Name: Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO2 cuentas para purificación de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprende a preparar perlas de sílice funcionalizadas con poli(pentafluorofenil acrilato) para purificación de proteínas mediante inmunoprecipitación. Este método permite inmovilizar anticuerpos eficazmente y mejorar la separación de proteínas objetivo.

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Este trabajo fue financiado por la Agencia para el desarrollo de defensa (Grant no. UD170039ID).

1. preparación de homopolímero de Poly(PFPA)
<ol><li>Recristalización de AIBN<ol>
<li>5 g de 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) se combinan con 25 mL de metanol en un matraz de 250 mL. Sumerja el vaso en un baño de aceite de 60 ° C, luego agitar vigorosamente la mezcla con una barra de agitación hasta que se haya disuelto completamente AIBN.</li>
		<li>Filtrar la solución caliente a través de papel filtro (retención de partículas de 5-8 μm) y guardar el filtrado a 4 ° C para permitir que los cristales que forma lentamente.</li>
		<li>Recoger el AIBN recristalizada por filtración. Combinar el producto recogido con 25 mL de metanol fresco y repita el proceso de recristalización.</li>
		<li>Seco durante la noche 2 x AIBN recristalizado en una estufa de vacío a temperatura ambiente (RT). Almacenar el producto en la oscuridad a <-10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Síntesis de benzyl dithiobenzoate25<ol>
<li>Preparar un matraz de fondo redondo 500 mL cuello tres equipado con una barra de agitación magnética, un condensador de temperatura, un embudo y una membrana de goma. Conectar el matraz a la línea de gas de nitrógeno a través del condensador temperatura y enjuague el interior aire con nitrógeno. Inserte un termómetro a través del tabique. Añadir (0.041 mol) de 41 mL de solución de 1 M de bromuro del phenylmagnesium en tetrahidrofurano (THF) a través de una jeringa a través del mismo tabique.</li>
		<li>Caliente la solución de bromuro del phenylmagnesium a 40 ° C en baño de aceite. Añadir a continuación 3,1 g (0.041 mol) de disulfuro de carbono a través del embudo poco a poco, manteniendo la temperatura de la solución a 40 ° C.</li>
		<li>Añadir a la mezcla resultante en el embudo más 15 min aumento de la temperatura de reacción a 50 ° C. g 7,1 (0.042 mol) de bromuro de bencilo Continúe revolviendo a esta temperatura durante 45 minutos.</li>
		<li>Transferir la mezcla de reacción a un embudo de separatory y diluir con 15 mL de agua helada. Extraer el producto añadiendo 15 mL de éter dietílico y quitar la capa más baja de agua. Repetir la extracción con éter dietílico dos veces más.</li>
		<li>Las fases orgánicas combinadas con abundante cantidad de agua y salmuera (solución de 50% (p/v) de NaCl en agua) de lavar y secar el producto sobre el sulfato de magnesio anhidro.</li>
		<li>Eliminar el disolvente en vacío a 35 ° C utilizando un evaporador rotatorio.</li>
		<li>Purifique el producto por cromatografía en columna con 400 mL de gel de silicona (tamaño de poro 60 Å, tamaño de partícula de malla de 63-200) y éter de petróleo como eluyente, rendimiento 5 g de benzyl dithiobenzoate (BDB) como aceite rojo. Confirmar la pureza de producto por 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.02 7.99 (2 H, m), 7,55 7,50 (1 H, m), 7,29 de 7.41 (7 H, m), 4.60 (2 H, s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Síntesis de poly(PFPA) via balsa polimerización9,26<ol>
<li>Monómero PFPA disponible comercialmente contiene pequeña cantidad de inhibidores. Antes de la polimerización, remover los inhibidores pasando el monómero a través de una jeringa desechable llena de alúmina básica.</li>
		<li>Agregar 0,4 mg (0.0024 mmol) de AIBN recristalizada, 4,3 mg (0.018 mmol) de BDB, 1012 mg (4,25 mmol) de PFPA inhibidor libre y 0,7 mL de anisole anhidro en un matraz Schlenk de 20 mL.</li>
		<li>Conectar el matraz a la línea de Schlenk y desgasificar la mezcla con al menos tres ciclos de congelación-descongelación de la bomba. Brevemente, congelación de la mezcla de reacción en un baño de nitrógeno líquido. Se aplica vacío para eliminar el gas en el espacio. Sellar el frasco y luego retire del nitrógeno líquido para permitir que el contenido se descongele a TA.</li>
		<li>Colocar el matraz en un baño de aceite de 70 ° C y reacciona durante 4 horas en purga de2 N.</li>
		<li>Para terminar la reacción, retirar el matraz del baño de aceite y exponer el contenido de la reacción al aire.</li>
		<li>Precipitar el polímero en metanol frío, luego secar el polímero recuperado en una estufa de vacío a 40 ° C durante la noche.</li>
		<li>Para medir el peso molecular de polímero, utiliza cromatografía de gel permeación (GPC). Uso de THF como tasa de flujo de la fase móvil a 35 ° C con un 1 mL/min y construir la curva de calibración utilizando patrones de poliestireno monodispersa. Para obtener medición de GPC, disolver el polímero en THF (1-2 mg/mL) y el filtro a través del filtro de desechables politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,2 μm. Inyectar 100 μL de la muestra en el instrumento de la GPC. Convertir el tiempo de retención de muestra medidos en peso molecular usando la curva de calibración de poliestireno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de Poly(PFPA) funcionalizados SiO2 granos
<ol><li>Tratamiento de SiO2 granos con APTES<ol>
<li>SiO2 partículas están disponibles en forma de una suspensión acuosa al 5% (w/v). 0,8 mL de SiO2 suspensión se combinan con 40 mg de APTES y 8 mL de metanol en un vial de centelleo 20 mL equipado con una barra de agitación.</li>
		<li>Permitir la reacción proceder a temperatura ambiente durante 5 horas con agitación vigorosa.</li>
		<li>Transferir la solución a un tubo cónico. Para aislar las APTES funcionalizados SiO2 granos, centrifugar la solución a 10.000 x g durante 5 minutos, luego quite el sobrenadante. Lavar los granos por volver a los dispersantes en 3 mL de metanol fresco. Agite el tubo con la mano para mezclar, pero si es necesario, mejorar la dispersión por sonicación en un baño de agua durante unos segundos. Centrifugue los granos a 10.000 x g durante 5 minutos retirar el sobrenadante y repetir el lavado una vez más.</li>
		<li>Combinar el metanol lavado SiO2 granos con 3 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Agite la mezcla a mano, o si es necesario someter a ultrasonidos durante unos segundos, hasta que los granos están totalmente dispersas en DMSO. Centrifugue los granos a 10.000 x g durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante. Repita el paso para asegurar el completo intercambio de solvente de metanol a DMSO. Nota: La suspensión final contiene las APTES funcionalizados SiO2 granos dispersión en 4 mL de DMSO.</li>
		<li>Para comprobar la distribución de tamaño de partícula, realizar análisis DLS. Tomar una gota de la suspensión preparada en el paso 2.1.4 y lugar en una cubeta UV desechable. Diluir la muestra llenando la cubeta con DMSO fresco hasta que esté 2/3 completo. Introduzca la muestra en el soporte de celular para comenzar la adquisición de datos. Para la medición de tamaño de partícula, utilice los siguientes parámetros de configuración: temperatura: 25 ° C; Tiempo de equilibrado: 120 s; Duración de medición: automático.</li>
		<li>Para comprobar la composición superficial, realizar análisis XPS. Seco una pequeña muestra de la suspensión preparada en el paso 2.1.4 en estufa de vacío a 40 ° C durante la noche. Tome el paquete y polímero seca uniformemente sobre un portamuestras de 0,5 x 0,5 cm. Cargar la muestra en la cámara de alto vacío (10-8 torr) y comenzar la adquisición de datos. Para el particular XPS instrumento, generar los fotoelectrones usando un monocromático Al Kα radiografía funcionados en 15 kV y mA 6,7 y recoger mediante ampliación de modo híbrido con el analizador en un eV 50 pasan energía para espectros de alta resolución, y un eV 100 pasar energía para los estudios elementales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injerto poly(PFPA) de APTES funcionalizados SiO2 granos<ol>
<li>Preparar la solución poly(PFPA) 20 mg de poly(PFPA) en 2 mL de DMSO en un vial de centelleo 20 mL de disolución. Nota: En este estudio, se utiliza un poly(PFPA) de relativamente bajo peso molecular (20 kg/mol). Así, a pesar de la concentración de polímero de alta (10 mg/mL), no se observa ninguna evidencia de la reticulación del polímero. Si se utiliza un polímero de peso molecular mayor, concentración de la solución de polímero deba ajustarse para evitar entrecruzamiento posible.</li>
		<li>Añadir 1 mL de APTES funcionalizados SiO2 cuentas suspendidas en DMSO (del paso 2.1.4) para la solución de poly(PFPA). Reaccionan a temperatura ambiente durante 1 h con agitación vigorosa.</li>
		<li>Aislar los poly(PFPA) injertado SiO2 granos por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min, seguida de la eliminación del sobrenadante. Lavar los granos mediante la adición de 3 mL de DMSO y mezclar bien agitando con la mano o algunos segundos de sonicación. Centrifugue los granos a 10.000 x g durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante. Repita el lavado de los granos de2 SiO poly(PFPA) injertado con DMSO dos veces.</li>
		<li>Lavar los granos dos veces más con agua destilada triple (TDW). En este paso, combinar las perlas con 3 mL de capacidad, entonces la mezcla agitando con la mano o algunos segundos de sonicación. Centrifugue los granos a 10.000 x g durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante.</li>
		<li>Para comprobar la distribución de tamaño de partícula, realizar siguiendo el procedimiento descrito en el paso 2.1.5 DLS. Para comprobar la química de superficies, realizar XPS siguiendo el procedimiento descrito en el paso 2.1.6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación de SiO2 granos injertan con PEG-Substituted Poly(PFPA)
<ol><li>Para preparar la solución poly(PFPA), disolver 20 mg de poly(PFPA) en 2 mL de DMSO en un vial de centelleo de 20 mL.</li>
	<li>Para preparar la solución de PEG, disolver amine functionalized PEG en 1 mL de DMSO. La cantidad exacta de PEG utilizado está determinado por el grado deseado de la sustitución de la PFP, determinada por la ecuación se muestra a continuación: Cantidad de amino-PEG (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % PEG-Sub) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA)) donde N_poly(PFPA) = poly(PFPA) grado de polimerización % Sub PEG = sustitución de PEG por ciento MW_PEG = peso molecular de amino-PEG MW_ poly(PFPA) = peso molecular de poly(PFPA)</li>
	<li>Transferir la solución de PEG a la solución de poly(PFPA). Reaccionan a temperatura ambiente durante 1 h con agitación vigorosa.</li>
	<li>Para preparar APTES funcionalizados SiO2 cuentas suspendidas en DMSO, la misma seguir instrucciones indicadas en el paso 2.1. Transfiera 1 mL de la suspensión de grano en la solución de PEG-substituted poly(PFPA) preparada en el paso 3.3. Permitir que el injerto entre poly(PFPA) y APTES funcionalizados SiO2 cuentas para proceder a temperatura ambiente durante 1 h con agitación vigorosa.</li>
	<li>Aislar los granos por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min, seguida de la eliminación del sobrenadante. Lavar los granos mediante la adición de 3 mL de DMSO y mezclar bien agitando con la mano o algunos segundos de sonicación. Centrifugue los granos a 10.000 x g durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante. Repetir el lavado de DMSO dos veces.</li>
	<li>Lavar los granos dos veces más con el TDW. En este paso, combinar las perlas con 3 mL de capacidad, entonces la mezcla agitando con la mano o algunos segundos de sonicación. Centrifugue los granos a 10.000 x g durante 5 minutos, luego retire el sobrenadante.</li>
	<li>Secar los granos a 40 ° C en una estufa de vacío durante la noche.</li>
</ol>4. anticuerpo inmovilización en Poly(PFPA) injertado SiO2 granos
Nota: Se utiliza el mismo procedimiento independientemente de la sustitución de PEG por ciento en poly(PFPA). Preparar el tampón fosfato salino (PBS) por disolución de la tableta de PBS en TDW. Preparar solución salina tamponada fosfato 0,1% (v/v) con Tween-20 (SAFT) mediante la adición de 1/1000 de Tween-20 en PBS.
<ol><li>Añadir 5 mg de poly(PFPA) injertado SiO2 bolas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Lavar los granos al añadir 800 μl de PBS y mezclar bien todo con un vórtex. Centrifugue los granos a 10.000 x g a temperatura ambiente durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y repetir el lavado tres veces.</li>
	<li>Añadir 350 μl de PBS fresco, 50 μl 0,1% (v/v) Saft y 6.67 μg de anticuerpo. Incubar 20 h en un rotador a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar los granos para eliminar los anticuerpos no Unidos. Centrifugue los granos a 400 x g y 4 ° C por 1 min Quite el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lisis con cuidado. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas mediante pipeteo arriba y abajo por cinco veces. Nota: Tampón de lisis utilizado para lavar los granos debe ser la misma utilizada durante la lisis celular y la propiedad intelectual, excepto que la adición de Ditiotreitol y proteasa inhibidor son opcional, (ver paso 5).</li>
	<li>Repetir este lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar el sobrenadante tanto como sea posible.</li>
</ol>5. la célula Lysis e inmunoprecipitación
<ol><li>Preparación de buffer de lisis y tampón de lavado<ol>
<li>Preparar el tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0.5% (v/v) NP-40, glicerol al 10% (v/v), 1 mM Ditiotreitol (DTT) y proteasa inhibidor de cóctel).</li>
		<li>Preparar el tampón de lavado (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM KCl, 0.1% (v/v) NP-40 y 10% (v/v) glicerol).</li>
		<li>Almacenar las soluciones a 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de las células<ol>
<li>Semilla (células HeLa) uno o dos días antes del experimento IP y crecen las células a 37 ° C y 5% CO2.</li>
		<li>Recoger aproximadamente 1.4 x 107 células con un raspador celular y transferencia en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 380 x g a temperatura ambiente durante 3 minutos Retire el sobrenadante y resuspender con 1 mL de PBS frío y la transferencia en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar las células a 10.000 x g a 4 ° C durante 30 s. Retire el sobrenadante limpio. Gránulos de células pueden almacenarse a-80 ° C después de retirar el sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de lysates de la célula<ol>
<li>Resuspenda el sedimento celular con 400 μL del buffer de lisis. Someter a ultrasonidos las células usando un ultrasonicador.</li>
		<li>Después de la sonicación, vortex brevemente y centrifugar el lisado a 20.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1.5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inmunoprecipitación<ol>
<li>Transferir 300 μL de lisado de célula a anticuerpo previamente preparadas se incubaron poly(PFPA) injertado SiO2 granos. Conservar 30 μl de la célula lisada como la muestra de entrada en un nuevo tubo de microcentrífuga. Tienda la entrada muestra a 4 ° C. Nota: La cantidad total de proteína en lisado de célula debe ser aproximadamente de 4 mg.</li>
		<li>Incubar la mezcla del lisado cuentas por 3 h en un rotador a 4 ° C.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla a 400 x g a 4 ° C durante 1 minuto, retirar el sobrenadante y añadir 400 μL de tampón de lavado cuidadosamente. Suavemente, vuelva a suspender las cuentas mediante pipeteo arriba y abajo unas cinco veces.</li>
		<li>Repetir este lavado tres veces. Después del último lavado, eliminar el sobrenadante tanto como sea posible.</li>
		<li>Preparar 2 x sodio dodecil sulfato (SDS) carga del tinte (glicerol al 25% (v/v), 0.1% (p/v) bromo fenol azul (BPB), 60 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% (p/v) de SDS y 2,75 mM 2-Mercaptoetanol). Tienda 2 x tinte de carga SDS a-20 ° C. Añadir 30 μl de 2 x tinte de carga SDS a los granos y la muestra de entrada almacenada y calentarlas durante 10 minutos a 95 ° C.</li>
		<li>Después de calentar, analizar la muestra utilizando Western Blot27, o almacenar la muestra a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+proteins+to+a+carboxymethyldextran-modified+gold+surface+for+biospecific+interaction+analysis+in+surface+plasmon+resonance+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors.</a> Analytical Biochemistry. 198 (2), 268-277 (1991).</li>
<li>Kurzawa, C., Hengstenberg, A., Schuhmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+method+for+the+preparation+of+biosensors+based+on+pH+shift-induced+deposition+of+biomolecule-containing+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Immobilization method for the preparation of biosensors based on pH shift-induced deposition of biomolecule-containing polymer films.</a> Analytical Chemistry. 74 (2), 355-361 (2002).</li>
<li>You, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+proteins+using+nanoparticle-fluorescent+polymer+%27chemical+nose%27+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of proteins using nanoparticle-fluorescent polymer 'chemical nose' sensors.</a> Nature Nanotechnology. 2 (5), 318-323 (2007).</li>
<li>Roberts, M. W., Ongkudon, C. M., Forde, G. M., Danquah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatility+of+polymethacrylate+monoliths+for+chromatographic+purification+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Versatility of polymethacrylate monoliths for chromatographic purification of biomolecules.</a> Journal of Separation Science. 32 (15-16), 2485-2494 (2009).</li>
<li>Sandison, M. E., Cumming, S. A., Kolch, W., Pitt, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+immunoprecipitation+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip immunoprecipitation for protein purification.</a> Lab on a Chip. 10 (20), 2805-2813 (2010).</li>
<li>Das, A., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Ester+Containing+Polymers%3A+Opportunities+and+Challenges+for+the+Design+of+Functional+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Activated Ester Containing Polymers: Opportunities and Challenges for the Design of Functional Macromolecules.</a> Chemical Reviews. 116 (3), 1434-1495 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pola.26200">Functionalization and patterning of reactive polymer brushes based on surface reversible addition and fragmentation chain transfer polymerization.</a> Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 50 (19), 4010-4018 (2012).</li>
<li>Kessler, D., Jochum, F. D., Choi, J., Char, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+universal+method+toward+light-responsive+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: universal method toward light-responsive surfaces.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (2), 124-128 (2011).</li>
<li>Son, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/pj20166">Penetration and exchange kinetics of primary alkyl amines applied to reactive poly(pentafluorophenyl acrylate) thin films.</a> Polymer Journal. 48 (4), 487-495 (2016).</li>
<li>Kessler, D., Roth, P. J., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+controlled+functionalization+for+specific+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: controlled functionalization for specific protein immobilization.</a> Langmuir. 25 (17), 10068-10076 (2009).</li>
<li>Kessler, D., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+surface+coatings+based+on+polysilsesquioxanes%3A+defined+adjustment+of+surface+wettability%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Reactive surface coatings based on polysilsesquioxanes: defined adjustment of surface wettability.</a> Langmuir. 25 (24), 14200-14206 (2009).</li>
<li>Kessler, D., Nilles, K., Theato, P. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/jm/b913753j">Modular approach towards multi-functional surfaces with adjustable and dual-responsive wettability using a hybrid polymer toolbox.</a> Journal of Materials Chemistry. 19 (43), 8184-8189 (2009).</li>
<li>Eberhardt, M., Mruk, R., Zentel, R., Theato, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014305705000649">Synthesis of pentafluorophenyl(meth)acrylate polymers: new precursor polymers for the synthesis of multifunctional materials.</a> European Polymer Journal. 41 (7), 1569-1575 (2005).</li>
<li>Jochum, F. D., Forst, F. R., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNIPAM+copolymers+containing+light-responsive+chromophores%3A+a+method+toward+molecular+logic+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">PNIPAM copolymers containing light-responsive chromophores: a method toward molecular logic gates.</a> Macromolecular Rapid Communications. 31 (16), 1456-1461 (2010).</li>
<li>Schattling, P., Pollmann, I., Theato, P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1381514813002514">Synthesis of CO2-responsive polymers by post-polymerization modification.</a> Reactive & Functional Polymers. 75, 16-21 (2014).</li>
<li>He, L., Szameit, K., Zhao, H., Hahn, U., Theato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postpolymerization+modification+using+less+cytotoxic+activated+ester+polymers+for+the+synthesis+of+biological+active+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Postpolymerization modification using less cytotoxic activated ester polymers for the synthesis of biological active polymers.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3197-3205 (2014).</li>
<li>Arnold, R. M., McNitt, C. D., Popik, V. V., Locklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+grafting+of+poly%28pentafluorophenyl+acrylate%29+onto+oxides%3A+versatile+substrates+for+reactive+microcapillary+printing+and+self-sorting+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct grafting of poly(pentafluorophenyl acrylate) onto oxides: versatile substrates for reactive microcapillary printing and self-sorting modification.</a> Chemical Communications. 50 (40), 5307-5309 (2014).</li>
<li>Son, H., Ku, J., Kim, Y., Li, S., Char, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine-Reactive+Poly%28pentafluorophenyl+acrylate%29+Brush+Platforms+for+Cleaner+Protein+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Amine-Reactive Poly(pentafluorophenyl acrylate) Brush Platforms for Cleaner Protein Purification.</a> Biomacromolecules. 19 (3), 951-961 (2018).</li>
<li>Cullen, S. E., Schwartz, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+H-2+and+Ia+alloantigens+with+immunoprecipitation+induced+by+protein+A-bearing+staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of H-2 and Ia alloantigens with immunoprecipitation induced by protein A-bearing staphylococci.</a> The Journal of Immunology. 117 (1), 136-142 (1976).</li>
<li>Sisson, T. H., Castor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+immobilizing+IgG+antibodies+on+protein+A-agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for immobilizing IgG antibodies on protein A-agarose.</a> Journal of Immunology Methods. 127 (2), 215-220 (1990).</li>
<li>Peritz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+mRNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of mRNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 1 (2), 577-580 (2006).</li>
<li>Zhang, Z., Chen, S., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-functional+biomimetic+materials%3A+nonfouling+poly+%28carboxybetaine%29+with+active+functional+groups+for+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Dual-functional biomimetic materials: nonfouling poly (carboxybetaine) with active functional groups for protein immobilization.</a> Biomacromolecules. 7 (12), 3311-3315 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHS-ester+functionalized+poly%28PEGMA%29+brushes+on+silicon+surface+for+covalent+protein+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">NHS-ester functionalized poly(PEGMA) brushes on silicon surface for covalent protein immobilization.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 66 (2), 233-239 (2008).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+%283D%29+substrates+for+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li>
<li>Chong, Y., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma020882h">Thiocarbonylthio compounds [SC (Ph) S− R] in free radical polymerization with reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT Polymerization). Role of the free-radical leaving group (R).</a> Macromolecules. 36 (7), 2256-2272 (2003).</li>
<li>Jochum, F. D., Theato, P. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma900945s">Temperature- and Light-Responsive Polyacrylamides Prepared by a Double Polymer Analogous Reaction of Activated Ester Polymers.</a> Macromolecules. 42 (16), 5941-5945 (2009).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Chua, G. B. H., Roth, P. J., Duong, H. T. T., Davis, T. P., Lowe, A. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma202700y">Synthesis and Thermoresponsive Solution Properties of Poly[oligo(ethylene glycol) (meth)acrylamide]s: Biocompatible PEG Analogues.</a> Macromolecules. 45 (3), 1362-1374 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La síntesis de poly(PFPA) injertado SiO2 cuentas se ilustra en la figura 1. Mediante el empleo de APTES como molécula de vinculador, cepillos de poly(PFPA) covalente injertados a SiO2 substrato pueden prepararse mediante un proceso de dos pasos simples. Aunque algunas de las unidades de la PFP son sacrificados por la reacción con APTES, se espera que un gran número de las unidades de la PFP permanecer disponible para la reacción posterior con amino-PEG o anticuerpos. Se...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58843/preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads">Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification</a>.&#160; Throughout the article, the term &#34;3-aminopropyltriethoxysilane&#34; has been replaced with &#34;3-aminopropyltrimethoxysilane&#34;, and &#34;APTES&#34; with &#34;APTMS&#34;.

Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Cepillos poliméricos reactivos han recibido mucho interés en los últimos años. Pueden ser utilizados para inmovilizar moléculas funcionales en materiales orgánicos o inorgánicos para crear superficies activadas con aplicaciones en áreas tales como detección y separación1,2,3,4, 5. Entre los polímeros reactivos registrados, los que contienen unidades de ester pentafluorophenyl son particularmente útiles debido a su alta reactividad con aminas y resistencia hacia la hidrólisis6. Un tal polímero es poly(PFPA), y puede ser fácilmente funcionalizada polimerización posterior con moléculas que contienen aminas primaria o secundaria7,8,9,10. Ejemplo, poly(PFPA) cepillos fueron reaccionados con amino-spiropyrans para crear superficies sensibles a la luz7.
La preparación de poly(PFPA) y sus aplicaciones se han descrito en un número de anteriores publicaciones6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15,16,17. En particular, Theato y colaboradores informaron la síntesis de poly(PFPA) cepillos a través de "injerto a" tanto "injerto de" métodos7,8,10,11,12 . En el "injerto a" enfoque, un poli (methylsilsesquioxane)-polivinílico (acrilato del pentafluorophenyl) (polímero híbrido de poly(MSSQ-PFPA)) fue sintetizado8,10,11,12. El componente de poly(MSSQ) fue capaz de adherencia fuerte forma con un número de diferentes superficies orgánicas e inorgánicas, permitiendo así que el componente poly(PFPA) formar una capa de pincel sobre la superficie del material cubierta. En el "injerto de" enfoque de superficie inició además reversible y polimerización de fragmentación cadena transferencia (SI-balsa) se empleó para preparar poly(PFPA) cepillos7. En este caso, un agente de transferencia de cadena inmovilizada de la superficie (SI-CTA) primero fue unido covalentemente al sustrato por reacción sílice-silano. El inmovilizado SI-CTA participó entonces en la polimerización de la SI-balsa de monómeros de la PFPA, generando poly(PFPA) densamente cepillos con enlace covalente estable al sustrato.
Mediante la utilización de los cepillos de poly(PFPA) sintetizados mediante polimerización SI-balsa, hemos demostrado recientemente la inmovilización de anticuerpos en las partículas de sílice poly(PFPA) injertado y su posterior aplicación en la purificación de la proteína18. El uso de cepillos poly(PFPA) para inmovilización de anticuerpos fue encontrado para resolver una serie de problemas asociados con la actual separación de las proteínas a través de IP. Convencional IP se basa en el uso de la proteína A/G como un enlazador para anticuerpo inmovilización19,20,21. Dado que el uso de la proteína A/G permite a los anticuerpos que se unirán con una orientación específica, se logra eficiencia de recuperación de antígeno blanco alto. Sin embargo, el uso de la proteína A/G sufre de interacción de la proteína no específica, así como la pérdida de anticuerpos durante la recuperación de la proteína, los cuales contribuyen a un alto nivel de ruido de fondo. Para resolver estas deficiencias, reticulación directo de los anticuerpos a un soporte sólido ha sido explorado22,23,24. La eficacia de estas técnicas es generalmente baja debido a la orientación aleatoria de los anticuerpos de reticulado. Para el substrato poly(PFPA) injertado, la inmovilización de anticuerpos es permanente, mediante la reacción de intercambio entre las unidades de la PFP y funcionalidad de Amina en anticuerpos. Aunque la orientación de anticuerpo es todavía aleatoria, el sistema se beneficia de tener muchos sitios PFP reactivos, controlables por el grado de polimerización. Además, demostramos que por sustitución parcial de unidades de la PFP con amino-PEG, hydrophilicity superficial puede ajustarse, mejorar la eficiencia de recuperación de proteína del sistema18. En general, las partículas de sílice poly(PFPA) injertadas mostraron ser una alternativa eficaz a IP tradicional con razonable eficiencia como mucho limpiador de fondo.
En esta contribución, se presenta un método alternativo para preparar superficie injertada poly(PFPA) para inmovilización de anticuerpos y la aplicación de la propiedad intelectual. En un proceso de dos pasos simples, como se ilustra en la figura 1, una molécula de vinculador APTES se deposita primero sobre la superficie de sílice, a continuación, el polímero de poly(PFPA) se une covalentemente a la molécula del vinculador mediante la reacción entre las unidades de la PFP en la polímero y las funciones de la amina en APTES. Este método de preparación permite el entrecruzamiento permanente de poly(PFPA) a una superficie del sustrato, pero evita muchas complicaciones asociadas a CTA SI síntesis y polimerización de la SI-balsa de poly(PFPA) cepillos. Sustitución parcial de las unidades de la PFP con amino-PEG puede aún realizarse, permitiendo ajuste de las propiedades superficiales del cepillo de polímeros. Nos muestran los granos de sílice poly(PFPA) injertado así preparados pueden ser inmovilizados con anticuerpos y utilizados para el enriquecimiento de proteínas vía IP. El procedimiento de una preparación detallada del grano, inmovilización de anticuerpos y pruebas de IP se documentan en este artículo, para los lectores interesados en la búsqueda de una alternativa a la proteína convencional A/G basado en IP.

<table><tbody><tr><td>2,2-Azobisisobutironitrilo, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>1102-4405</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol metílico para HPLC, 99.9%</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>d62</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bromuro de fenilmagnesio 1.0&nbsp; M en THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Disulfuro de carbono anhidro, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335266</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de bencilo, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td></td></tr><tr><td>Éter de petróleo, 90%</td><td>Samchun Chemicals</td><td>P0220</td><td></td></tr><tr><td>Éter etílico, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>4025-4404</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio anhidro, en polvo,&nbsp; 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>5514-4405</td><td></td></tr><tr><td>Acrilato de pentafluorofenilo</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-264001</td><td>contiene inhibidor</td></tr><tr><td>Óxido de aluminio, activado, básico, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Daejung Chemicals</td><td>7548-4400</td><td></td></tr><tr><td>Anísol anhidro, 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>Micropartículas de nanopartículas de sílice</td><td>GmbH</td><td>SiO2-R-0.7</td><td>5% c/v suspensión acuosa</td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetoxisilano, >96.0%</td><td>Industria química de Tokio</td><td>T1255</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido para HPLC, &ge; 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>Éter metílico de poli(etilenglicol) terminado en amino</td><td>Fuente</td><td>de polímero P16082-EGOCH3NH2</td><td></td></tr><tr><td>Tableta salina tamponada con fosfato</td><td>Takara</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Calbiochem</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM9640G</tr><tr><td>NP-40</td><td>VWR</td><td>E109-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Biosesang</td><td>D1037</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa</td><td>Merck</td><td>535140-1MLCN</td><td></td></tr><tr><td>Bromo azul de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 6.8)</td><td>Biosolución</td><td>BT033</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Biosolución</td><td>BS003</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>PKR Tecnología de señalización celular</td> de<td>anticuerpos</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td></td></tr><tr><td>Tecnología de señalización celular</td><td>IgG de conejo normal</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>Banco de líneas celulares de Corea</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WUC-D10H</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonido</td><td>BMBio</td><td>BR2006A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga I</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga II</td><td>LABOGENE</td><td>1736R</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>FINEPCR Horno</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>vacío</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>ThermoStable OV-30</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografía de permeación en gel (THF)</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de fotoelectrones de rayos X</td><td>Thermo VG Scientific</td><td>Sigma Probe</td><td></td></tr><tr><td>Dispersión dinámica de la luz</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN 3690</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados sio2 cuentas para purificación de proteínas

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

Demostrar un método simple para preparar polivinílico (acrilato del pentafluorophenyl) (poly(PFPA)) injertado granos de sílice para la inmovilización de anticuerpos y aplicación posterior de inmunoprecipitación (IP). La superficie injertada poly(PFPA) es preparada mediante un proceso de dos pasos simples. En el primer paso, 3 aminopropyltriethoxysilane (APTES) se deposita como una molécula de vinculador en la superficie de la sílice. En el segundo paso, poly(PFPA) homopolímero, sintetizado mediante la adición reversible y fragmentación cadena transferencia (balsa) la polimerización, se injerta a la molécula del vinculador mediante la reacción de intercambio entre las unidades del pentafluorophenyl (PFP) en el polímero y los grupos de la amina de APTES. La deposición de APTES y poly(PFPA) en el sílice partículas son confirmadas por espectroscopia de fotoelectrones de rayos x (XPS), así como supervisadas por el cambio de tamaño de partícula medido por dispersión dinámica de la luz (DLS). (Amino-PEG) también se realiza para mejorar el hydrophilicity superficial de los granos, sustitución parcial de poly(PFPA) con poly(ethylene glycol) amine functionalized. La poly(PFPA) PEG-sustituido injertado silicona granos luego se inmovilizan con anticuerpos para el uso de IP. Para la demostración, se emplea un anticuerpo contra la proteína quinasa RNA-activado (PKR) y eficiencia IP se determina por borrar occidental. Los resultados del análisis muestran que los granos de anticuerpo inmovilizado de hecho pueden utilizarse para enriquecer PKR mientras que las interacciones entre proteínas no específicas son mínimas.

Un esquema para la preparación de poly(PFPA) había injertado SiO2 granos, con o sin PEG sustitución se muestra en la figura 1. Para controlar las APTES y poly(PFPA) proceso de pelado SiO2 granos, el injerto APTES funcionalizados SiO2 granos y poly(PFPA) injertado SiO2 granos se caracterizan por DLS (figura 2) y XPS (figura 3). Eficiencias IP de las cuentas ...

Un protocolo para la preparación de poli (acrilato del pentafluorophenyl) (granos de sílice poly(PFPA)) injertado se presenta. La superficie de poly(PFPA) funcionalizados es inmovilizada con anticuerpos y utilizada con éxito para la separación de proteínas por inmunoprecipitación.

Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO2 cuentas para purificación de proteínas

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

Este método se puede utilizar para preparar superficies activadas por biomoléculas, que tienen aplicaciones en áreas como la administración de fármacos, la detección biológica de objetivos y la separación biológica. La principal ventaja de esta técnica es que los cepillos poli PFPA son altamente reactivos con aminas, y la inmovilización de anticuerpos se logra mediante la incubación en solución tampón durante unas horas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la purificación de proteínas a través de la inmunopurificación, ya que el anticuerpo inmovilizado puede unirse con éxito con antígenos diana.Aunque este método está demostrado para la movilización de anticuerpos y la purificación de proteínas, también se puede aplicar a otros sistemas que requieren movilización biomolecular. Para tratar las perlas de dióxido de silicio con APTES, primero obtenga partículas de dióxido de silicio en forma de una suspensión acuosa de volumen de 5% de peso. Combine 0,8 mililitros de suspensión de dióxido de silicio con 40 miligramos de APTES, y ocho mililitros de metanol en un vial de centelleo de 20 mililitros equipado con una barra de agitación.Deje que la reacción continúe a tempe

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

En este video, se utilizan sondas de fuerza de biomembrana (BFP) para medir las fuerzas entre receptores y ligandos. Esta técnica puede detectar interacciones mediante el monitoreo de la presión necesaria para romper los enlaces entre el pMHC conjugado en las perlas de la sonda y los TCR en las celdas objetivo.

Sonda de fuerza de biomembrana para cuantificar las interacciones receptor-ligando

Amidas terciarias péptido (PTA) son una superfamilia de peptidomiméticos que incluyen pero no se limitan a péptidos, peptoides y péptidos N-metilado. Aquí se describe un método de síntesis que combina estrategias de sub-monómero división y piscina y para sintetizar un solo grano de la biblioteca de un compuesto de las PTA.

Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Describimos una técnica para medir simultáneamente la cinética de unión a un solo receptor regulado por fuerza e imágenes en tiempo real de la señalización de calcio en un solo linfocito T.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Proponemos una técnica simple de autoensamblaje de nanopartículas coloidales de sílice para crear una unión nanofluídica entre dos microcanales en polidimetilsiloxano (PDMS). Usando esta técnica, se construyó una membrana de perlas nanoporosas con un tamaño de poro de hasta ~ 45 nm dentro de un microcanal y se aplicó a la preconcentración electrocinética de muestras de ADN.

Creación de Sub-50 Nm nanofluídico uniones en PDMS microfluidos de chips VIA proceso de autoensamblaje de partículas coloidales

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Aquí, presentamos un protocolo para sintetizar materiales de sílice Bioinspirados e inmovilizar enzimas en esto. Sílice se sintetiza mediante la combinación de silicato de sodio y una amina 'aditiva', que neutralizan a una velocidad controlada. Función y propiedades del material pueden modificarse por inmovilización de enzimas en situ o sintético posterior elución ácida de aditivos encapsulados.

Preparación de sílice funcional utilizando un método Bioinspirados

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) es un método altamente sensible, confiable y fácil de realizar para detectar la modificación reversible de los residuos de cisteína (S-acylation) en una variedad de muestras biológicas.

Detección de proteína S-Acylation utilizando la captura asistida de acilo-resina

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la captura e identificación de interacciones proteína-proteína específicas de la enfermedad de células y tejidos nativos utilizando sondas químicas y espectrometría de masas. Los conjuntos de datos de interacción resultantes se analizan a través de una plataforma web dedicada para revelar disfunciones dinámicas de la red y alteraciones de la vía relacionadas con la enfermedad.

Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Aprende a preparar perlas de sílice funcionalizadas con poli(pentafluorofenil acrilato) para purificación de proteínas mediante inmunoprecipitación. Este método permite inmovilizar anticuerpos eficazmente y mejorar la separación de proteínas objetivo.

Preparación de Poly(pentafluorophenyl acrylate) funcionalizados SiO₂ cuentas para purificación de proteínas

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