Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación
8 de diciembre de 2018
Este protocolo pretende demostrar cómo combinar arreglos de microelectrodos en vitro con dispositivos microfluídicos para estudiar la transmisión del potencial de acción en cultivos neuronales. Análisis de los datos, es decir, la detección y caracterización de propagar potenciales de acción, es realizada con un nuevo avanzado, pero fácil de usar y libremente disponible, herramienta computacional.
El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo combinar el uso de micro fluidos con matrices de micro electrodes para generar la plataforma adecuada para el estudio de la comunicación neuronal y la propagación de la señal axonal. Hola, soy Paulo Aguiar y soy el PI del Laboratorio de Neuro ingeniería y Neurociencia Computacional del INEB, acostumbrado a codificar para ingeniería biomédica en la Universidad de Oporto, Portugal. Comprender la transmisión de información en los circuitos neurológicos sigue siendo uno de los mayores desafíos en neurociencia.
Hoy, voy a mostrarles cómo podemos combinar matrices de microaccionados individuales con micro fluidos y herramientas de software desarrolladas aquí en nuestro laboratorio, para detectar y caracterizar potenciales de acción de propagación. Utilizamos esta configuración en una variedad de estudios, a saber, la codificación neuronal y la decodificación, y en las comunicaciones entre las neuronas sensoriales y otros tipos de células. Creemos que la demostración visual de este protocolo es crucial.
Dado que el conjunto de matrices de micro fluidos y micro electrodes es esa dificultad en la gestión, y difícil de reproducir con solo reproducir protocolos. Para el mercado, las ventas de culto en esta plataforma no son sencillas, como las AFA convencionales, y requiere una atención especial a las celdas sentadas, e imanes de cultivo. Esta configuración nos permite estudiar varias propiedades relacionadas con la comunicación, como la velocidad de propagación y la dirección, en un entorno bien controlado.
Aunque el procedimiento de grabación es simple, el análisis de datos requiere conocimiento y el uso de las herramientas computacionales adecuadas. El día antes de la sesión de la célula, comience preparando los dispositivos micro fluidos, limpiando con cinta adhesiva. Presione suavemente la cinta contra el dispositivo para llegar a todas las áreas del micro fluido.
El plasma de aire limpia el MEA durante tres minutos para limpiar la superficie y hacerla más hidrófila. Dentro de una campana de flujo laminar, sumerja los micro fluidos en un 70 por ciento de etanol. Deje que se sequen al aire.
Coloque cada MEA en un plato de petri y esterilice 15 minutos de exposición a la luz UV. A continuación, vaya a la zona central de MEA con 500 microlitros de solución PEI. Incubar durante al menos una hora.
Dentro de una campana de flujo laminar, aspirar la solución de recubrimiento PEI de la superficie MEA. A continuación, lave los MEA cuatro veces con un mililitro de agua estéril. Con la ayuda de un microscopio estéril, colocado dentro de la campana de flujo laminar.
Centrar el chip MEA, y añadir un mililitro de agua estéril a la zona central del MEA. A continuación, coloque el dispositivo micro fluido en la parte superior de la superficie MEA y alinee cuidadosamente la microgrooves micro cuadrícula activa del MEA. Aspirar el exceso de agua, e incubar durante la noche a 37 grados, para permitir un apego completo.
Al día siguiente, cargue los pozos con laminin e incubar de nuevo. Después de recoger los susseds embrionarios, proceder a la disección de corteza prefrontal. Comienza exponiendo cuidadosamente el cerebro, usando un par de fórceps.
Luego, retira suavemente el cerebro de su cavidad. Cúbralo con H-HBSS frío. Cuando esté presente, retire y deseche las bombillas olfativas.
Finalmente, disecciona la corteza prefrontal. Asegurar la eliminación completa de los meninges. Repita este procedimiento para ambos hemisferios.
Para el número de cerebros necesarios para su estudio. Dentro de una campana de flujo laminar, recoger los fragmentos de corteza previamente diseccionados en un total de cinco mililitros de H-HBSS. Luego, transfiera estos fragmentos a un tubo crónico estéril de 15 mililitros.
Pipetear y tener 2,3 mililitros de solución de trippsina recién preparada en el tubo que contiene los fragmentos de corteza. Mezclar la suspensión e incubar a 37 grados durante 15 minutos. Agitar cada cinco minutos.
A continuación, deseche el sobrenadante que contiene la tripina, agregue H-HBSS que contenga FBS, para desactivar la tripina restante. Agitar suavemente. Deja que los fragmentos de la corteza se asienten y deseche el sobrenadante.
Lavar dos veces con H-HBSS, para quitar el FBS, y desechar el sobrenadante de nuevo. Añadir medio basal neural suplementado, y disociar mecánicamente los tejidos por pipetear lentamente arriba y abajo. Deseche el tejido restante filtrando la suspensión de sal a través de un colador celular.
A continuación, mezclar 20 microlitros de suspensión celular con 20 microlitros de color azul tripano. Transfiera 10 microlitros a una cámara Neubauer y cuente el número de células viables. Inmediatamente antes de estar sentado en la celda, retire la laminin de todos los pozos del micro EF. A continuación, añada el pequeño volumen de medio sobrenadante a cada pozo del compartimiento axonal.
Sembra lentamente cinco microlitros de suspensión celular al compartimento somal. Incubar a 37 grados durante una hora para permitir la fijación celular al sustrato. Después de una hora, llene suavemente cada pozo con un medio caliente suplementado.
Agregue volúmenes pequeños para evitar el desprendimiento de celdas. A continuación, transfiera el micro EF a una incubadora. Aquí se muestra una cultura a los cinco días in vitro.
Después de una semana, los cultivos comienzan a exhibir actividad espontánea. Antes de realizar grabaciones, utilice un controlador de temperatura para comer la placa base de fuego del prea amplificado. A continuación, coloque el micro EF en el preamplificador y cierre y cierre la tapa.
Para grabar, abra el software experimental multicanal. Establezca la frecuencia de muestreo en 20 kilohercios. Arrastre los cuadros de filtro y grabados y conéctelos secuencialmente para registrar datos sin procesar y filtrados.
Inicie la adquisición de datos para visualizar las señales y el registro rápido. Los datos grabados se pueden explorar rápidamente mediante el analizador multicanal. Aquí, la propagación de la señal a lo largo de los microgrooves ya está clara.
Para identificar y caracterizar estos eventos de propagación, abra la grabación en el micro cazador de picos. Haga clic en el botón de información del archivo para acceder a la configuración de grabación y seleccione el conjunto de microdóditos para el análisis. Establezca el umbral para propagar la detección de eventos.
Y leer los datos rápidos. El software enumerará todas las secuencias detectadas. A continuación, el usuario puede evaluar la velocidad de propagación como la información, entre pares de micro electrodos, y en función de su entre distancia y correlación cruzada.
La herramienta de gráficos químicos permite al usuario estimar manualmente la velocidad de propagación. Aquí se muestra un evento de propagación. Detectado a lo largo de cuatro micro electrodos dentro de un microgroove.
Estos eventos se pueden representar en una gráfica de Rasser. Aquí está la actividad de propagación a lo largo de 11 microgrooves durante los primeros dos minutos de grabación. El microgroove alto y bajo de actividad son de color amarillo y rojo, respetuosamente.
Observe la sincronización de la actividad a lo largo de los 11 microgrooves. La sincronización es independiente de la velocidad de actividad. Como se puede ver en las variaciones de la velocidad de disparo instantánea de las dos microgrooves.
Las microgrooves también funcionan como amplificadores de señal axonal, como se muestra en la caja y la gráfica de bigotes. Le hemos mostrado cómo combinar micro fluidos con LOS MEA, y cómo cultivar neuronas en ellos. Además, cómo grabar y extraer datos significativos de esas grabaciones.
Esperamos que esta demostración sea útil para su investigación, por qué puede querer estudiar la comunicación en circuitos neuronales.
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Resumen
Este protocolo demuestra la integración de matrices de microelectrodos con dispositivos microfluídicos para estudiar la transmisión del potencial de acción en cultivos neuronales. Destaca la importancia de la demostración visual y del uso de una herramienta computacional fácil de usar para el análisis de datos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neuroingeniería
- Electrofisiología
Antecedentes
- Comprender la transmisión de información en circuitos neuronales es un desafío importante en neurociencia.
- Las matrices de microelectrodos permiten la grabación de la actividad eléctrica de neuronas.
- Los dispositivos microfluídicos posibilitan un control preciso del entorno celular.
- La combinación de estas tecnologías puede mejorar el estudio de la comunicación neuronal.
Objetivo del estudio
- Crear una plataforma para estudiar la comunicación neuronal y la propagación de señales axónicas.
- Detectar y caracterizar potenciales de acción propagados en cultivos neuronales.
- Facilitar la investigación en codificación y decodificación neural.
Métodos Utilizados
- Integración de matrices de microelectrodos con dispositivos microfluídicos.
- Uso de herramientas de software desarrolladas para el análisis de datos.
- Visualización del protocolo para mayor claridad.
- Aplicación en diversos estudios que involucran neuronas sensoriales.
Resultados principales
- Detección y caracterización exitosas de potenciales de acción.
- Mejor comprensión de los mecanismos de comunicación neuronal.
- Demuestra la eficacia del protocolo en aplicaciones de investigación.
- Desarrollo de una herramienta computacional fácil de usar para el análisis de datos.
Conclusiones
- El uso combinado de matrices de microelectrodos y microfluídica es efectivo para estudiar la actividad neuronal.
- Este enfoque puede avanzar la investigación en neurociencia e ingeniería neural.
- Los protocolos visuales son esenciales para la reproducibilidad y la comprensión.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma microfluídica-MEA aborda un desafío clave en el descubrimiento de fármacos en neurociencia: aislar la propagación del señal axonal del ruido somático en cultivos neuronales. Al permitir grabaciones de alta resolución y a largo plazo de la propagación de potenciales de acción con una relación señal-ruido mejorada, el método apoya la desactivación mecanicista de dianas implicadas en neurodesarrollo, neurodegeneración y neuroregeneración. Proporciona una confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al cuantificar fenotipos relacionados con la comunicación, como la velocidad de conducción y los patrones de descarga.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de la señalización axonal para aclarar la comunicación específica por vías en los circuitos neuronales.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la validación funcional de dianas que modulan la velocidad de propagación del potencial de acción y el fallo de conducción.
- Valor predictivo: Cuantifica la transmisión anterógrada del impulso nervioso y los mecanismos de codificación para orientar la selección de carteras según la interacción funcional con la diana.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara cultivos neuronales validados y compartimentalizados para la evaluación posterior de compuestos, con alineación controlada de axones y acoplamiento a microelectrodos.
- Resultados cuantitativos: Proporciona mediciones reproducibles y de alta resolución de la velocidad de propagación, la falla de conducción y la frecuencia de disparo, para un cribado fiable de compuestos.
- Escalabilidad y reutilización: Permite la estandarización de la plataforma en estudios de comunicación entre neuronas sensoriales y configuraciones de cultivos mixtos, facilitando la transferibilidad del ensayo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela procesos neurodesarrolladores y neurodegenerativos mediante el seguimiento de la propagación de señales axónicas durante semanas in vitro.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al cuantificar fenotipos de comunicación relacionados con la disfunción y la reparación de circuitos.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar mediante métricas objetivas del potencial neuroregenerativo y de la fidelidad en el codificado de la información.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre el blanco hasta la identificación de compuestos prometedores, proporcionando lecturas funcionales que conectan el cribado fenotípico con la validación mecanicista en sistemas neuronales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante el aislamiento de las contribuciones axonales a la actividad de la red en microentornos controlados.
- Selección: Proporciona cultivos neuronales reproducibles y listos para ensayos, con lecturas electrofisiológicas estandarizadas para la evaluación del efecto de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación cuantitativa de condiciones mediante métricas de velocidad de propagación, falla de conducción y frecuencia de disparo derivadas del análisis de trenes de potenciales de acción.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante la modelización de la dinámica de comunicación axonal relevante para la neurodegeneración y la neuroregeneración.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el estudio de la comunicación entre neuronas sensoriales y sistemas de co-cultivo en múltiples áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en la propagación de señales neuronales.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante un diseño de cultivo compartimentalizado y una estabilidad a largo plazo.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en objetivos implicados en patologías basadas en circuitos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo mediante fenotipos cuantificables de comunicación axonal vinculados a mecanismos de enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de dispositivos microfluídicos, cultivo de neuronas y registro electrofisiológico.
- Depende del acceso a matrices de microelectrodos, limpiadores de plasma, cabinas de flujo laminar y sistemas de registro con control de temperatura.
- Necesita estandarización entre equipos para lograr alineación consistente de dispositivos, siembra celular y protocolos de cambio de medio.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a diferentes tipos neuronales o configuraciones de cultivo conjunto más allá de los cultivos derivados de la corteza prefrontal.
- Las limitaciones prácticas incluyen la complejidad técnica del ensamblaje de dispositivos microfluídicos con matrices de microelectrodos y la necesidad de herramientas computacionales especializadas para el análisis de la propagación de potenciales de acción.
