Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

Detección de endotoxinas en nanomateriales modificados representa uno de los grandes retos en el campo de la nanomedicina. Aquí, presentamos un estudio de caso que describe el marco compuesto por tres formatos diferentes de LAL para estimar la potencial contaminación de endotoxina en nanopartículas.

Este método puede ayudar a responder en el campo médico sobre la seguridad de los nanomé medicamentos. Las ventajas de esta técnica es que es estándar, y se utiliza en todo el mundo para la evaluación de productos, a nano medicamentos. La demostración del procedimiento.será Barry Neun.en el Laboratorio de Caracterización de Nano Technology.

Para la preparación estándar de calibración, utilice 900 microlitros de lisato de amebotocitos de limulus o agua de grado LAL. Y 100 microlitros de endotoxina estándar de control, para preparar tantas diluciones intermedias como sea necesario, para permitir la preparación de un estándar de calibración con una concentración de una unidad de endotoxina por mililitro. A continuación, utilizando 900 microlitros de agua de grado LAL, y 100 microlitros de una unidad de endotoxina por mililitro de calibración estándar, preparar un segundo estándar de calibración, a una concentración de 0,1 unidad de endotoxina por mililitro.

A continuación, repita la dilución de diez veces en serie para preparar dos estándares de calibración más bajos. Para obtener un total de cuatro estándares de calibración, que van desde 0001 a una unidad de endotoxina por mililitro. Para preparar un control de calidad de 05 unidades de endotoxina por mililitro, combina 50 microlitro de una unidad de endotoxina por mililitro de solución de endotoxina estándar de control, con 950 microlitros de agua de grado LAL.

A continuación, en el software, seleccione la configuración del instrumento y cree la plantilla. Seleccione Recopilar datos e introduzca el ID de prueba y el grupo de datos en la pestaña general. En la pestaña hardware, seleccione el tipo de instrumento y el método LAL y compruebe que un número de serie, el ID del sistema y la información del puerto serie aparecen en la pantalla.

Haga clic en Aceptar dos veces para confirmar la selección del instrumento y la comunicación con el instrumento, e introduzca los ID de muestra en el mismo orden en que se probarán las muestras. A continuación, utilice los botones predeterminados para introducir la curva estándar de control negativo y probar muestras. Agregue el volumen adecuado de estándares de calibración de control negativo y el control de calidad en tubos de vidrio preetiquetados duplicados.

Y agregue el volumen adecuado de LAL a la primera prueba vil. Vórtice brevemente la vil y coloque el vial en las ranuras de prueba apropiadas en el carrusel de instrumentos. Antes de cargar las muestras, realice varias diluciones del nanomaterial de prueba dentro de la dilución máxima válida como se ha demostrado.

Para preparar una unidad de endotoxina de 05 por mililitro de control de mejora de la inhibición, combine 25 microlitros de una unidad de endotoxina por mililitro de solución de endotoxina estándar de control, con 475 microlitros del nanomaterial de prueba a una dilución dada. Después del vórtice, cargue los controles de mejora de la innovación adecuados y las muestras de estudio sin bordear en el instrumento. A continuación, aliquot unspiked y los nanomateriales espiados en una dilución específica en tubos pre etiquetados.

Antes de vórcal, y la carga en el carrusel del instrumento. Para realizar un Gel-Clot LAL, prepare la endotoxina estándar de control a una concentración final de cuatro lambda, y combine 100 microlitros de estándar, con 100 microlitros de agua, o muestra de prueba para lograr una concentración final de endotoxina estándar de control dos lambda. Añadir 100 microlitros de lisina a cada dilución lambda.

Vórtice los tubos brevemente, y coloque el bastidor de los tubos en un baño de agua Celsius de 37 grados durante una hora. Al final de la incubación, invierta los tubos con un movimiento suave y registre manualmente los resultados usando plus para un coágulo firme, y menos para ningún coágulo, o un coágulo suelto. En este análisis representativo, la doxorubicina liposomal PEGylated interfirió con laL cromogénico en la dilución cinco, sin embargo esta interferencia se superó en diluciones más altas.

La recuperación de picos fue de entre 50 y 200% cuando la formulación se probó en las diluciones 50 y 500 en la turbidez y lal cromogénico, así como en la dilución cinco, en la turbidez LAL. Cuando se ajusta por el factor de dilución, los resultados fueron consistentes entre delirios en ambos ensayos. Además, los resultados fueron consistentes entre los tres formatos de ensayo.

Recuerde que cada muestra tiene su propia gama de diluciones, cada formato LAL utiliza su estándar de control en la doxina y el lysate, y que los tubos utilizados para preparar las diluciones, y para realizar una reacción diferente para cada ensayo LAL. Para este procedimiento otros métodos como Se puede realizar para responder preguntas adicionales sobre el material Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para las suturas y el campo de la nano medicina, para explorar las aplicaciones médicas de los fármacos formulados nanotecnología en los seres humanos, y modelos clínicos que incluyen pero no limitado a primates no humanos, conejos, perros y ratas. No olvide que trabajar con doxin puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como el uso de equipos de protección personal, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.