Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO₂ cuentas para purificación de proteínas

Este método se puede utilizar para preparar superficies activadas por biomoléculas, que tienen aplicaciones en áreas como la administración de fármacos, la detección biológica de objetivos y la separación biológica. La principal ventaja de esta técnica es que los cepillos poli PFPA son altamente reactivos con aminas, y la inmovilización de anticuerpos se logra mediante la incubación en solución tampón durante unas horas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la purificación de proteínas a través de la inmunopurificación, ya que el anticuerpo inmovilizado puede unirse con éxito con antígenos diana.

Aunque este método está demostrado para la movilización de anticuerpos y la purificación de proteínas, también se puede aplicar a otros sistemas que requieren movilización biomolecular. Para tratar las perlas de dióxido de silicio con APTES, primero obtenga partículas de dióxido de silicio en forma de una suspensión acuosa de volumen de 5% de peso. Combine 0,8 mililitros de suspensión de dióxido de silicio con 40 miligramos de APTES, y ocho mililitros de metanol en un vial de centelleo de 20 mililitros equipado con una barra de agitación.

Deje que la reacción continúe a temperatura ambiente durante cinco horas con agitación vigorosa. Después de cinco horas, transfiera la solución a un tubo cónico. Para aislar las perlas de dióxido de silicona funcionalizada APTES, centrifuga la solución a 10.000 G durante cinco minutos.

A continuación, retire el sobrenadante. Ahora lave las cuentas redistribuyéndolas en tres mililitros de metanol fresco. Agitar el tubo a mano para mezclar, pero si es necesario, mejorar la dispersión por sonicación en un baño de agua durante unos segundos.

Centrifugar como antes, y repita el paso de lavado una vez más. Combine las perlas de dióxido de silicona de lavado de metanol con tres mililitros de dimetil sulfóxido, o DMSO. Agitar la mezcla a mano, o si es necesario, sonicar durante unos segundos hasta que las perlas estén completamente dispersas en el DMSO.

Después de la centrifugación antes, retire el sobrenadante. Repita el paso de centrifugación una última vez para garantizar el intercambio completo de disolventes de metanol a DMSO. Para preparar la solución de poli PFPA, disolver 20 miligramos de poli PFPA en dos mililitros de DMSO en un vial de centelleo de 20 mililitros.

Para preparar la solución PEG, disolver la amina funcionalizada PEG en un mililitro de DMSO. Ahora transfiera la solución PEG a la solución poly PFPA. Reacciona a temperatura ambiente durante una hora con una agitación vigorosa.

Transfiera un mililitro de las perlas de dióxido de silicio funcionalizada APTES suspendidas en DMSO a la solución de poli PFPA sustituida por PEG. Permita que el injerto entre las perlas de dióxido de silicio funcionalizadas poly PFPA y APTES proceda a temperatura ambiente durante una hora con agitación vigorosa. Luego aísle las perlas por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos, seguido de la eliminación del sobrenadante.

Lave las cuentas añadiendo tres mililitros de DMSO, y mezcle a mano o con unos segundos de sonicación. Centrifugar las cuentas como antes. Y retire el sobrenadante antes de repetir el lavado DMSO dos veces.

Lave las cuentas dos veces más con tres mililitros de agua triple destilada. A continuación, mezcle a mano o con unos segundos de sonicación. Centrifugar las perlas como antes y quitar el sobrenadante.

Finalmente secar las cuentas a 40 grados centígrados en un horno de vacío durante la noche. Añadir cinco miligramos de perlas de dióxido de silicio injertado de poli PFPA a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Lave las perlas añadiendo 800 microlitros de PBS, y mezcle bien por vórtice.

Centrifugar las perlas a 10.000 G a temperatura ambiente durante un minuto. Retire el sobrenadante y repita el paso de lavado tres veces. Ahora agregue 350 microlitros de PBS fresco, 50 microlitros de 0.1%PBST y 6.67 microgramos del anticuerpo.

Incubar aproximadamente 20 horas en un rotador a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las cuentas y la centrífuga a 400 G y cuatro grados centígrados durante un minuto. A continuación, retire el sobrenadante y agregue cuidadosamente 400 microlitros de tampón de lelisis.

Resuspender suavemente las cuentas pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Repita este paso de lavado tres veces. Después del lavado final, retire la mayor cantidad posible del sobrenadante.

Prepare las celdas y el búfer de lysis como se describe en el protocolo de texto. A continuación, resuspender el pellet celular con 400 microlitros del tampón de lelisis. Sonicar las células usando un ultra sonicador.

Después de la sonicación, vórtice brevemente. Luego centrifuga el lysate a 20.000 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.

Para realizar la inmunoprecipitación, transfiera 300 microlitros de izado celular a perlas de dióxido de silicio inmovilizada de poli PFPA previamente preparadas. Conservar 30 microlitros de la célula de licate como muestra de entrada en un nuevo tubo de microcentrífuga. Incubar la mezcla de cuentas de izado durante tres horas en un rotador a cuatro grados centígrados.

Después de la incubación, centrifugar la mezcla a 400 G a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire el sobrenadante y agregue cuidadosamente 400 microlitros de tampón de lavado. Resuspender suavemente las cuentas pipeteando hacia arriba y hacia abajo unas cinco veces.

Después de tres lavados, retire la mayor cantidad de sobrenadante posible. Agregue 30 microlitros de 2x de tinte de carga SDS a las perlas y a la muestra de entrada. Luego calienta durante 10 minutos a 95 grados centígrados.

Después del calentamiento, analice la muestra usando hinchazón occidental, o almacene la muestra a menos 20 grados centígrados. Las perlas de sílice funcionalizadas se examinan mediante espectroscopia de fotoelectrón de rayos X, o XPS, para determinar la composición de la superficie. Los datos XPS representativos se muestran aquí.

Tras el tratamiento con APTES, se detecta el pico de nitrógeno 1s asociado con la zona del grupo de aminas APTES. Después del tratamiento con poli PFPA, se detecta el pico de flúor 1s asociado con las unidades PFP en el polímero. Se realiza el ARN de proteína quinasa activado, o el enriquecimiento PKR a través de la inmunoprecipitación, y la muestra de proteína aludida se analiza utilizando la hinchazón occidental.

Como era de esperar, las perlas inmovilizadas sin anticuerpos o una mezcla de anticuerpos no específica no muestran ninguna recuperación PKR. Las perlas incubadas con anti-PKR pueden enriquecer con éxito PKR como lo indica la presencia de una banda PKR y la ausencia de banda GAPDH. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que al comparar los sistemas, los experimentos de IP, así como el posterior análisis de hinchazón occidental deben realizarse simultáneamente.

Después de su desarrollo, esta técnica se puede utilizar para la inmovilización de diferentes sustratos biomoleculares o materiales. Además, este método tiene la ventaja adicional de ajustar solo la propiedad de superficie para adaptarse a las necesidades de cada aplicación.