Name: Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 28 s
Description: Aprende la centrifugación de gradiente de densidad para separar esperma por calidad en investigación de fertilidad. Esta técnica permite obtener tres capas distintas de calidad para análisis posteriores.

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Georgia.
1. lavado mediante centrifugación tradicional
<ol><li>Preparar la solución amortiguadora de fosfatos (PBS). Añadir 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 y 0,24 g de KH2PO4 a 800 mL de agua destilada (dH2O). Ajustar el pH a 7.4 con 0.1 N HCl y llevar la solución a 1 L con dH2O.</li>
	<li>Preparar el tampón de motilidad. Añadir 6,5 g de NaCl, 4,5 g de glucosa, 0,444 g de CaCl2 y 11,5 g de N - tris-[hidroximetil] ácido metil-2-amino-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido (TES) a 800 mL de dH2O. ajustar el pH a 7.4 con 1 M NaOH y traer la solución a 1 L con dH2O.</li>
	<li>Pipetear 0.5 mL de semen en un tubo de microcentrífuga de polipropileno. Añadir 1,0 mL de PBS y mezclar suavemente.</li>
	<li>Centrifugar a 1.500 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT) y descarte el sobrenadante. Resuspender el sedimento de esperma con PBS hasta 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 1.500 x g durante 10 min a RT. resuspender los espermatozoides con motilidad de pellets tampón hasta 0,5 mL.</li>
</ol>2. realizar la técnica PDGC
Nota: Realice todo el proceso de PDGC a temperatura ambiente.
<ol><li>Hacer 3,0 mL de 1,08 g/mL y 1,07 g/mL de Percoll soluciones en dos tubos separados.<ol>
<li>En un tubo de ensayo limpio, añadir 1,712 mL de 1,13 g/mL Percoll original a 0,3 mL de solución de NaCl al de 1,5 M. Añadir 0,988 mL de dH2O y mezclar por inversión suave para hacer 3,0 mL de un 1,08 g/mL densidad solución.</li>
		<li>En un tubo de ensayo limpio, añadir 1,482 mL de 1,13 g/mL Percoll original a 0,3 mL de solución de NaCl al de 1,5 M. Añadir 1,218 mL de dH2O y mezclar por inversión suave para hacer 3,0 mL de un 1,07 g/mL densidad solución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En un tubo de ensayo limpio, diluir 1.0 mL de semen muestra 1:2 con 2,0 mL de PBS. Mezclar suavemente por pipeteo.</li>
	<li>Extraiga con pipeta 3,0 mL de la solución de densidad 1,07 g/mL en un tubo cónico de 15 mL estéril. Con cuidado Extraiga con pipeta 3,0 mL de la solución de densidad de 1,08 g/mL por debajo de la solución de densidad 1,07 g/mL. Asegúrese de que las dos capas no se mezclan. Una forma de largo (9 in) pipeta Pasteur puede facilitar este paso.</li>
	<li>Extraiga con pipeta 3,0 mL de la muestra de semen diluido overtop el PDG. Para asegurar que la muestra de semen no se mezcla con el PDG, incline suavemente el tubo cónico que contenía el PDG en un ángulo de 45°. Pipetear la muestra a lo largo de la pared del tubo y permitir que fluya por el tubo y el PDG.</li>
	<li>Prepararse un tubo blanco para que coincida con la masa de la PDG con muestras superpuestas. Centrifugar los tubos a 1500 x g por 20 minutos tenga cuidado de mantener el gradiente discontinuo al mismo tiempo transferir los tubos desde el Banco al saldo y luego a la centrifugadora. Nota: No use el freno al final de la centrifugación.
</li>
	<li>Observar los resultados. Asegurar que se han formado tres capas distintas de semen en el tubo, como se ve en la figura 1.</li>
	<li>Aspire capas aisladas de semen con una pipeta. Recoger primero la capa superior de esperma, el centro en segundo lugar de la capa y por último la pelotilla dura en la parte inferior del tubo. Transferencia de cada uno para un limpio y estéril de polipropilenotubo de microcentrífuga.
</li>
	<li>Diluir cada muestra a 1,5 mL con PBS. Centrifugar a 1500 x g por 10 min.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante. Reconstituir el sedimento de esperma con tampón de motilidad mediante pipeteo suave. Nota: Pueden utilizarse densidades alternativas a las necesidades del investigador. Determinar cantidades de ingredientes se utilizan con la siguiente ecuación, que v0 volumen de solución stock de la densidad, v es el volumen final de solución deseada, p es densidad de solución de densidad final deseada y p0 es la densidad de la densidad del stock solución: <img alt="Ecuación de corrección de velocidad, \(v_0 = v \times \frac{p - 1.0058}{p_0 - 1}\), fórmula científica." src="/files/ftp_upload/58833/58833eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> Siempre use 0,3 mL de 1,5 M de NaCl en la preparación de las soluciones de densidad a la concentración de NaCl de la solución salina fisiológica.</li>
</ol>3. determinar la calidad del esperma
<ol><li>Calcular la concentración espermática como describió anteriormente22.</li>
	<li>Realizar eosina-nigrosina vital la coloración descrita12 con las siguientes modificaciones:<ol>
<li>Preparar 100 μl de solución de esperma en una concentración de 1 x 108 células/mL.</li>
		<li>Extraiga con pipeta 50 μl de solución de espermatozoides en un tubo de microcentrífuga de polipropileno que contiene un volumen igual de tinción eosina-nigrosina. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Los borrones de transferencia lugar 20 μl gota de la muestra de esperma manchada en un extremo de un portaobjetos de vidrio y unte uniformemente en una manera similar a la utilizada para la sangre. Deje secar al aire los portaobjetos embarrados a temperatura ambiente durante 3-5 min.</li>
		<li>Observar el frotis en el microscopio. Contar el número de espermatozoides vivos (no mancha) y espermatozoides muertos (teñidos de color rosa) y calcular el porcentaje de espermatozoides vivos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar el análisis Accudenz, validado previamente para que los espermatozoides de pollo, para evaluar objetivamente los espermatozoides movilidad8 con las siguientes modificaciones:<ol>
<li>Pipetee 1,0 mL de solución 6% ensayo en cubetas de poliestireno, como se ilustra en la figura 2. Incubar a 41 ° C. Nota: 41 ° C se utiliza para que coincida con la temperatura interna de una gallina. La temperatura de incubación debe coincidir con el tracto reproductor femenino de la especie investigada.</li>
		<li>Superposición de la solución de ensayo precalentado con 100 μl de muestra de semen a una concentración de 5 x 108 células/mL.</li>
		<li>Lugar la cubeta que contiene el overlaid muestra de esperma en el espectrofotómetro. Registre el valor de absorbancia a 550 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar el ensayo de penetración de la IPVL como se describió anteriormente11 con las siguientes modificaciones:<ol>
<li>Cortar un trozo (0,5 x 0,5 cm) de región de disco no germinal de la IPVL intacto.</li>
		<li>Ajustar la concentración espermática a 4 x 106 células/mL</li>
		<li>Incubar espermatozoides en tampón de motilidad con IPVL en un frasco pequeño de vidrio durante 15 min a 37 ° C, como se ilustra en la figura 3.</li>
		<li>Sumerja la pieza IPVL 3% NaCl para detener la interacción entre la IPVL y esperma.</li>
		<li>Montar la pieza IPVL en un portaobjetos y la tinción con reactivo de Schiff de 10 min después de la fijación con formalina al 10% durante 20 s.</li>
		<li>Observar la IPVL bajo un microscopio para esperma exitoso agujeros de penetración y contar el número de todos los agujeros visibles por 0.25 mm2 con 40 aumentos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Fertilidad no sólo determina la rentabilidad de la producción animal, sino que también actúa como un medio de selección natural de especies de existencia. Es de la última función de una célula de la esperma fertilizar un óvulo. El oviducto de una hembra selecciona sólo los espermatozoides más aptos para asegurar la fertilización del óvulo23,24. In vitro los estudios también han revelado una estrecha correlación entre rasgos cualitativos espermatozoides y...

En los vertebrados, gametos masculinos someterse a intensa presión selectiva; por lo tanto la aptitud reproductiva de un hombre es fundamental para lograr la fertilización exitosa. Los machos de cualquier especie vertebrado dado deben ser capaces de producir espermatozoides en grandes cantidades y calidad suficiente para satisfacer las necesidades de fertilización. Células de la esperma, con una cabeza del espermatozoide y un flagelo, son las células más polarizadas en el cuerpo. También son muy heterogéneos en la calidad de los espermatozoides (vivo y muerto, morfológicamente normal y anormal e inmóvil, poco móvil y alta móvil), que se revela a través de la amplia variación en la eficiencia reproductiva de los machos. Cuanto mayor sea la proporción de espermatozoides de alta calidad, menos el número de apareamientos requerido con éxito fertilizar el óvulo. Sin embargo, para lograr la fertilidad, las células de espermatozoides morfológicamente normales dependen de propulsiva fuerzas generadas por sus flagelos al llegar al sitio de fertilización, así como para penetrar la zona pelúcida1 (ZP; en el caso de mamíferos) o perivitelino interior Layer2 (IPVL; en el caso de aves y reptiles) del óvulo después de la monta natural o inseminación artificial (IA). Determinación de esperma calidad es necesaria para el uso de tecnologías de reproducción asistida3 (arte) y selección de machos reproductores en AI programas4. Por otra parte, el éxito del arte únicamente depende de la precisa evaluación de la calidad del esperma. Ha desarrollado una serie de pruebas de laboratorio para determinar las características funcionales de los espermatozoides. Los parámetros más importantes son la morfología espermática, movilidad, viabilidad, capacitación (esperma aviar no requieren capacitación5), reacción acrosómica (AR; exocitosis y la liberación de una enzima proteolítica del acrosoma de la cabeza del espermatozoide), esperma penetración de la ZP o IPVL y fertilización6,7,8,9,10,11. Medidas de la fecundidad solo no proporcionan una evaluación exacta de la capacidad fecundante de espermatozoides población11. Medidas de los varios eventos previos a la fertilización de un óvulo permiten una representación adecuada del rendimiento de espermatocitos individual7.
La metodología desarrollada para la medición de función de la esperma es principalmente propios de cada especie. Por ejemplo, en los espermatozoides aviares, viabilidad, movilidad y penetración de la IPVL son los parámetros más comunes utilizados para evaluar la calidad de esperma8,11,12. El número de espermatozoides vivos en el eyaculado desempeña un papel crucial para la supervivencia de los espermatozoides debido a la presencia de un gran número de espermatozoides muertos en el eyaculado afecta la calidad de los espermatozoides. Esto aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno en el semen y produce daño oxidativo en el esperma vivo13. Movilidad de espermatozoides, la capacidad de movimiento flagelar de los espermatozoides aviares contra la resistencia a la temperatura corporal, es conocido por desempeñar un papel directo en el fertilización8. Está bien establecido que la movilidad se correlaciona positivamente con la fertilidad y es, por tanto, un determinante principal de fertilidad8. Sin embargo, un espermatozoide móvil también debe tener la capacidad de someterse a una AR y penetrar la IPVL11. Ensayos de penetración IPVL tengan en cuenta para cada esperma que participa en el proceso de fertilización11.
En la aplicación del arte, eyaculado generalmente se procesa con el fin de maximizar la concentración de espermatozoides de alta calidad y minimizar la concentración de espermatozoides de baja calidad. Después de la recolección de semen, la proporción de espermatozoides de alta calidad puede ser enriquecida a través de procedimientos de separación de espermatozoides utilizados en las prácticas de la industria y la investigación. Muchos de estos procedimientos se han desarrollado, con respectivas ventajas y limitaciones, pero todos utilizan la naturaleza heterogénea de recoger sólo los espermatozoides con alta capacidad fecundante de los espermatozoides. Estos procedimientos incluyen métodos de migración espermática, filtración de la columna de adherencia y densidad gradiente de centrifugación (DGC)14,15,16,17,18,19 , 20. entre las técnicas disponibles, la DGC se ha encontrado para ser muy sencilla, repetible, rentable y eficiente en el aislamiento de la mayor cantidad de esperma de alta calidad para uso en el arte con el objetivo de maximizar la probabilidad de fertilización14 , 15. Además, DGC no es perjudicial para la membrana de la célula de la esperma. En contraste, métodos de migración de esperma recogen espermatozoides sólo progresivamente móviles18,19, pero la cantidad de semen recogido es muy baja, lo que es ineficiente en la recolección de grandes volúmenes de esperma18, 20. filtración de columna de adherencia es muy eficiente en filtrado altamente móvil de la esperma del semen17; sin embargo, tiende a ser perjudicial para las membranas de espermatozoides20,21.
En la técnica de la DGC, el sustrato más utilizado para generar el gradiente de densidad es Percoll, que consiste en partículas de sílice coloidal cubiertas en polyvinylpryrolidone. Centrifugación gradiente de densidad de Percoll (PDGC) puede ser continua o discontinua pero un gradiente discontinuado es más comúnmente utilizado para alto rendimiento de aislamiento de espermatozoides móviles altamente13,16,20. En un gradiente discontinuo, bajo medios de densidad flotan en la superficie mayor densidad los medios de comunicación, crea un gradiente que aumenta en densidad de la parte superior a la parte inferior de un tubo cónico. Esto crea límites en la interfaz entre dos medios de diferente densidad. La eficacia de PDGC se deriva de dos factores: 1) la capacidad propulsora de espermatozoides individuales y 2) la tendencia de espermatozoides con alta integridad estructural a tener una mayor densidad. Espermatozoides con mayor movilidad son más capaces de cruzar de media densidad inferior y penetrar en un medio de densidad más alta. Espermatozoides de movilidad inferiores son más propensos a quedar atrapados en los límites creados por la interfaz entre medios de diferente densidad. Espermatozoides con movilidad y alta integridad estructural tienden a tener una densidad mayor muertos, anormales o bajos espermatozoides móviles. Cuando se aplica la fuerza centrífuga en PDGC, esto facilita el movimiento del esperma con densidades diferentes a su lugar respectivo en el gradiente.
En la práctica general, después de realizar la PDGC, se recoge el sedimento suave de espermatozoides con alta fertilidad potencial en la parte inferior del tubo cónico, y el resto se descarta. Sin embargo, una ventaja subutilizada de esta técnica es su capacidad para separar las células espermáticas en varios grupos basados en las diferencias de calidad. Para fines de investigación, separación de espermatozoides por grado de calidad utilizando la técnica PDGC permite el estudio de la calidad del esperma lo que respecta a las diferencias fisiológicas, de metabolómica y proteómica. Aquí, nuestro objetivo es detallar cómo puede utilizarse esta técnica para separar los espermatozoides por calidad, como demuestran estas diferencias en la calidad, utilizando previamente establecidas de eosina-nigrosina tinción vital para la viabilidad, análisis de Accudenz movilidad esperma IPVL Análisis de interacción para la penetración.

<table><tbody><tr><td>Accudenz</td><td>Precise Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, EE. UU</td>. <td>AN7050</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>P7828</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s reactivo</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU</td><td>. 3952016</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU</td>. <td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Nigrosin</td><td>Sigma-Aldrich, Corp., St. Louis, MO, EE. UU</td><td>. 198285</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga ST 40R&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td><td>. 75004524</td><td></td></tr><tr><td>DU 530 Life Sciences Espectrofotómetro UV/Vis</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU</td><td></td>. <td>No se ha encontrado ningún catálogo</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida y contraste de fase Olympus IX 71</td><td>Olympus America Inc., PA, EE. UU</td><td></td>. <td>No se ha encontrado ningún catálogo</td></tr></tbody></table>

recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

En reproducción sexual, un gameto masculino o espermatozoide se fusiona con un gameto femenino para lograr la fertilización. Sin embargo, un gran número de espermatozoides con capacidad de fertilización está obligado a interactuar con un gameto femenino para fertilización. Como tal, la capacidad fecundante de los espermatozoides individuales es fundamental para la reproducción acertada. Centrifugación de gradiente de densidad se ha utilizado durante décadas como un método reproducible, rápido, eficiente, eficaz y extremadamente adaptable para recoger sólo alta calidad esperma para ser utilizado en reproducción asistida. Los protocolos que hemos descrito en este documento se centran en la utilización de la técnica de gradiente de centrifugación (PDGC) de densidad discontinua de Percoll para aislar a tres poblaciones distintas de la esperma de gallo por su calidad. Hemos podido recoger espermatozoides de calidad, medio y bajo. También describimos protocolos reproducibles que implican determinación potencial de fertilidad de los espermatozoides mediante la evaluación de su viabilidad, movilidad y penetración. Colección de esperma por su calidad técnica PDGC sería útil con precisión y caracterizar bien esperma con diferencial fertilidad potencial.

La técnica PDGC resultó en separación distinta de tres capas de esperma por grado de calidad a través de todos los parámetros. Esperma se separa en una capa de alta calidad por debajo de la mayor solución de densidad, una capa de calidad media entre la mayor y una solución de menor densidad y una capa de baja calidad por encima de la solución de menor densidad. Estas diferencias en calidad se evidencian mediante claras diferencias en la viabilidad (figura 4),...

En este trabajo, nuestro objetivo es describir el funcionamiento de la técnica de centrifugación del gradiente de densidad y su aplicación en la investigación de fisiología de la esperma.

Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología espermática, como los determinantes químicos de la calidad del esperma. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad para separar grandes cantidades de muestras por calidad, así como adaptabilidad en comparación con métodos alternativos. Aunque este método puede proporcionar información sobre las diferencias en la calidad del esperma, también se puede aplicar a otras muestras como tipos de células mixtas o componentes subcelulares con diferentes densidades.Para empezar, haga dos diluciones Percoll de 3 mililitros en dos tubos separados. En un tubo de ensayo limpio, diluir 1 mililitro de muestra de semen con 2 mililitros de PBS. Entuúcelo suavemente para mezclar la solución.Añadir 3 mililitros de la menor densidad De la sollución Percoll a un tubo cónico estéril. A continuación, pipetee cuidadosamente 3 mililitros de la solución Percoll de mayor densidad por debajo de la solución Percoll de menor densidad. Mientras inclina el tubo cónico en un ángulo de 45 grados, pipeta 3 mililitros de la muestra de semen diluido en la parte superior del gradiente de densidad Percoll.Después de preparar un tubo en blanco, centrifugar ambos tubos a 1500 Gs durante 20 minutos. Asegurar que se hayan formado tres capas distintas de semen en la bañera después de la centrifugación. Usando una pipeta recoger las tres capas de semen, comenzando con la capa superior, seguido por la capa media, y terminando con el pellet duro en la parte inferior del tubo.Transfiera cada una de las capas a un tubo estéril de micro centrífuga. Diluir cada una de las muestras de semen con 1,5 mililitros de PBS y centrifugar las muestras a 1500 Gs durante diez minutos. Finalmente, verter el sobrenadante y reconstituir los pellets con tampón de motilidad.En este protocolo, la técnica de centrifugación de gradiente de densidad Percoll, o PDGC, se utilizó para separar una muestra de semen en tres capas distintas. Los espermatozoides se separan en una capa de alta calidad por debajo de la solución de mayor densidad, una capa de calidad media entre las soluciones de densidad más alta y baja, y una capa de baja calidad por encima de la solución de menor densidad. Estas diferencias en la calidad del esperma se evidencian por diferencias en viabilidad, movilidad y penetrabilidad.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las muestras deben ser llevadas a temperatura ambiente. El éxito de PDGC depende de una cuidadosa preparación del gradiente, así como de una cuidadosa colección de las capas aisladas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para nuestra investigación en el campo de la perdiómica de espermatozoides para explorar marcadores biológicos de fertilidad en especies aviares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método eficaz para obtener fracciones altamente purificadas meiótica viables de ratón testículos se describe, que combina un refinado protocolo de disociación celular, con la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Este método aprovecha las diferencias en el contenido de ADN nuclear y la densidad de las fracciones discretas meióticas.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Este video describe la técnica para aislar las células de leucemia linfocítica crónica (LLC) de la sangre periférica. Con este protocolo, aislaremos células de LLC de muestras de sangre de pacientes humanos para la posterior generación eficiente de fracciones nucleares y citoplasmáticas.

Centrifugación en gradiente de densidad: un método para aislar células de LLC de sangre periférica

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

Describimos una estrategia de clasificación para espermátidas de ratón utilizando citometría de flujo. Las espermátidas se clasifican en cuatro poblaciones de alta pureza, que incluyen espermatidas redondas (pasos 1-9 de espermiogénesis), de elongación temprana (pasos 10-12 de espermiogénesis), de elongación tardía (pasos 13-14 de espermiogénesis) y elongadas (pasos 15-16 de espermiogénesis). La tinción, el tamaño y la granulosidad del ADN se utilizan como parámetros de selección.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

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Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

Demostrar el uso de gradientes discontinuos de densidad para separar poblaciones bacterianas basadas en la producción de cápsulas. Este método se utiliza para comparar cantidad cápsula entre culturas, aislar a mutantes con un fenotipo específico de la cápsula, o identificar los reguladores de la cápsulas. Se describe aquí es la optimización y funcionamiento del ensayo.

Separación de bacterias por cápsulas cantidad usando un gradiente de densidad discontinuo

Aquí se presenta un protocolo para enriquecer los espermacitos de paquiteno, espertáidos redondos y elongafines espermatíides de testículos de ratón adultos utilizando un gradiente discontinuo de densidad de albúmina sérica bovina con equipo de laboratorio estándar.

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Aislamiento y purificación de vesículas extracelulares bacterianas a partir de heces humanas mediante centrifugación en gradiente de densidad

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Técnica de natación horizontal en forma de U para la preparación de espermatozoides de alta calidad con bajo índice de fragmentación del ADN

Gradiente desnaturalizante electroforesis en gel (DGGE)

Aprende la centrifugación de gradiente de densidad para separar esperma por calidad en investigación de fertilidad. Esta técnica permite obtener tres capas distintas de calidad para análisis posteriores.

Recogida de esperma de calidad diferencial mediante centrifugación de gradiente de densidad

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