Lípidos bicapa experimentos con bicapas de burbuja contacto para parche-abrazaderas
16 de enero de 2019
Aquí, presentamos un protocolo para la formación de bicapas lipídicas soportadas utilizando un método de contacto burbuja bicapa. Se sopla una burbuja de agua en un solvente orgánico, por el que se forma una monocapa en la interfase agua-aceite. Dos pipetas son manipulados para acoplar las burbujas para formar una bicapa.
El método Contact Bubble Bilayer es una técnica alternativa para las bicapas lipídicas convencionales. y este método permite una vibración más versátil a través de la membrana. El método CBB integra los beneficios de Planar Lipid Bilayer y el método de abrazadera de parche.
Como técnica de bicapía de lípidos se puede formar un CBB con una composición lipídica arbitraria. Hemos desarrollado un CBB para grabaciones de corriente de canal único con alta relación señal-ruido. Este método permite variedades de vibraciones de membrana y ofrece una plataforma de tipo vasto a la interfaz de membrana de canal.
Todo el mundo ha experimentado soplando una burbuja de jabón. Maniobras similares se toman para la formación de CBB mediante el ajuste manual de la presión aplicada en lugar de soplar por la boca. Practica y disfruta del CBB.
Para ser este procedimiento dispersar los fosfolípidos en cloroformo a una concentración deseada en un matraz inferior redondo. Coloque la solución de fosfolípidos en un evaporador rotatorio conectado a un cilindro de gas nitrógeno. Gire el matraz bajo flujo de nitrógeno a temperatura ambiente hasta que aparezca una película fosfolípida delgada.
A continuación, coloque el matraz abierto en un desecador que esté conectado a una bomba de vacío. Usando la bomba de vacío aspirar el interior del desecador durante varias horas para eliminar el cloroformo a fondo. Posteriormente añadir un volumen adecuado de solución de electrolitos al matraz y suspender el fosfolípido para obtener una suspensión de fosfolípidos de dos mililitros por mililitro.
Sonciate la suspensión durante 20 a 30 segundos usando un sonicador de baño para obtener una suspensión de vesícula multicapa. Para la preparación de proteoliposomas que contengan proteínas de canal iónico, agregue una solución proteica a la suspensión de vesícula multicapa. Y sonicar durante varios segundos usando el sonicador de baño.
Para preparar pipetas de vidrio de diámetro grande, coloque un capilar de vidrio en un tirador de pipeta y fabrique la micropipeta con una punta cónica fina a través de un tirón de dos pasos. A continuación, ajuste la micropipeta en una micro forja y entre en contacto la punta de la micropipeta con un filamento de platino en la porción cónica con un diámetro de 30 a 50 micrómetros. Caliente el filamento brevemente y apáelo inmediatamente.
Usando agua destilada y etanol limpie la superficie del tobogán de vidrio con un pozo poco profundo. A continuación, aplique el reactivo de silicona sobre el portaobjetos de vidrio y deje que el reactivo se seque completamente en el aire. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio en el escenario de un microscopio invertido.
Añadir 100 microlitros de hexadecano en el pozo poco profundo del portaobjetos de vidrio siliconizado. Con una jeringa de tuberculina, llene la solución de electrolitos hasta la mitad de la longitud de la micropipeta. A continuación, ajuste la micropipeta en el soporte de micropipeta con el puerto de presión, lo que permite que el electrodo de alambre de cloruro de plata/plata se empape en la solución de electrolito de pipeta.
Conecte uno de los soportes de micropipeta a la etapa principal de un amplificador de abrazadera de parche y el otro al suelo eléctrico. Posteriormente conecte un microinyector al puerto de presión del soporte de micropipeta. Ajuste la micropipeta a una posición adecuada por encima de la etapa de un microscopio invertido utilizando el micromanipulador.
Para ajustar el potencial de desplazamiento del electrodo, coloque un microlitro de la misma solución de electrolito utilizada para llenar la micropipeta en la superficie plana alrededor del pozo poco profundo de la diapositiva de vidrio para crear una cúpula de electrolito. Sumerja la punta de ambas micropipetas en la cúpula de electrolitos. A continuación, ajuste el potencial de desplazamiento del electrodo del amplificador de abrazadera de parche.
Para extraer la solución liposoma de la punta, agregue un microlitro de solución liposoma en la superficie plana alrededor del pozo poco profundo del vaso deslizante. A continuación, coloque la punta de la micropipeta en el liposoma que contiene la cúpula. Aspirar el liposoma que contiene la solución utilizando el microinyector.
Repita el procedimiento para el otro mircopipetto para aspirar liposomas reconstituidos por canal. Ahora coloque la micropipeta en el hexadecano en el pozo poco profundo. Soplar una burbuja de agua lentamente aumentando la presión hasta que la burbuja alcance el tamaño deseado y mantener la misma presión a partir de entonces.
Deseche la burbuja pasando la punta a través de la interfaz aceite-aire si es difícil mantener el tamaño de la burbuja estable. Repita los procedimientos hasta que se formen dos burbujas estables. Establezca un contacto entre las dos burbujas.
Ajuste la presión para mantener el tamaño de la burbuja, ya que el tamaño puede cambiar gradualmente incluso a la presión constante dentro de la burbuja. Establezca el potencial de membrana en el valor adecuado utilizando el amplificador de reclamación de parche y espere a que surja la corriente del canal. Para la formación estable de la bicacapa lipídica es esencial limpiar las manchas.
La preparación capilar o pipeta de vidrio debe lavarse a fondo y evitar la contaminación por las moléculas de detergente. Una vez que el CBB había formado las moléculas del canal ya sea en solución acuosa o en el liposoma se insertaron espontáneamente en la bicapas en el lapso de unos pocos a docenas de minutos. Las inserciones de los canales fueron confirmadas por el aumento escalonado de la amplitud de corriente bajo el potencial de membrana aplicado.
Una bicacapa formada por el método CBB se puede desintegrar en dos monocapas. La corriente del canal pTB surgió inmediatamente después de conectar las dos monocapas. Y la corriente se hizo más grande a medida que el contacto aumentaba la amplitud de la corriente se sincronizaba con la manipulación de la conexión de desprendimiento del CBB.
Si el número de explosiones de burbujas aumenta la concentración de lípidos en la solución acuosa disminuye y la monocapa no se forma. Luego trata de aliviar la presión sobre la sección de liposomas. Una vez establecida la formación de CBB y la reconstitución del canal, puede intentar variar las composiciones de la solución acuosa y la membrana a través de la profusión o la inyección de sustancias hidrófilas o hidrófobas.
El método CBB ha abierto formas versátiles de explorar las interfaces de membrana de canal.
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Resumen
Este estudio presenta el método de bicapa por burbujas en contacto (CBB, por sus siglas en inglés) para la formación de bicapas lipídicas, ofreciendo una alternativa innovadora frente a las técnicas convencionales. El método permite vibraciones versátiles de la membrana y grabaciones con alta relación señal-ruido de corrientes individuales de canales, mejorando así el estudio de las interacciones entre canales y membranas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biofísica
- Electrofisiología
- Tecnología de membranas lipídicas
Antecedentes
- Las bicapas lipídicas son vitales para el estudio de las proteínas de membrana.
- Los métodos convencionales tienen limitaciones en flexibilidad y estabilidad.
- El método CBB combina las ventajas de las bicapas lipídicas planas y las técnicas de parche de membrana.
- Esta técnica facilita grabaciones de alta calidad de la actividad de los canales iónicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método robusto para la formación de bicapas lipídicas utilizando un enfoque de burbuja de contacto.
- Permitir grabaciones de canales individuales con calidad mejorada.
- Explorar la dinámica de la membrana y las interacciones entre canales y membranas.
Métodos Utilizados
- El método CBB utiliza la manipulación controlada de burbujas de agua en un disolvente orgánico para crear bicapas.
- Los fosfolípidos se preparan y se sonicaron para formar vesículas multicapa, seguido de la incorporación de proteínas de canales iónicos.
- Se fabrican micropipetas para la aplicación precisa y la estabilización de burbujas durante la formación de la bicapa.
- Los montajes experimentales implican amplificadores de parche de membrana para monitorear las corrientes de los canales iónicos tras la formación de la bicapa.
Resultados principales
- El método CBB apoya eficazmente la inserción de proteínas de canal en bicapas, confirmado por cambios en la amplitud de la corriente.
- Se formaron bicapas estables, lo que demuestra la capacidad de registrar corrientes de canales individuales.
- El método mostró que los ajustes en el tamaño de las burbujas pueden afectar la estabilidad de la membrana y la continuidad de la corriente.
Conclusiones
- El método CBB representa un avance significativo en la formación de bicapas lipídicas, lo que permite aplicaciones versátiles en estudios electrofisiológicos.
- Este enfoque innovador mejora nuestra comprensión de la dinámica canal-membrana.
- Los hallazgos subrayan el potencial de adaptar las tecnologías de bicapas lipídicas a diversas condiciones experimentales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El método de la bicapa de burbujas en contacto (CBB) aborda un desafío clave en la investigación de canales iónicos al permitir registros con una alta relación señal-ruido, al mismo tiempo que posibilita un control preciso sobre la composición lipídica y la mecánica de la membrana. Esta capacidad facilita la desactivación mecanicista de dianas terapéuticas al aclarar las interacciones entre canales y membranas en condiciones fisiológicamente relevantes. El método mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar una plataforma reproducible para la validación funcional de dianas de canales iónicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el estudio de la función de los canales iónicos en entornos lipídicos definidos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de objetivos terapéuticos mediante mediciones reproductibles de corrientes individuales con bajo ruido eléctrico.
- Valor predictivo: Facilita la reducción de riesgos biológicos al elucidar cómo la composición lipídica modula la actividad y estabilidad del canal.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas validados de bicapas lipídicas para cribado de compuestos posteriores mediante la incorporación de liposomas reconstituidos con canales.
- Valor operativo: Permite la estandarización de ensayos mediante la formación controlada de burbujas y la renovación consistente de la bicapa.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma mediante ciclos repetidos de formación y ruptura de la bicapa de burbujas de cisaillement (CBB).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Mantiene la relevancia desde el descubrimiento hasta el trabajo preclínico mediante la modelización de composiciones lipídicas relacionadas con la enfermedad.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite evaluar cómo las perturbaciones de la membrana afectan la función del canal, aportando información para predicciones de seguridad y eficacia.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la identificación de fenotipos de canales dependientes de lípidos que podrían correlacionarse con respuestas clínicas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método CBB se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando una plataforma controlable por lípidos para la caracterización de canales iónicos antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la variación controlada de la composición lipídica de la membrana.
- Selección: Permite estar listo para ensayos mediante la formación reproducible de bicapas e incorporación estable de canales iónicos.
- Análisis: Proporciona lecturas cuantitativas de corrientes de canales individuales que permiten comparar el comportamiento del canal en diferentes condiciones.
- Investigación Traductiva: Se conecta con trabajos preclínicos al permitir el estudio de las interacciones canal-membrana en entornos lipídicos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad renovable en lugar de una técnica de uso único, favoreciendo su uso sostenido en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las interacciones entre canales y membranas.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante el mantenimiento controlado del tamaño de las burbujas y la renovación de la bicapa.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos funcionales confiables sobre objetivos de canales iónicos desde las primeras etapas del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de canales iónicos basada en la actividad dependiente de la membrana validada.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de lípidos, electrofisiología y manipulación de microfluidos.
- Depende de amplificadores para registro mediante parche, tiradores de capilares de vidrio e inyectores microscópicos para la formación de burbujas y el control de presión.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de lípidos, el control del tamaño de las burbujas y los protocolos de limpieza.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes tipos de canales iónicos o mezclas lipídicas.
- Presenta limitaciones prácticas, como la necesidad de mantener cuidadosamente el tamaño de las burbujas y evitar la contaminación durante la preparación de las pipetas.
