Name: In Vitro Rasguño de análisis para demostrar los efectos del arsénico sobre la migración de la célula de la piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende el ensayo de rasguño in vitro para evaluar los efectos del arsénico en la migración celular cutánea. Este método permite estudiar la cicatrización de heridas y desarrollar estrategias terapéuticas.

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Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número U54MD012388. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aplicación de este ensayo proporciona una alto rendimiento y oportuna evaluación de la migración celular y puede traducir directamente a complejos sistemas fisiológicos5,6,7. Por esta razón, el modelo propuesto de sobremesa ha sido sintonizado y practica para evaluar los efectos de varios agentes terapéuticos y las toxinas ambientales en heridas6. Las concentraciones de arsénico, utilizado en el estudio actual fueron consideradas ambientalmente relevantes a través de la búsqueda de la literatura extensa de los niveles de exposición conocidos y de revisión retrospectiva de datos de varias bases de14,15, 16,17,18,19,20,21. Uso de este ensayo de rayado en vitro demostraron que la exposición a una concentración de arsénico en el alto, pero la gama ambientalmente relevante, retrasa el cierre de la herida (migración celular).
Este modelo de Banco también fue empleado para aislar y estudiar una línea de células individuales (fibroblastos) para entender más cómo la migración de fibroblastos contribuye a los resultados de curación de la herida. Además, es difícil estudiar las funciones de una línea de células individuales en sistemas complejos en vivo con muchas otras células y tejidos presentes que pueden interferir con el análisis. Además, el ensayo proporciona un medio para lograr datos de cierre herida por ciento semi cuantitativos que pueden utilizarse para orientar mecanismos celulares específicos a través del cual los compuestos pueden influir en la cicatrización de heridas. Por ejemplo, células utilizadas en el ensayo de rayado pueden ser recogidas y almacenadas en un reactivo deseado y utilizadas en la expresión génica (señal de mRNA) o análisis de la expresión de la proteína22. Esta información puede ser útil al investigador si buscan entender qué señales o proteínas pueden en gran medida contribuir a cambios en la migración celular en presencia de diferentes tratamientos (es decir, arsénico)22.
Fibroblastos dérmicos neonatales humanos fueron seleccionados para este trabajo basado en su destacado papel en la cicatrización de heridas. Sin embargo, este protocolo cero ha sido implementado con diversos tipos celulares y una gama de propósitos de la investigación. Por ejemplo, el ensayo de rayado se ha adoptado en el campo de la oncología para el estudio de inhibición de migración de quimioterapia drogas23; para la migración de la célula de músculo esquelético, proliferación y difusión24; para estudiar el efecto de extractos de plantas en migración celular25; y para entender cómo contribuyan con proliferación y migración de queratinocitos a la herida curativa9. Además, el anterior documento por Pinto et al. evaluó los efectos del uranio (U) y plasma rico en plaquetas (PRP) en migración de hDFn mediante el ensayo de rayado6. El propósito de este trabajo fue conocer el grado en que este ensayo podría poner a prueba el efecto de un agente para disminuir la migración celular (U), así como un agente que la velocidad de migración celular (PRP). Como puede verse en el trabajo ya mencionado y la investigación por otros investigadores, aplicación de la prueba de scratch tiene alto potencial de uso en varios modelos experimentales26. A pesar de los detalles proporcionados dentro de los métodos, la varianza es de esperarse entre los investigadores y experimentos. Por ejemplo, tasas de migración celular es probable que fluctúan en base a la línea celular en uso, además de los micronutrientes requeridos necesarios para tipos de celda única. Muchas de las observaciones importantes para facilitar la viabilidad y rendimiento de la célula aparecen como notas a lo largo de este protocolo. Sin embargo, se recomienda que los investigadores siguen las recomendaciones del fabricante para las condiciones de crecimiento óptimo y para utilizar este método como instrucción complementaria para el trabajo de la cultura general de la célula.
Aunque el ensayo de rayado es extremadamente versátil para el estudio de la actividad celular; sesgos inesperados pueden surgir en las técnicas de medición. Por ejemplo, al utilizar ImageJ manualmente trazar frentes de migración de la célula, puede existir variación entre los usuarios, que pueden limitar la exactitud y la colección de datos representativos. Debe señalarse también que frentes de migración deben leerse ciego al tratamiento para minimizar el sesgo del usuario. Además, identificar manualmente los frentes migración puede resultar en un error de cálculo de la distancia promedio recorrida debido a la formación de pseudópodos por las células y su capacidad para llegar a adherencias focales de la forma, que pueden ser visualmente engañosas. De igual manera, el uso de fluorescentes "rastreador de celulares" colorantes sobre la superficie de la célula o proteínas nucleares para detectar la migración involuntaria pueden fijar las células resultando en imprecisiones al medir la migración celular en el tiempo. Se recomienda que los controles adecuados de positivos o negativos estar inscrito dentro del experimento para evaluar completamente el efecto del tratamiento sobre las líneas celulares. Práctica de este análisis debe ser completado en reconocimiento de sus limitaciones. Esta prueba no garantiza que resultados de migración celular de experimentación in vitro se traducen directamente a los resultados de en vivo . Migración celular y cicatrización herida en un sistema de vida complejo implica una multitud de tipos celulares y señales moleculares; cada uno de ellos tiene el potencial para influir en las respuestas curativas.
En Resumen, el ensayo de rayado se ha encontrado para proporcionar proyección de alto rendimiento de la migración celular en respuesta a los cambiantes entornos6,25. Específicamente utilizamos este protocolo para detectar con éxito cambios en la migración celular como resultado de la exposición al arsénico en diversas dosis ambientales relevantes. Estos datos han proporcionado justificación para utilizar el ensayo de rayado para estudio y evaluar las vías mecanicistas de la migración celular en este análisis y cómo estas vías son alteradas por la exposición de arsénico.

La cicatrización consiste en una compleja serie de pasos que involucran diversos tipos de células, moléculas de señalización y de componentes de matriz extracelular1se superponen. Juntos, estos componentes trabajan en conjunto para lograr la resolución de la herida o la reparación, que en última instancia conduce a la formación de una cicatriz fibrótica protector dependiendo del grado de trauma1. Para capturar los distintos procesos y funciones de la herida que cura en un experimento es difícil; pasos individuales en el proceso de cicatrización necesitan ser identificadas y probadas por separado. Entre los muchos pasos de la cicatrización, el proceso de migración celular se ha considerado crítico al evaluar cicatrización tarifas2. Migración celular se puede observar en todas las fases de la cicatrización de heridas y así exige una mayor comprensión de cómo alteraciones de migración celular pueden afectar a encierro de la herida. Por ejemplo, la migración celular se observa en ambos inflamación de fase temprana y tardía, con agregación de la coagulación y plaquetas de la sangre en el sitio de la herida3. Estos eventos previenen pérdida de sangre excesiva mediante la formación de una obstrucción temporal para llenar áreas heridas desprovisto de tejido3. Las plaquetas en la circulación se sintetizan y secretan mediadores vasoactivos y factores quimiotácticos, que señal de junto para la migración de leucocitos inflamatorios (glóbulos blancos) en el tejido herido de reparación4. Reepitelización ocurre dentro de las horas de lesión del tejido y consiste en cubrir el sitio de la herida a través de la actividad y migración de los queratinocitos epiteliales para evitar más contaminación o invasión de partículas extrañas en el sitio de la herida2. Estos ejemplos de captura de sólo unos pocos de la migración de células de muchas funciones asociadas con la cicatrización de heridas.
El ensayo de rayado ha sido descrito y utilizado para entender mejor la migración de la célula y sus muchos papeles en5,6de cicatrización. Este análisis se consideran simplista, proporciona alto rendimiento y permite al investigador a recoger datos de migración de la célula representativa. Ensayos de migración con éxito han demostrado que ciertos compuestos pueden acelerar o ralentizar la velocidad de migración celular6. Además, estos resultados ofrecen información fisiológica traslacional que puede utilizarse para formular tratamientos blanco, dosificación de las concentraciones y los genes de interés antes de la experimentación en vivo . El ensayo requiere de técnicas de cultivo de célula básica y suministros, una línea celular de elección y la tecnología de imágenes para capturar el movimiento con el tiempo o movimiento en respuesta a los tratamientos.
El ensayo puede ser fácilmente manipulado o adaptado a las necesidades del investigador. Sin embargo, hay cuatro cuestiones básicas a tener en cuenta antes de la experimentación. ¿Qué preguntas generales o específicas son el investigator(s) tratando de responder? Esto es válido para las hipótesis más impulsada por la investigación; sin embargo, es fundamental para este ensayo porque determinará muchos de los parámetros necesitan para con precisión y responder totalmente a las preguntas. ¿Qué células o líneas celulares (si múltiples) deben utilizarse para representar el sistema fisiológico en estudio? Por ejemplo, en una cutánea herida curación estudio, fibroblastos dérmicos5,6,7, la célula de vástago8o9 de queratinocitos epidérmicos podría considerarse que representan poblaciones de células que se encuentran normalmente en abundancia en el tejido de la piel10. Por otra parte, neutrófilos, macrófagos y otras células inflamatorias podrían evaluarse en este sistema para representar la migración de la célula de otros componentes de la cicatrización en piel tejido10. Además, identificar la línea de celulares específicas evaluando ayudarán a identificar que los reactivos son óptimos para promover la actividad metabólica de la célula. ¿Cómo será migración celular rastreado/imagen? Hay una serie de técnicas utilizadas para observar la migración de la célula dentro de una placa o frasco. Por ejemplo, el teñido o fluorescente etiquetado células y utilizando la fluorescencia o la proyección de imagen confocal para rastrear las células proporciona un fuerte contraste, que permite al investigador a definir claramente el celular y no celular lugares y movimiento celular11 . Otra técnica común, descrita en este estudio, es el uso de microscopía de luz invertido con contraste de fase6,7. Esta alternativa a los tintes de la célula y fluorescencia permite vivir las células de la pista sin tener que arreglar terminal células antes de la proyección de imagen y también permite la captura de imágenes de los mismos pocillos individuales que contienen monocapas de heridos de las células a través de puntos de tiempo. ¿Medidas del resultado que se utilizará para el análisis? Usando las imágenes se reunieron durante todo el estudio, los datos pueden generarse en el que se pueden entender cambios en las tasas de migración celular. En nuestro laboratorio, imágenes microscópicas en el microscopio de luz invertido se suben a software de análisis de imagen y el cierre de la herida por ciento y sumado área bajo la curva (AUC) se calculan.
Destacaremos el uso específico de este ensayo para aclarar cambios en migración de fibroblastos dérmicos en presencia de un contaminante ambiental conocido, arsénico. El arsénico es un metaloide naturalmente que ocurre encontrado en la corteza terrestre. Se han encontrado varios lugares con altos niveles de arsénico, lo que representa un riesgo para las personas que viven cerca de estos lugares. Como resultado, alimentos y fuentes de agua han demostrado que han aumentado los niveles de contaminación con arsénico, que aumenta la probabilidad de individuos a ser expuestos al arsénico. Exposición ambiental de arsénico se ha demostrado que tiene consecuencias a largo plazo de la salud en poblaciones humanas por encima o incluso por debajo de la actual agencia de protección ambiental de Estados Unidos (USEPA) máximo contaminante nivel (MCL) de 10 ppb (10 μg/L)12, 13. aunque la USEPA ha establecido este MCL y considerada segura para beber los límites, las concentraciones de arsénico que exceden este límite no son infrecuentes en las fuentes de agua en todo el mundo. En el sudoeste de Estados Unidos, numerosos agua subterránea, agua de pozo y manantiales han sido documentados para contener en cuanto a niveles de arsénico14. Por ejemplo, en Valle Verde, AZ, Montezuma bien contiene 210 μg/L de arsénico15. Agua subterránea alrededor del río Verde, AZ contiene 16 μg/L de arsénico en promedio, con valores máximos llegando a 1,3 mg/L15,16. En particular, las concentraciones de arsénico en muchos pozos en la vertiente de agua de Río Verde exceden 50 μg/L15,16. Con este conocimiento, las concentraciones de arsénico ambientalmente relevantes fueron seleccionados que van por debajo del MCL en 0.1 μm (7,5 ppb), por encima del MCL en 10 μm (750 ppb) en la corriente estudiar14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
La información obtenida en estos experimentos se utilizará como un indicador temprano de posibles cambios en las tasas de migración celular en un en vivo de la herida contaminado con arsénico. Después, señalando las moléculas pueden ser seleccionadas basados en su papel en facilitar la migración celular y la cicatrización de heridas, y futuro cuantitativa de polimerasa en la reacción en cadena (qPCR) gene expresión experimentos podrán crearse sobre la terminación de la corriente estudios. Si tasas de migración en este ensayo el cambio en la presencia de arsénico, objetivos de genes específicos involucrados en la migración celular pueden ser el blanco de los efectos nocivos de arsénico y así pueden ser el mecanismo de interrupción.

<table><tbody><tr><td>Cabina de seguridad biológica Clase II A/B3</td><td>Forma Scientific</td><td>15201-816</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo</td><td>Kimberly-Clark</td><td>55082</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td></td> de precisión modelo 182 <td></td> con baño de agua Leica Centrífuga Q080318 <td></td></tr><tr><td>CPR</td><td>Beckman</td><td>349702</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> escala analítica Ohaus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>I093 1125062111P</td><td></td></tr><tr><td>Papel de pesaje</td><td>VWR</td><td>H351125781212A</td><td></td></tr><tr><td>Bolsas de riesgo biológico</td><td>Fisherbran</td><td>01-830A</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 con camisa</td><td>de agua Thermo Scientific</td><td>309739-31053</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Solución salina equilibrada</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>automática Drummond</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Gilson</td> p20 Pipeta Gilson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denominador Fisher</td><td>Scientific</td><td>D59707</td><td></td></tr><tr><td>Tinción Azul Trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de pañuelo T75</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cónico</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cónico</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>marcador de tejidos</td><td>Securline</td><td>92167</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas</td><td>Kintech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Fisher</td><td>63-67-0</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta sin filtro</td><td>Fisherbrand</td><td>16160210</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Great Value</td><td>220-04</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353915</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial Rack</td><td>Nalgene</td><td>5030-0505</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Gizmo Supply</td><td>B00SCOGY56</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Rack de tubos cónicos</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3598</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados de residuos</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>Regla de borde recto</td><td>n/ a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos dérmicos neonatales humanos (hDFn)</td><td>lote: 1734, 2902</td><td>106-05n</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio Statistical Software</td><td></td><td>ver: 3.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ver: 1.8.0_112</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro rasguño de análisis para demostrar los efectos del arsénico sobre la migración de la célula de la piel

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Comprensión de los mecanismos fisiológicos de la cicatrización de heridas ha sido el foco de la investigación en curso por muchos años. Esta investigación se traduce directamente en cambios en estándares clínicos utilizados para el tratamiento de heridas y disminuir la morbilidad y la mortalidad para los pacientes. La cicatrización es un proceso complejo que requiere la función y la interacción estratégica de células y tejidos. Una de las muchas funciones críticamente importantes de la cicatrización es individual y colectiva de la migración celular. Sobre lesiones, varias células de la sangre, que rodea los tejidos conectivos y epiteliales rápidamente migran el sitio de la herida mediante estímulos químicos o físicos. Esta respuesta de migración puede dictar en gran medida los resultados y el éxito de una curación de la herida. Comprensión de esta función celular específica es importante para la medicina traslacional que puede conducir a mejores resultados de cicatrización. Aquí, describimos un protocolo utilizado para entender mejor la migración celular lo que respecta a la cicatrización de heridas, y cómo los cambios en el entorno celular pueden alterar significativamente este proceso. En este estudio ejemplo, fibroblastos dérmicos fueron cultivados en medio suplementado con suero bovino fetal (FBS) como cultivos de monocapa en frascos de cultivo de tejidos. Las células se transfirieron en placas de cultivo de tejidos tratado 12-bien asépticamente y crecidas a 100% de confluencia. Al llegar a la confluencia, las células de la monocapa se rayada verticalmente usando una punta de pipeta p200. Arsénico diluido en medio de cultivo suplementado con SBF ha sido añadido a pocillos individuales en ambientalmente relevantes dosis entre 0.1-10 M. imágenes fueron capturadas cada 4 horas (h) durante un período de 24 horas usando un microscopio invertido de luz observar la migración celular (de la herida cierre). Imágenes individualmente fueron analizadas utilizando el software de análisis de imagen y cierre la herida por ciento fue calculado. Los resultados demuestran que el arsénico retrasa la cicatrización de heridas. Esta técnica proporciona una primera pantalla de rápido y de bajo costo para la evaluación de los efectos de los contaminantes en la cicatrización de heridas.

Tamaños de muestra (n) para todos los grupos de tratamiento fue de n = 28. Las células fueron cultivadas con éxito técnicas asépticas y protocolos de laboratorio (figura 1). Se observaron arañazos uniforme en todos los grupos de tratamiento con la anchura cero media miden 0,8 mm 0,4 mm (figura 2). Grupos de control tenían una superficie media de resumidos bajo el valor de la curva de 1,355.83; 0,01 μm como grupos de tratamiento tuvo un promedio suman área bajo el valor de la curva de 1,366.21; 0,1 μm como grupos de tratamiento tuvo un promedio suman área bajo el valor de la curva de 1,326.24, 1,0 μm como grupo de tratamiento tuvo un promedio suman área bajo el valor de la curva de 1,295.10; y finalmente el μm 10 como grupo de tratamiento tenía una superficie media de resumidos bajo el valor de la curva de 535.12, que fue estadísticamente menor en comparación con todos los demás grupos (p &lt; 0.05) (figura 3). R-programa para el análisis estadístico se utilizó para realizar un ANOVA unidireccional con un ajuste de post hoc de Tukey para determinar diferencias estadísticas entre grupos de tratamiento (p &lt; 0.05).
<img alt="Crecimiento celular bajo exposición al arsénico; resultados de microscopía; control, 1,0 μM y 10 μM As durante 20 horas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: cero representante de ensayo imágenes durante un período de 20 h. Imágenes A-d representan migración celular de las células control; imágenes E-H representan migración celular de células llenas de 1.0 μm. Imágenes L representan migración celular de células contaminadas con 10 μm como. De estas imágenes, queda claro que la migración celular es más lento en presencia de arsénico. Las imágenes de control muestran un rasguño totalmente "curados" después de 20 h, mientras que los otros dos grupos como tratamiento no fueron "curados". 10 μm como tratamiento inhibió el encierro completo en conjunto después de 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras que muestra la respuesta a la dosis de arsénico; AUC sumado a concentraciones variables; resultados experimentales." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: arsénico disminuye migración celular en el ensayo memoria. Imágenes fueron capturadas durante un período de 24 horas para observar los cambios a las tasas de migración celular en presencia de diferentes concentraciones de arsénico. Imágenes RAW se analizaron con un software automatizado (por ejemplo, en MATLAB), que herida inicialmente medido la anchura, luego calcula cierre por ciento y finalmente el área bajo la curva (AUC). Barras de error representan el error estándar de la media. 10 μm como grupo de tratamiento estadísticamente se desaceleró migración celular de humanos fibroblastos dérmicos neonatales (hDFn), por un valor AUC estadísticamente más bajo, comparado con otros grupos de tratamiento utilizando un ANOVA unidireccional con un ajuste de post hoc de Tukey (p) &lt; 0.05). Las diferencias estadísticas son representadas por las letras "A" y "B", que se obtuvieron mediante el método de pantalla compacta de letra en R-programa. Tratamientos que no comparten una letra común son estadísticamente significativos entre sí (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este estudio se centra en un modelo en vitro de herida curativa (rasguño ensayo) como un mecanismo para la determinación de contaminantes ambientales como como la migración celular de la influencia de arsénico. Los resultados demuestran que este ensayo in vitro proporciona indicaciones rápidas y tempranas de los cambios en la migración celular antes de la experimentación en vivo .

In Vitro Rasguño de análisis para demostrar los efectos del arsénico sobre la migración de la célula de la piel

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

La migración celular es un proceso crítico de cicatrización de heridas que puede alterar drásticamente el resultado de una herida curativa. Este protocolo permite a los investigadores comprender mejor el efecto de varios compuestos en la migración celular durante la cicatrización de heridas. Lo que a menudo puede conducir a estrategias de tratamiento dirigidas para la medicina clínica.El ensayo de rasguños es un enfoque rentable y de alto rendimiento para generar datos significativos de cicatrización de heridas antes de costosas y costosas pruebas in vivo que requieren mucho tiempo. El ensayo de arañazos como método es particularmente relevante en aplicaciones de cicatrización de heridas. Más específicamente, la piel.Sin embargo, el ensayo es realmente un ensayo de migración, y podría aplicarse a cualquier tipo de celda donde la migración de celdas sea de interés para medir o capturar. Similar al cultivo clásico de células y tejidos, procedimientos operativos estándar, entrenamiento, técnica y práctica, práctica, práctica. Esos son la clave del éxito con el ensayo de rasguños.Demostrar el procedimiento estarán Nathan Cruz, un estudiante de maestría, y Oscar Lujan, un investigador de pregrado. Para comenzar este procedimiento, prepare el gabinete de bioseguridad II utilizando una solución acuosa 70%isopropilo para realizar una limpieza de saneamiento, comenzando en las paredes posterior y lateral, y trabajando hasta la placa base. También limpie todos los materiales que se utilizarán en el ensayo antes de colocarlos en el armario.A continuación, obtenga viales que contengan la línea celular crioconservada deseada y colóquelo en un baño de agua de un centímetro de profundidad a 37 grados centígrados para descongelar. Añadir 10 mililitros de medio suplementados con 10%FBS en un matraz de cultivo de tejido T75. Abra el vial que contiene el stock celular y aspire cuidadosamente la solución.Luego transfiera las células al matraz T75. Retire un mililitro de medios del matraz, y transfiérelo de nuevo al vial, y luego transfiéralo de nuevo al matraz para maximizar el rendimiento celular del vial. Apriete la tapa del matraz y estremezca suavemente para dispersar uniformemente las células en suspensión por toda la superficie.Después de esto, etiquete el matraz con la información que se muestra aquí, y colóquelo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. En primer lugar, recupere el matraz de cultivo de tejido de la incubadora y observe las células adheridas como se describe en el protocolo de texto. Aspirar todo el volumen de medios del matraz y transferirlo a un contenedor de residuos.Agregue cinco mililitros de solución salina equilibrada al matraz y estremece suavemente para enjuagar cualquier exceso de medios, células muertas o producto de desecho. A continuación, retire todo el volumen de solución salina del matraz y deséchela en un recipiente de residuos. A continuación, agregue dos mililitros de trippsina al matraz y mezcle suavemente para dispersar la enzima sobre las células adheridas.Asegúrese de que la superficie adherente esté completamente saturada y coloque el matraz de tejido en la incubadora durante dos o tres minutos. Después de esto, toque suavemente el lado del matraz de tres a cinco veces para ayudar a facilitar el desprendimiento de celdas. Limpie el matraz con 70% de alcohol y colóquelo en el gabinete de bioseguridad.Añadir cinco mililitros de medios de stock al matraz de tejido para detener la reacción del sustrato enzimático. Aspirar todo el volumen de líquido del matraz y transferirlo a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Centrifugar a 200 g y a 25 grados centígrados durante cinco minutos.Luego use 70%alcohol para limpiar el tubo que contiene las células peletadas, y colóquelo dentro del gabinete de bioseguridad. Pipeta fuera de los medios, dejando atrás aproximadamente 250 microlitros de líquido con el pellet celular. Ejecute la parte inferior del tubo cónico a través de las ranuras del vial de un bastidor de tubo de microcentrífuga para crear una vibración rápida y perturbar y resuspender el pellet celular.Cuando se complete correctamente, la nueva solución celular aparecerá como una mezcla turbia sin pellet restante. Agregue dos mililitros de medios a la resuspensión celular. Pipetear las células suavemente hacia arriba y hacia abajo en el lado del tubo 20 veces para romper cualquier grupo.Y registre el volumen total de la suspensión celular. A continuación, utilice una pipeta estéril para añadir 20 microlitros de material azul tripano a un pozo vacío de una placa de 96 pozos. Con una punta de pipeta estéril, transfiera 20 microlitros de material celular del tubo de 15 mililitros al pozo que contiene la solución azul tripano.Pipetear suavemente para mezclar el contenido y transferir 10 microlitros de la mezcla entre el resbalón de la cubierta y la cámara de recuento en un hemocitoómetro. Cuente solo las celdas en el centro y cuatro cuadrados de esquina, contando por separado el recuento total de celdas y el recuento de celdas no viables para los cinco cuadrados identificados. Después de calcular el recuento de células viable, marque una línea horizontal en la parte inferior de una placa de 12 pozos para servir como marca de referencia durante la toma de imágenes.Diluir el stock celular con medios a una densidad de 19.000 células por mililitro. Luego sembra cada pozo de la placa de 12 pozos con un mililitro del stock celular diluido, mezclando el stock celular periódicamente para asegurar una siembra celular uniforme en los 12 pozos. Etiquete cada placa con la información que se muestra aquí.Y colóquelo en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que las células crezcan al 100% de confluencia. Recuperar una placa de 12 pozos con células de la incubadora. Usando un microscopio con un objetivo 10x, observe las células y determine la confluencia dentro de cada pozo.A continuación, aspirar y deshacerse de los medios de crecimiento de cada pozo. Montar una pipeta P200 con una punta estéril de 1-200 microlitrotro. En cada pozo, deslice la punta de la pipeta a través de la superficie de la celda desde la ubicación de las 12:00 hasta la ubicación de las 6:00 para producir una herida simulada de arañazos.Enjuague cada pozo con un mililitro de solución de sal equilibrada para eliminar el exceso de residuos y grumos celulares. Mece la placa de lado a lado para facilitar el lavado. A continuación, retire y deseche la solución de sal equilibrada de cada pozo.Usando un pipetter P1000 con una punta de 1.000 microlitros, agregue 1.000 microlitros de las existencias de arsénico preparadas en pozos que han sido asignados aleatoriamente con un grupo de tratamiento. Utilice una nueva punta de pipeta para cada pozo y registre el tiempo en que se agregan los tratamientos. Incubar las placas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.Para crear imágenes de las placas, capture imágenes de cada pozo con un aumento objetivo de 10 veces cada cuatro horas durante un período de 24 horas. Haga referencia a la línea dibujada anteriormente en la parte inferior de la placa para crear una imagen de la misma ubicación a lo largo del rasguño dentro de cada pozo en cada punto de tiempo. En este estudio, se utiliza un ensayo de prueba de scratch in vivo para observar los efectos del arsénico en la migración celular.Se observan arañazos uniformes en todos los grupos de tratamiento, con una anchura media de arañazo de aproximadamente 0,8 milímetros. Las células de control muestran un rasguño completamente curado después de 20 horas. Los dos grupos de arsénico no muestran este nivel de curación.Con el tratamiento de 10 micromolares inhibiendo el cierre por completo durante 24 horas. Estos resultados demuestran que la presencia de arsénico ralentiza la migración celular. Las imágenes sin procesar capturadas durante el ensayo se analizan utilizando software automatizado para medir el ancho de la herida, luego calcular el porcentaje de cierre y, finalmente, calcular el área debajo de la curva.El grupo de tratamiento de 10 micromolares muestra una migración celular estadísticamente lenta de fibroblastos dérmicos neonatales humanos en comparación con todos los demás grupos de tratamiento. Es importante practicar a fondo esta técnica para aumentar la consistencia al rascar las células. La variabilidad involuntaria entre los ensayos puede potencialmente sesgar los datos y alterar las conclusiones.Se pueden emplear otras técnicas moleculares, como la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa y los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, para identificar señales y proteínas mensajeras que puedan ser el objetivo de los cambios en la migración celular observados en el ensayo. Este ensayo ha contribuido a la comprensión de los investigadores de la metástasis del cáncer, nuevas terapias emergentes contra el cáncer, células madre y medicina regenerativa, y muchos otros hitos científicos.

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