : Estudio curso del tiempo e inhibitorio. (A) Su 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP sustrato de proteína de fusión recombinante (a una concentración final de 0,00326 mM) fue dividido por el VIH-1 PR (en una concentración final activa de 41,2 nM), y la liberación de fragmentos proteolíticos de fluorescente PIVQ-mEYFP se midió a realizar un análisis del curso del tiempo. Las mediciones se llevaron a cabo en cinco diferentes puntos temporales. Las barras de error representan SD (n = 2). (B) su6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP se utilizó como sustrato (a 0,0015 mM) para determinar el efecto inhibitorio de amprenavir en la actividad del VIH-1 PR (en una concentración total de 163.8 nM). Por trazado podrían evaluarse los datos, la media máxima concentración inhibitoria (IC50) y la concentración de enzima activa (una concentración activa final de 41,2 nM) de los VIH-1 aplicada podría también calcularse en base a la curva de inhibición. Las barras de error representan SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> Figura 6 : Estudio de dependencia de la actividad enzimática y la disociación espontánea del sustrato en pH. (A) el su6- MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 sustrato (0,033 mM) se utilizó para medir la actividad enzimática de la TEV (en una concentración total final de 91.42 nM) en escote buffer a un pH diferente, entre el rango de 6.5-8.5. Las barras de error representan SD (n = 2). Los datos trazados ha sido publicado previamente14. (B) basada en los valores de intensidad fluorescente relativa de las muestras en blanco del substrato, la disociación espontánea de su6- MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 sustrato (0,033 mM) de las bolas magnéticas se estudió utilizando buffer de escote con un pH diferente, entre 6.0-8.5. Los datos trazados ha sido publicado previamente14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> Figura 7 : Detección de proteínas en el gel por métodos diferentes. (A) Uncleaved y sustratos de proteína de fusión de VIH-1 PR-digerido después de la preparación de la muestra nondenaturing se visualizaron por transiluminación luz azul después de SDS-PAGE. La reacción de hendidura fue realizada por solución en la digestión. (B) inmediatamente después de la página, sólo nondenatured proteínas se podían detectar en el gel por iluminación UV, mientras que después del retiro de la SDS, las proteínas fluorescentes previamente desnaturalizadas se convirtieron parcialmente renatured y perceptibles. Las muestras se prepararon de los sobrenadantes del ensayo basado en grano magnético Ni-NTA. (C) tinción de Coomassie puede emplearse para la detección de la proteína, después de la renaturalización en gel. El SDS-presente en el gel-mayo causan la desnaturalización parcial de la proteína nativa, pero en muestras de nativas, las formas nondenatured son más abundantes. Las muestras se prepararon de los sobrenadantes del ensayo basado en grano magnético Ni-NTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> Figura 8 : 96 pocillos placa-adaptación de la plataforma de análisis. (A) el ensayo puede realizarse no sólo en tubos de 2 mL pero en los pocillos de una placa de 96 pocillos, así. A continuación os mostramos la representación esquemática para la aplicación del análisis estudiar la especificidad de una proteasa ficticia utilizando una serie de sustratos fluorescentes, que pueden contener wild-type (wt) o transformada (mut-1 a mut-4) secuencias del sitio de clivaje. Para el manejo de las bolas magnéticas, un concentrador de partículas magnéticas compatible de 96 pocillos (MPC) debe ser utilizado en los experimentos. Todos los volúmenes indicados están relacionados con un solo pozo. Para comparar la eficacia de la hendidura de los distintos sustratos, conversión de sustrato puede evaluarse desde el porcentaje de valores RFU sustrato-corregida de las muestras de reacción, teniendo en cuenta los valores RFU sustrato-corregida de los correspondientes muestras de control de sustrato como 100. (B) después de fluorimetría, los sobrenadantes separados del ensayo las muestras pueden analizarse también por página y los componentes de proteína fluorescente pueden ser analizadas directamente o después de la renaturalización de la gel-en el caso de nondenaturing y desnaturalización de la muestra preparación, respectivamente. También se ilustran los tres tipos de muestra de ensayo diferentes en cada figura: C = sustrato control, B = sustrato en blanco y R = reacción. Sustrato control muestras en tampón de elución, mientras que el substrato blanco y las muestras de reacción son en tampón de escote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tampón de</td>
			<td>Proteína fluorescente</td>
			<td>CV % de pendientes (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elución</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>Escote</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elución</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10,92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Escote</td>
			<td>12,68</td>
		</tr>
</tbody></table>Cuadro 11: coeficiente de valores de variación (CV %) de las pendientes de las curvas de calibración de substrato. Para probar si la fluorescencia de los substratos de la proteína recombinante es dependiente en el sitio de clivaje insertado, calibraciones fueron realizadas por serie de mApple y mTurquoise2-fusionados con sustratos (seis variantes para cada uno, que contiene el sitio de la hendidura diferentes secuencias de proteasa VIH-1), ambos en tampones de elución y escote. Se encontró que valores de % CV de las laderas son menos 15% en todos los casos, lo que implica que una calibración del mismo sustrato puede utilizarse para la evaluación de las diferentes mediciones realizadas por variantes del sustrato que contiene la misma etiqueta fluorescente.

Aquí, presentamos el procedimiento detallado de una plataforma de ensayo de proteasa recientemente desarrollado utilizando N-terminal hexahistidine/maltosa-proteína y sustratos recombinantes fusionado a la proteína fluorescentes Unidos a la superficie de níquel nitrilotriacético perlas de agarosa magnética ácido. Un posterior análisis en gel de las muestras de ensayo separados por electroforesis dodecyl del gel del sulfato-poliacrilamida del sodio también se presenta.

Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Las proteasas son uno de los grupos más investigados de apoyo biomolecular en la investigación académica e industrial. Su poderoso papel en varios procesos fisiológicos y patológicos los convierte en un objetivo prominente en el campo del descubrimiento de fármacos también. En cuanto a su intensa investigación, existe una gran y continua demanda para el desarrollo de plataformas de ensayo de proteasa compatibles con cribado de alto rendimiento y tiempo.Aquí, nos gustaría introducir un protocolo para la aplicación de una plataforma de ensayo de fluorescencia compatible con cribado de alto rendimiento basada en la separación utilizando sustratos de proteasa de fusión recombinante fusionados con mTurquoise2 y mApple. Además, nos gustaría demostrar un método para la renaturalización en gel de los sustratos y los fragmentos de escote de las muestras de ensayo después de desnaturalización sdS-PAGE también. Todos los experimentos se llevan a cabo sobre el ejemplo de la proteasa del virus VIH-1.El plásmido de expresión lleva la secuencia de codificación de una etiqueta de afinidad de hexa histadina y una proteína de fusión de unión a maltosa seguida de un sitio de escisión de control de la proteasa del virus de la glucosa al tabaco, un casete de clonación y una proteína fluorescente C-terminal. Linearice la expresión plásmido por PacI y NheI restricción endonucleas. Realizar el recocido de la Escherichia coli codón optimizado hacia adelante y hacia atrás introducciones de oligonucleótidos que codifican para la secuencia de sustrato de interés y flanco por PacI y NheI extremos cohesivos.Realizar la inserción de las imprimaciones recocidos en el plásmido de expresión linealizada por ligadura. Para la expresión de proteínas, transforme las células competentes BL21(DE3) por la mezcla de ligadura. Las proteínas fluorescentes estarán en el mismo marco de lectura abierto con las etiquetas de fusión N-terminal sólo después de una ligadura exitosa.Unos días después de la transformación, las colonias que contienen la expresión plásmida que codifica el sitio de escote insertado de interés mostrarán fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul del Lector Oscuro. Añadir 10 microlitros de glicerol en las células BL21(DE3)que llevan la codificación del plásmido de expresión para la secuencia de escisión en el lugar de interés a cinco mililitros LB medio que contiene 100 microgramos por mililitro de ampicilina en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Incubar la suspensión a 37 grados durante 15 horas mientras tiemblan constantemente.Transfiera cinco mililitros de cultivo bacteriano a 50 mililitros de medio LB fresco que contenga 100 microgramos por mililitro ampicilina. Crecer las células a 37 grados a una absorbancia de 0.6 a 0.8 a 600 longitudes de onda nanómetros. En este punto, inducir la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG.A partir de entonces, incubar el cultivo durante tres horas a 37 grados mientras se agita continuamente. Después de la incubación, transfiera 25 mililitros del cultivo a tubos limpios de centrífuga de 50 mililitros, y cosecha las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos de células bacterianas a menos 70 grados durante al menos una hora.Los pellets celulares que contienen las proteínas fluorescentes expresadas con éxito muestran claramente una fluorescencia con o incluso sin usar un transilluminador azul Dark Reader. Coloque el pellet de celda congelada sobre hielo y déjelo descongelar durante 15 minutos. Agregue dos mililitros de tampón de lysis al pellet y suspenda las células.A partir de ahora, añadir el inhibidor de la proteasa, liberar la suspensión por lyzozyme y DNase, suspender las células e incubar la suspensión sobre hielo durante 15 minutos. Transfiera dos veces las suspensiones de un mililitro en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y sonica las suspensiones durante tres minutos en rondas de 10 segundos de sonicación y cinco segundos de rotura. Centrifugar los tubos a 10.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente.Los linsatos de células bacterianas despejadas que contienen el sustrato fluorescente de interés muestran fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul dark Reader. El procedimiento del ensayo de proteasa desarrollado comienza con la preparación de las muestras de ensayo. En primer lugar, los sustratos recombinantes se incuban con las perlas magnéticas de afinidad, y se forman las perlas magnéticas unidas al sustrato, abreviadas como SAMB.Los SAMB se lavan varias veces, y finalmente la solución de stock SAMB se prepara mediante la alícuota de la que se crean muestras de ensayo. Las reacciones se inicializan mediante la adición de la solución proteasa. Tras el escisión de la proteasa, los fragmentos proteolíticos se liberan en el sobrenadante.La reacción se termina por la separación de las perlas magnéticas del tampón de reacción que contiene los productos de escote fluorescente y la enzima. Los sobrenadantes se aplican a los pozos de una placa de microtíter y la fluorescencia se determina por fluorimetría. Las curvas de calibración se generan utilizando sustratos fluorescentes purificados resueltos en cada búfer de ensayo.La concentración de los productos de escisión fluorescente C-terminal y también la del sustrato aplicado en las muestras de ensayo se determinan en función de la pendiente de las curvas de calibración. Coloque el tubo que contiene cuentas de agarosa magnética de níquel-NPA nuevas o recicladas en un concentrador de partículas magnéticas. Las perlas pueden adherirse a la pared y/o a la tapa del tubo de microcentrífuga.Por lo tanto, gire el concentrador boca abajo en todas las direcciones para asegurarse de que se recogen todas las cuentas. Retire el sobrenadante y deséchelo. Añadir 1.8 mililitros tampón de lysis a las perlas y quitar los tubos cerrados del concentrador.Suspenda las perlas en el tubo agitando y/o girando el tubo boca abajo hasta que las perlas sean completamente homogéneas. Coloque los tubos de nuevo en el concentrador y gire al revés en todas las direcciones para asegurarse de que se recogen todas las cuentas. Abra el tubo y deseche el sobrenadante.Añadir el izado de bacterias estériles transparente que contenga el sustrato de interés y retirar el tubo cerrado del concentrador. Gire los tubos boca abajo hasta que las perlas sean completamente homogéneas y gire los tubos por rotador, lentamente, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los SAMB muestran fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul Dark Reader.Lave los SAMB tres veces por 1,8 mililitros 1%Tween 20, tampón de lavado y tampón de escote. Agregue el búfer de escote a los SAMB lavados para crear una solución de almacenamiento SAMB. Si utiliza tubos de microcentrífuga de proteína baja-baja de dos mililitros, el volumen del tampón de escote aplicado es de hasta 1,9 mililitros.Después de la adición del tampón, no agitar ni girar el tubo boca abajo. Cierre el tubo y retírelo del concentrador. Prepare tubos de microcentrífuga de dos mililitros de proteína baja y unión para las muestras de ensayo.Suspenda la solución de la reserva de SAMB hasta que sea completamente homogénea y mida la cantidad de sustrato a analizar en las reacciones transfiriendo inmediatamente la solución de stock SAMB a los viales de muestra. Se recomienda que el volumen de la solución de material SAMB que se va a transferir sea de 25 a 300 microlitros, pero debe ajustarse de acuerdo con el diseño experimental individual. Coloque los tubos de muestra que contienen las suspensiones SAMB alícuotas en el concentrador.Retire cuidadosamente el sobrenadante de los SAMB y deséchelo. Retire los tubos del concentrador y agregue cuidadosamente el búfer de reacción a los SAMB. El volumen del búfer de reacción añadido debe calcularse de acuerdo con el diseño experimental individual, pero se recomienda ajustar el volumen final de la mezcla de reacción entre 50 y 150 microlitros si se utilizan tubos de dos mililitros.Cierre las tapas de los tubos. Ahora, los ejemplos están listos para ser inicializados. Agregue la solución enzimática a las muestras de reacción.Revuelva las perlas con cuidado moviendo suavemente los tubos y coloque los tubos inmediatamente en el termoejedor que ya está agitando. En el caso de muestras en blanco de sustrato y muestras de control de sustrato, agregue tampón de escote y tampón de elución respectivamente. Treinta segundos antes del final de la incubación, saque la muestra del termocaseador y gítela rápidamente.Coloque el tubo sobre el concentrador y deje reposar el tubo durante 15 segundos. La recolección de los SAMB puede facilitarse moviendo ligeramente el concentrador hacia adelante y hacia atrás. Abra la tapa y transfiera el sobrenadante cuidadosamente a una placa o a un tubo nuevo.No toque las perlas concentradas por la punta de la pipeta. El sobrenadante recogido de las muestras de control de sustrato y las muestras de reacción con un alto grado de escote pueden mostrar fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul Dark Reader. Transfiera dos veces 30 microlitros de los sobrenadantes de muestra separados a una microplaca negra de media área.Mida la fluorescencia por fluorómetro utilizando los filtros apropiados de acuerdo con la proteína fluorescente aplicada. Para la purificación de los sustratos fluorescentes, preparar la misma solución como se describió anteriormente, y desechar el sobrenadante. Agregue 400 a 600 microlitros tampón de elución a los SAMB y gire los tubos por rotador lentamente a temperatura ambiente durante cinco minutos.Transfiera el eluido a nuevos tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Muestra fluorescencia claramente visible con o sin usar un transilluminador azul Dark Reader. Después de la purificación, el intercambio de tampón y la medición del contenido proteico, preparar una dilución en serie doble en al menos ocho pasos, tanto de las soluciones de sustrato resuelto por elución-buffer-y el escopo-buffer-solved, utilizando la elución o el tampón de escisión para la dilución respectivamente.Transfiera 30 microlitros de cada punto de dilución a una microplaca negra de media área. Mida la fluorescencia por fluorómetro utilizando los mismos ajustes que se aplicaron en la medición de los sobrenadantes de muestra del ensayo. Como ejemplo para el procesamiento de datos, las mediciones cinéticas dependientes del sustrato de la proteasa VIH-1 se realizaron en una forma fusionada con mTurquoise2 del sustrato recombinante que codifica el sitio de escisión entre la matriz y las proteínas cápoides en el precursor natural de la proteína basculante.Trazar los valores de intensidad de fluorescencia relativa corregidos contra la concentración molar de los sustratos purificados, resolver el búfer de escisión o elución y realizar la regresión lineal. Calcular la concentración molar de los productos de escisión C-terminal en las muestras de reacción utilizando la pendiente de la curva de calibración basada en el búfer de escisión. Calcule también la concentración de sustrato aplicada en las muestras de reacción en función de la concentración molar del sustrato eluido en las muestras de control de sustrato utilizando la pendiente de la curva de calibración basada en búfer de elución.Los valores de velocidad iniciales se calcularon a partir de la cantidad de fragmentos de escote C-terminal y luego se trazaron contra la concentración de sustrato aplicada. También los parámetros cinéticos fueron determinados por el análisis de regresión no lineal Michaelis-Menten. Después de realizar el ensayo magnético a base de cuentas de níquel-NTA, los sobrenadantes de ensayo también pueden ser analizados por electroforesis de gel de poliacrilamida.Sin embargo, además del análisis de las muestras de ensayo, también es posible analizar los sustratos fluorescentes purificados y/o los fragmentos de escote después de la digestión en solución. Para la digestión en solución, alicuere los sustratos fluorescentes purificados a digerir disueltos en tampón de escote en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y agregue la solución enzimática a las muestras. Incubar las muestras de acuerdo con el diseño experimental y terminar las reacciones por el procedimiento de preparación de la muestra para PAGE.Para la preparación de muestras no desnaturaladas, mezcle las muestras que se analizarán con un búfer de carga de muestras no desnaturalable que no contenga agentes reductores. En el caso de la preparación de muestras desnaturaladas, mezcle las muestras a analizar con el tampón de carga de muestras desnaturalablemente y exponga las muestras al tratamiento térmico a 95 grados durante 10 minutos. Aplicar las muestras no desnaturaladas y desnaturaladas en los pomos del gel SDS-poliacrilamida y realizar electroforesis.Retire el cassette de gel del módulo en funcionamiento. Las muestras no desnaturalizadas ya son visibles en el gel incluso a simple vista o con el transiluminador azul Dark Reader. Para detectar los componentes fluorescentes de las muestras desnaturalizadas en el transilluminador, realice la renaturalización en gel lavando el SDS del gel.Añadir 100 mililitros de agua destilada al gel y enjuagar al menos durante 30 minutos. Visualice las proteínas fluorescentes colocando el gel no manchado en el transilluminador azul Dark Reader. Las proteínas de fusión fluorescente recombinante fueron diseñadas para ser utilizadas como sustratos en ensayos proteolíticos.Tras el escisión por la proteasa en el sitio de escisión específico, se libera el fragmento de escote fluorescente C-terminal y se puede detectar su fluorescencia. Su uso en el ensayo magnético basado en cuentas de níquel-NTA y la detección fluorescente mediante análisis PAGE se han optimizado utilizando la proteasa del VIH-1. Sin embargo, la plataforma de ensayo desarrollada también puede ser adecuada para otras proteasas.Las curvas de calibración de los sustratos purificados resueltos en escisión o tampón de elución se ilustran en los ejemplos de la forma fusionada con mTurquoise2 y mEYFP del sustrato recombinante que codifica el lado de la escisión entre la matriz y las proteínas cápsidas de la proteína anecoica natural del VIH. El ensayo magnético basado en cuentas níquel-NTA es una herramienta útil para examinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción y, por lo tanto, también hace posible la determinación de los parámetros cinéticos enzimáticos como Vmax y Km. El diagrama A muestra un resultado óptimo obtenido después de un análisis realizado con éxito de la actividad dependiente del sustrato en un sustrato fusionado con mApple.Por el contrario, el diagrama B presenta un resultado subóptimo en el que la homogeneización insuficiente de la solución de stock SAMB causa problemas en el establecimiento de las concentraciones de sustrato adecuadas, mientras que la terminación incorrecta de las muestras de reacción da lugar a errores relativamente altos. El ensayo también proporciona una herramienta adecuada para realizar estudios inhibitorios y de curso de tiempo. El diagrama A demuestra la dependencia temporal de la escisión proteolítica de la proteasa vih-1 sobre un sustrato fusionado con mEYFP, mientras que el diagrama B representa el efecto inhibitorio de amprenavir en la reacción de escisión.A partir de los datos obtenidos por el estudio inhibitorio, se pueden determinar tanto la concentración enzimática activa como la constante inhibitoria. El ensayo también se puede optimizar para estudiar la dependencia de la actividad enzimática del pH, ya que se representa mediante el diagrama A sobre el ejemplo de la proteasa del virus del humo del tabaco. El diagrama B indica una limitación del ensayo por pH y muestra que el pH neutro o ligeramente alcalic es totalmente compatible con las mediciones, mientras que el pH ácido facilita la disociación espontánea de los sustratos de la superficie de las perlas magnéticas.La figura actual muestra los sustratos fluorescentes intactos purificados, los fragmentos fluorescentes de escote C-terminal, generados por la digestión en solución por la proteasa del VIH-1. Los componentes fluorescentes se pueden detectar en el gel de poliacrilamida que contiene SDS mediante transilluminación de luz azul justo después de la electroforesis si se aplicaron condiciones no desnaturalizadoras durante la preparación de la muestra. Las diferentes proteínas fluorescentes se pueden diferenciar en función de su color.Después del ensayo magnético a base de cuentas, las proteínas fluorescentes no desnaturaladas en los sobrenadantes de muestra también se pueden detectar en el gel mediante la iluminación UV. Por el contrario, si se aplican condiciones de desnaturalizado durante la preparación de la muestra, las proteínas desnaturaladas no se pueden detectar en el gel inmediatamente después de la PÁGINA SDS. Sin embargo, las proteínas fluorescentes desnaturaladas pueden ser parcialmente renaturaladas por la eliminación de la SDS del gel y volverse detectables.Por lo tanto, sdS PAGE es seguido por el procedimiento de renaturalización en gel. La capacidad de renaturalización de las proteínas fluorescentes hace posible su identificación no sólo en función de su fluorescencia, sino también en función de su peso molecular. Aquí demostramos el protocolo para el uso de nuestra plataforma de ensayo de proteasa fluorescente magnética basada en perlas recientemente desarrollada.Hemos demostrado el uso de este sistema en el ejemplo de estudios cinéticos enzimáticos sobre la proteasa del VIH-1. Utilizamos formas fusionadas con mTurquoise y mApple del sustrato de ensayo recombinante, que contenía la secuencia de sitio de escisión de la proteasa. Además del análisis fluorimétrico, las muestras de ensayo fueron posteriormente analizadas por SDS PAGE también.Hemos demostrado que las proteínas fluorescentes desnaturaladas se pueden renaturalcar parcialmente en el gel después de SDS PAGE, que proporciona identificación fluorescente y de peso molecular del sustrato y los fragmentos proteolíticos.

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