Name: Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprende a integrar microelectrodos con microfluídica para estudiar la comunicación neuronal y la propagación de señales axonales. Este método permite detectar potenciales de acción propagados en cultivos neuronales.

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Este trabajo fue financiado por el FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional fondos hasta el 2020 compiten - Operacional programa de competitividad e internacionalización (POCI), 2020 de Portugal y por portugueses fondos a través de la FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior en el marco del proyecto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus fue apoyada por la FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar fue apoyado por el Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - promoción del empleo científico, FSE y MCTES y programa Investigador FCT, POPH Fundo Social Europeu. Los dispositivos microfluídicos fueron fabricados en INESC - microsistemas y nanotecnologías, Portugal, bajo la supervisión de João Pedro Conde y Virginia Chu.

Todos los procedimientos que involucran animales fueron realizados según la Unión Europea (UE) Directiva 2010/63/CE (transpuesta a la legislación portuguesa por Decreto-ley 113/2013). El protocolo experimental (0421/000/000/2017) fue aprobado por el Comité de ética de ambos la autoridad oficial del portugués en el bienestar de los animales y la experimentación (Direção Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) y de la institución de acogida.
1. preparación de medios de cultivo y otras soluciones
Nota: Recién preparar las soluciones de recubrimiento en el día de su uso. La capa sin usar soluciones y medios de cultivo pueden ser almacenadas a-20 ° C o 4 ° C como se detalla a continuación.
<ol><li>Preparar 10 mL de un 0,05% (v/v) solución de trabajo de Poly(ethylene imine) (PEI).<ol>
<li>Preparar 20 mL de solución madre de PEI de 0.25% (p/v) disolviendo PEI purificado (véase Tabla de materiales) en agua estéril.</li>
		<li>Diluir 2 mL de solución madre de PEI de 0.25% (p/v) en 8 mL de agua destilada estéril. Mezclar bien y utilizar. Solución puede ser almacenado a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1 mL de una solución de laminina 5 μg/mL.<ol>
<li>Diluir 5 μl de la solución madre de 1 mg/mL laminina en 995 μl de medio basal (véase Tabla de materiales). Mezclar bien y utilizar. Solución no utilizada puede guardarse congelada a-20 ° C durante 1-2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1 L de solución salina equilibrada de Hank tamponado con HEPES (H-HBSS).<ol>
<li>Preparar solución HEPES de 1 M disolviendo 11,9 g de polvo HEPES en 50 mL de agua ultrapura. Ajustar el pH a 7.2.</li>
		<li>Preparar la solución de H-HBSS (sin calcio y magnesio) disolviendo 5,33 mM cloruro de potasio, 0,44 mM potasio fosfato monobásico, cloruro de sodio de 138 mM, 0,3 mM fosfato de sodio dibásico y 5,6 mM de glucosa en 800 mL de agua ultrapura.</li>
		<li>Añadir 15 mL de solución HEPES de 1 M (concentración final de 15 mM).</li>
		<li>Ajustar pH a 0.2-0.3 unidades por debajo de la deseada pH 7,4 con 1 N HCl o NaOH N 1. Añadir agua ultrapura para compensar el volumen de solución final. Nota pH tiende a aumentar durante la filtración.</li>
		<li>Esterilice por filtración utilizando una membrana de poly(ether sulfone) (PES) 0.22 μm porosidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 10 mL de H-HBSS conteniendo 10% inactivado con calor suero bovino Fetal (hiFBS).<ol>
<li>Diluir 1 mL de hiFBS en 9 mL de H-HBSS. Mezclar bien y utilizar. Solución no utilizado puede almacenarse a 4 ° C durante 3-4 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 5 mL de 1,5 mg/mL solución de tripsina.<ol>
<li>Inmediatamente antes del uso, disolver 7,5 mg de tripsina en 5 mL de H-HBSS. Esterilice por filtración utilizando una membrana de 0,22 μm porosidad PES.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 50 mL de medio suplementado.<ol>
<li>En un tubo cónico de 50 mL, mezclar 48,5 mL de medio basal (véase Tabla de materiales), 2% (v/v) suplemento B-27, 0,5 mM L-glutamina y 1% pluma/Strep (10.000 U/mL de penicilina y estreptomicina 10.000 de μg/mL). Medio suplementado puede almacenarse a 4 ° C durante 3-4 semanas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. microfluídicos y MEA preparación de dispositivos
Nota: Realice los pasos 2.1-2.11 el día antes de sembrar células.
<ol><li>Limpie los dispositivos microfluídicos para eliminar la fabricación y otros desechos con cinta de vinilo. Presione suavemente la cinta contra el dispositivo para llegar a todas las áreas del dispositivo.</li>
	<li>Aire limpio de plasma el MEA durante 3 minutos (0,3 mbar) para limpiar la superficie y hacer más hidrofílico.</li>
	<li>Brevemente sumerja los dispositivos microfluídicos en etanol al 70% y deje secar al aire dentro de una campana de flujo laminar.</li>
	<li>Coloque cada MEA en un plato de Petri estériles de 90 mm y esterilizar por 15 min de exposición a luz ultravioleta (UV).</li>
	<li>Cubrir la superficie central de MEA por incubación con 500 μl de solución al 0,05% (v/v) PEI durante al menos 1 h a 37 ° C. Nota: Según lo descrito por otros17, capa de PEI de AMMA da como resultado menos clustering que poly(lysine) la capa de la célula.</li>
	<li>Aspirar la solución de recubrimiento del PEI de la superficie del MEA y lavar los MEAs 4 x con 1 mL de estéril agua destilada. Tenga cuidado de no tocar la superficie MEA durante pasos de lavado ya que esto puede dañar los electrodos.</li>
	<li>Guiados por un estereomicroscopio dentro de una campana de flujo laminar, centro de la viruta MEA y añadir 1 mL de agua estéril a la zona central de MEA.</li>
	<li>Coloque el dispositivo de microfluidos encima de la superficie MEA.</li>
	<li>Cuidadosamente Alinee las micro-ranuras de dispositivo de microfluidos con la red de microelectrodos de la MEA.</li>
	<li>Cuando alineados, Aspire cuidadosamente el exceso de agua sin tocar el MEA o el dispositivo de microfluidos.</li>
	<li>Incubar el µEFs durante la noche a 37 ° C en seco y accesorio completo. Para facilitar el accesorio, oprima suavemente el dispositivo microfluídico contra el MEA. Nota: Realice paso 2.12 en el día de siembra de la célula.</li>
	<li>Una vez que el µEFs se han secado completamente, los pozos de microfluidos con 150 μL de solución de recubrimiento de laminina de 5 μg/mL de carga e incubar a 37 ° C durante al menos 2 h antes de sembrar células. Nota: Al cargar el µEF con solución de laminina, asegúrese de que la solución llena las micro-ranuras. Use una aspiradora para quitar cualquier burbuja de aire que puede estar presente dentro de las micro-ranuras.</li>
</ol>3. prefrontal corteza disección
<ol><li>Prepare la zona de disección para la eliminación de embriones.<ol>
<li>Desinfectar la superficie de trabajo y los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70%. Nota: Aunque esta disección no es un procedimiento estéril, desinfección ayuda a reducir las posibilidades de contaminación.</li>
		<li>Use un pañal desechable limpio para limitar el área de disección y diseñar los instrumentos quirúrgicos para la eliminación de embriones.</li>
		<li>Preparar 4 platos de Petri de 90 mm con frío H-HBSS y colocarlos en una bandeja con hielo cerca de la zona de disección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanasia a una rata de Wistar tiempo embarazada E-18 por inhalación de dióxido de carbono (CO2).</li>
	<li>Al finalizar el procedimiento, retirar el animal de la cámara de CO2 y confirmar la muerte por un método secundario de la eutanasia, como exsanguination.</li>
	<li>Coloque el lado ventral del animal arriba sobre el pañal desechable, rocíe la parte inferior del abdomen con etanol al 70% y, con la ayuda de pinzas y tijeras, hacer una forma de U corte a través de la piel para exponer el útero.</li>
	<li>Cuidadosamente retire los embriones del útero cortando los tejidos conectivos y colocarlos en uno de los platos de Petri con frío H-HBSS.</li>
	<li>Quite su saco embrionario de cada embrión y, con la ayuda de pinzas y tijeras, decapitar el embrión.</li>
	<li>Transferencia de la cabeza de embryo´s a un segundo plato de Petri con frío H-HBSS.</li>
	<li>Repita los pasos 3.6-3.7 de cada embrión.</li>
	<li>Diseccionar la corteza prefrontal.<ol>
<li>Transferencia de una cabeza de embryo´s a un tercer plato de Petri.</li>
		<li>Utilizar un par de pinzas para exponer el cerebro.</li>
		<li>Quitar el cerebro de su cavidad y cubrirla con frío H-HBSS.</li>
		<li>Si está presente, retire y deseche los bulbos olfativos. Diseccionar la corteza prefrontal y quitar meninges.</li>
		<li>Transferencia de los fragmentos de la corteza prefrontal a una cuarta placa Petri con frío H-HBSS.</li>
		<li>Repita los pasos 3.9.1 - 3.9.5 para cada embrión.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cortical neuronas disociación y cultura en µEF
Nota: Los siguientes procedimientos se realizaron en campana de flujo laminar después de 15 minutos del ciclo de esterilización ultravioleta. Superficie así como todos los materiales colocados dentro de la campana debe ser previamente desinfectado con etanol al 70%.
<ol><li>Como se describe en el paso 1.5, disolver la tripsina previamente ponderado en 5 mL de H-HBSS y filtrar la solución.</li>
	<li>Recoger los pedazos de corteza previamente disecados en un total de 5 mL de H-HBSS. Transferirlos a un tubo cónico de 15 mL estéril.</li>
	<li>Añadir 2,3 mL de solución de tripsina recién preparado 1,5 mg/mL al tubo que contiene los fragmentos de la corteza.</li>
	<li>Mezclar la suspensión e incubar a 37 ° C durante 15 min (agite brevemente cada 5 min).</li>
	<li>Detener la digestión de tejido y lavar tripsina.<ol>
<li>Deseche el sobrenadante que contiene la tripsina. Añadir 5 mL de H-HBSS conteniendo 10% hiFBS para inactivar la tripsina restantes; Frote suavemente.</li>
		<li>Dejar fragmentos de corteza asentarse y entonces descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 5 mL de H-HBSS para quitar los residuos de hiFBS. Dejar fragmentos de corteza colocar abajo y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Lavar nuevamente los fragmentos de corteza con 5 mL de H-HBSS.</li>
		<li>Dejar fragmentos de corteza colocar abajo y descarte el sobrenadante. Añadir 5 mL de medio suplementado de neuronal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disocian mecánicamente fragmentos de corteza con una pipeta serológica de 5 mL transfiriendo lentamente arriba y abajo por 10 - 15 veces. Si es necesario, repita el procedimiento utilizando una pipeta de calibre pequeño hasta que la suspensión celular homogénea.</li>
	<li>Deseche los restantes tejidos undissociated filtrando el un colador de célula 40 μm a través de suspensión celular.</li>
	<li>Contar las células viables y determinar la densidad celular.<ol>
<li>En un microtubo, añadir 20 μl del 0,4% (p/v) azul de tripano a una suspensión 20 μl. Mezclar bien al homogeneizado de la solución y 10 μl de transferencia a una cuenta cámara de Neubauer.</li>
		<li>Contar las células viables y determinar la densidad celular de células viables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajustar la densidad celular a 3.6 x 107 células/mL (si es necesario, Centrifugue la suspensión de la célula).</li>
	<li>Inmediatamente antes de la siembra de la célula, retire el recubrimiento de laminina de todos los pozos de la µEF. Pipetee 50 μl de medio suplementado a cada pozo del compartimiento axonal µEF.</li>
	<li>5 μl de suspensión de células en el compartimiento de somal de µEF de la semilla. Incubar a 37 ° C durante 1 h, para permitir la fijación de las células al sustrato.</li>
	<li>Cuidadosamente Llene cada uno bien de µEF con medio suplementado precalentado. Transferencia de la µEF a una incubadora a 37 ° C suministrado con 5% CO2de humidificador. Nota: Para evitar la evaporación rápida de medio de cultivo, colocar un microtubo abierto llenado de agua dentro de la caja Petri con el µEF.</li>
	<li>Mantener las culturas durante el periodo necesario sustituir 50% de medio de cultivo cada segundo a tercer día de la cultura. Nota: Después de los experimentos, la microfluídica puede separarse MEAs sumergiendo el µEF en el agua durante la noche. Si es necesario, pele suavemente la microfluídica con la ayuda de fórceps. AMUMA pueden limpiarse por la incubación durante la noche con un detergente enzimático comercial 1% (v/v) (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>5. registrar la actividad Neuronal espontánea
Nota: Las culturas embrionarias neurona cortical en MEAs típicamente exhiben actividad espontánea como 7 días de in vitro (DIV), pero 2-3 semanas (14-21 DIV) para madurar y exhiben estable actividad. Es el experimentador para decidir cuándo iniciar las mediciones electrofisiológicas basadas en los objetivos del estudio. En el presente Protocolo, el registro de la actividad neuronal de µEF se demuestra mediante un sistema de grabación comercial (véase Tabla de materiales para detalles de hardware), con un módulo de calefacción incorporado. Para realizar grabaciones, se utilizó un software disponible gratuitamente (véase Tabla de materiales para detalles de software).
<ol><li>Encienda el MEA registro de sistema y el controlador de temperatura y permita que la placa base heated del preamplificador para llegar a 37 ° C. Nota: para grabaciones de larga duración (> 30 min al mismo tiempo) uno también debe tener un sistema que mantiene una atmósfera de CO2 .</li>
	<li>Lugar la µEF del preamplificador (headstage). Nota: Asegúrese de que el chip MEA está correctamente alineado con el número de referencia en la izquierda el borde superior. El chip MEA que utilizamos es rotationally simétrico, pero esta alineación coincide con la orientación correcta de la esquema de los terminales de los electrodos y el hardware ID.</li>
	<li>Cierre y cierre la tapa del preamplificador.</li>
	<li>Para grabar, abrir el software de grabación y definir los parámetros de grabación y la trayectoria de las corrientes de datos registrados (véase el manual del software para obtener más información sobre cómo configurar un esquema de grabación). Nota: Una adquisición con una frecuencia de muestreo de 20 kHz es generalmente suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Una mayor frecuencia de muestreo es recomendable si se requiere más precisión en horarios pico. Si uno se propone sólo picos récords, establecer un filtro de paso alto a 300 Hz, que atenuará los componentes de frecuencia más baja de la señal. Si cruda y filtrada se registren simultáneamente, esto incrementará significativamente el tamaño del archivo de datos. Siempre es posible hacerlo fuera de línea de filtración de los datos en bruto. Para reducir los datos tamaño del archivo uno puede limitar microelectrodos que grabar (por ejemplo, sólo microelectrodos en micro-ranuras).</li>
	<li>Haga clic en Iniciar DAQ para iniciar la adquisición de datos. Compruebe si la pantalla muestra corrientes rastros de actividad y comienzo de grabación. Nota: El nivel de ruido suele ser ligeramente superior en los microelectrodos correspondiente a las micro-ranuras. Si el nivel de ruido es demasiado alto (amplitud de pico a pico > 50 μV) o inestable en varios microelectrodos, podría ser debido a suciedad, lo que dificulta un buen contacto de pin-pad. Este problema generalmente se resuelve limpiando con suavidad las almohadillas de contacto de MEA y los pernos de preamplificador utilizando un hisopo de algodón humedecido con etanol al 70%.</li>
	<li>Abrir el archivo grabado en el software de análisis (véase Tabla de materiales) para explorar rápidamente los datos.</li>
</ol>6. Análisis de datos
Nota: Los pasos siguientes muestran cómo utilizar el software de µSpikeHunter, una herramienta computacional desarrollado en el laboratorio de Aguiar (gratuitamente previa solicitud por correo electrónico a pauloaguiar@ineb.up.pt), para analizar los datos registrados con µEF. Una interfaz gráfica de usuario (figura 2) se utiliza para cargar los datos, identificar la propagación de las ondas de espiga, determinar su dirección (anterógrada o retrógrada) y estimar las velocidades de propagación. µSpikeHunter es compatible con archivos HDF5 generados a partir de grabaciones obtenidas mediante sistemas de MEA2100-familia, que pueden ser utilizados en conjunto con 60, 120 y 256 electrodos MEAs. Las grabaciones obtenidas usando el experimentador multicanal se pueden convertir fácilmente archivos HDF5 utilizando el software de libre disposición (véase Tabla de materiales).
<ol><li>Haga clic en examinar para seleccionar el archivo de grabación. Luego, haga clic en el botón de información de archivo para el muestreo, la duración de la grabación, así como una lista de las secuencias de datos registrados (por ejemplo, datos en bruto, datos filtrados). Nota: Para las estimaciones de velocidad real de propagación, es aconsejable seleccionar la secuencia de datos para análisis.</li>
	<li>Seleccione microelectrodos (una sola fila o columna asociada con microsurco) para el análisis y establecer el valor de umbral de detección de pico (fase positiva o negativa) en 6 veces la desviación estándar (SD) de la señal de ruido. Haga clic en Leer datos para aplicar el detector de eventos y obtener las secuencias identificados propagación. Nota: Si se cumplen los criterios, una lista de secuencias de propagación detectado poblarán el panel de análisis. El usuario puede entonces ver e interactuar con varias herramientas de análisis de la secuencia de propagación, incluyendo rastros de tensión, Cruz del microelectrodo inter-correlaciones, velocidades de propagación de la solo-secuencia, un kymograph y una herramienta de reproducción de audio. Aunque la estimación de la velocidad de propagación se puede obtener para cualquier par de microelectrodos o como el promedio de las estimaciones para todos los pares, esta estimación es más fiable si se selecciona la pareja alejada.</li>
	<li>Repita el paso anterior para los conjuntos de microelectrodo de interés. Cada vez que haga clic en Guardar todos los eventos para ahorrar el tiempo y la amplitud de los picos (en cada uno de los microelectrodos) para propagación identificadas todas las secuencias a un archivo CSV.</li>
	<li>Importar los archivos CSV a entornos de análisis de datos para su posterior análisis de los patrones de actividad de la cultura (p. ej., disparo ritmo, intervalos entre spike).</li>
</ol>

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<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+surface+wettability+of+poly%28dimethyl%29+siloxane+%28PDMS%29+and+glass+under+oxygen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microelectromechanical+Systems%22%5BJournal%5D)">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Heiney, K., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeiney%2C+K+%22%CE%BCSpikeHunter%3A+An+advanced+computational+tool+for+the+analysis+of+neuronal+communication+and+action+potential+propagation+in+microfluidic+platforms%22">μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms</a>. , (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo que presentamos muestra cómo montar un µEF, compuesto por un dispositivo de microfluidos y una MEA con diseños estándar disponibles comercialmente y cómo analizar los datos registrados.
Al diseñar un experimento, los investigadores deben tener en cuenta que el modelo de vitro está limitado por la rejilla fija de MEA, que restringe el microsurco arreglos. El uso de un particular microfluidos o MEA diseño dependerá de las necesidades experimentales pero, en general, los mis...

Entender la comunicación eléctrica en circuitos neuronales es un paso fundamental para revelar la función normal y diseñar estrategias terapéuticas para tratar la disfunción. Las neuronas integran, computan y transmitir potenciales de acción (APs) que se propagan a lo largo de sus axones delgados. Tradicionales técnicas electrofisiológicas (p. ej., abrazadera del remiendo) son técnicas poderosas para el estudio de la actividad neuronal, pero a menudo se limitan a las estructuras celulares más grandes, como el soma o las dendritas. Técnicas de imagen ofrecen una alternativa para estudiar señales axonales con alta resolución espacial, pero son técnicamente difíciles de realizar y no permita que las medidas a largo plazo1. En este contexto, la combinación de arreglos de microelectrodos (AMUMA) y microfluídica puede hacer una contribución de gran alcance en divulgar las propiedades fundamentales de transmisión de señal y actividad neuron´s dentro de las redes neuronales in vitro2 , 3.
Tecnología MEA se basa en grabaciones extracelulares de cultivos neuronales. Las principales ventajas de esta metodología electrofisiológica son su capacidad para apoyar la estimulación a largo plazo, simultánea y grabación en múltiples sitios y en una forma no invasiva3. Medidas se hacen de biocompatibles, de altas microelectrodos conductivos y resistente a la corrosión encajados un sustrato de oblea de vidrio. Son compatibles con celulares convencionales cultura bio-recubrimientos, que mediante la promoción de adhesión celular significativamente aumentar la resistencia de sellado entre el sustrato y células3,4. Además, son versátiles en el diseño y pueden variar en densidad, geometría y tamaño de microelectrodos. En general, MEAs trabajan como recipientes de cultivo celular convencional con la ventaja de permitir concurrentes en vivo-proyección de imagen y electrofisiológica grabaciones/estimulación.
El uso de la tecnología MEA ha contribuido al estudio de las características importantes de las redes neuronales5. Sin embargo, hay características inherentes que limitan el rendimiento de los AMUMA para estudiar comunicación y propagación de la APs en un circuito neuronal. MEAs permiten grabaciones de las células y estructuras subcelulares incluso como axones, pero en comparación con las señales de somal, axonales señales tienen una muy baja relación de señal a ruido (SNR)6. Por otra parte, la característica de detección de potenciales de campo extracelular de todas las fuentes alrededor de cada microelectrodo dificulta el seguimiento de la propagación de las señales en un circuito neuronal.
Sin embargo, estudios recientes han demostrado que se pueden conseguir mejores condiciones de grabación por tener los microelectrodos alineados dentro de microcanales estrecho en el cual pueden crecer los axones. Esta configuración proporciona un aumento significativo en el SNR que propagar señales axonales puede ser fácilmente detectado7,8,9,10,11,12, 13. La estrategia de aliarse dispositivos microfluídicos con tecnología MEA crea un microambiente aislado eléctricamente adecuado para amplificar señales axonal11. Por otra parte, la presencia de microelectrodos múltiples sensores a lo largo de un microsurco es fundamental para la detección y caracterización de propagación de las señales axonal.
Plataformas en vitro con topografías altamente controlable red neuronal pueden ser adaptadas a muchas preguntas de investigación14. Estas plataformas son adecuadas para usarse en el contexto de culturas neuronales pero se pueden ampliar para diseñar configuraciones de la cultura, donde se puede supervisar y evaluar la comunicación entre las neuronas y otros tipos de células. Así, esta configuración proporciona condiciones muy interesantes para explorar una serie de nervios-estudios relacionados con el neurodesarrollo, circuitos neuronales, codificación de la información, neurodegeneración y Neurorregeneración. Además, su combinación con los modelos emergentes de de15,de las células madre pluripotentes inducidas humanas16 puede abrir nuevos caminos en el desarrollo de terapias potenciales para enfermedades humanas que afectan el sistema nervioso.
Nuestro laboratorio está utilizando esta plataforma con microelectrodos de microfluídica (µEF) para comprender procesos neuronales a nivel celular y de red y su implicación en la fisio - y patológica del sistema nervioso. Dado el valor de dicha plataforma en el campo de la neurociencia, el propósito de este protocolo es demostrar cómo crear una cultura neuronal compartimentada sobre sustrato integrado MEAs, cómo las neuronas de la cultura en esta plataforma y cómo registrar con éxito, analizar e interpretar los resultados de dichos experimentos. Este protocolo sin duda enriquecerá la caja de herramientas experimental de cultivos neuronales en el estudio de la comunicación neuronal.

<table><tbody><tr><td>B-27 Suplemento (50X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTI17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenoimina) ramificada (PEI), 25 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Purifique el PEI ramificado por diálisis utilizando una membrana de corte de 2,5 kDa durante 3 días a 4&°; C frente a una solución de HCl de 5 mM (renovada diariamente). Liofilizar el PEI purificado.</td></tr><tr><td>Filtro de células (40 y micro; m)&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos cónicos (1,5 ml)</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>Pañal desechable, 60x40 cm</td><td>Bastos Viegas SA</td><td>455-019</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5, rectas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7, curvadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Suero Bovino Fetal Inactivado por Calor Premium</td><td>Biowest</td><td>S181BH-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de Engelbreth-Holm-Swarm&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td>Prepare una solución madre de laminina a 1 mg/mL disolviendo el polvo en el volumen respectivo de medio no suplementado. Guarde la solución de laminina a -20 ° C en alícuotas pequeñas (20 y micro; L) para evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación.</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTID25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento mejorada de Neubauer (hemocitómetro)</td><td>Marienfeld</td><td>630010</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td>Medio basal utilizado para cultivos neuronales</td></tr><tr><td>Dispositivos microfluídicos PDMS&nbsp;</td><td>no aplicable</td><td>no aplicable</td><td>Compuesto por dos compartimentos de siembra de celdas interconectados por 20 microranuras con 450 &mu; m longitud y tiempos; 10 &mu; m altura y tiempos; 14 y mu; m de ancho dimensiones y separados por 86 &micro; m (espacio intermedio total de 100 &mu; m).</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina (P/S) (100X)</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro de jeringa PES (&Oslash; 30 mm), 0,22 &micro; m&nbsp;</td><td>Frilabo</td><td>1730012</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de polipropileno, 15 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de polipropileno, 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas disposabel de poliestireno, 10 ml&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D Pipetas</td><td></td></tr><tr><td>serológicas de poliestireno disposabel, 5 ml&nbsp;</td>Membrana de celulosa regenerada estándar <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>(2 kDa)&nbsp; &nbsp;</td><td>Laboratorios de espectro</td><td>132107</td><td></td></tr><tr><td>tijera quirúrgica estándar</td><td>Fine Science Tools</td><td>91401-14</td><td></td></tr><tr><td>MEAs planar integrados en sustrato (256 microelectrodos)</td><td>Multi Channel Systems</td><td>256MEA100/30iR-ITO</td><td>252 electrodos de registro de nitruro de titanio (TiN) y 4 electrodos de referencia internos organizados en una cuadrícula cuadrada de 16 por 16. Cada electrodo de registro es de 30 y micro; m de diámetro y espaciados entre sí por 100 &micro;m.</td></tr><tr><td>Jeringa punta luer-lock, 10 ml&nbsp;</td><td>Terumo Europe</td><td>5100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa luer-lock punta, 50 ml&nbsp;</td><td>Terumo Europe</td><td>8300006682</td><td></td></tr><tr><td>Terg-A-Zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287&nbsp;</td><td>Detergente en polvo con enzimas activos utilizado para la limpieza de MEAs</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos, 35 mm&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27150</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos, 90 mm</td><td>Frilabo</td><td>900095</td><td></td></tr><tr><td>solución de azul de tripano (0,4%)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina (1:250)</td><td>Thermo Fisher Scientific 27250018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta de vinilo 471</td><td>3M</td><td>B40071909</td><td></td></tr></tbody></table>

microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación neuronal y axonal señal propagación

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Arreglos de microelectrodos (MEAs) son ampliamente utilizados para el estudio de la función neuronal en vitro. Estos dispositivos permiten concurrente no invasivo grabación/estimulación de la actividad electrofisiológica durante largos períodos. Sin embargo, la característica de detección de señales de todas las fuentes alrededor de cada microelectrodo puede convertirse en desfavorable al tratar de entender la comunicación y propagación en circuitos neuronales de la señal. En una red neuronal, las neuronas varios pueden activarse simultáneamente y pueden generar potenciales de acción superpuestos, lo que hace difícil discriminar y propagación de las señales de pista. Teniendo en cuenta esta limitación, hemos establecido una configuración en vitro se centró en la evaluación electrofisiológica de comunicación, que es capaz de aislar y amplificar señales axonales con alta resolución espacial y temporal. Por interfaces dispositivos microfluídicos y MEAs, somos capaces de compartimentar las culturas neuronales con una alineación bien controlada de los axones y de microelectrodos. Esta configuración permite grabaciones de propagación de la espiga con un alto cociente signal-to-noise en el transcurso de varias semanas. En combinación con algoritmos de análisis de datos especializados, proporciona la cuantificación detallada de comunicación varias relacionadas con características tales como velocidad de propagación, falta de conducción, velocidad de disparo, picos anterógrada, codificación y mecanismos.
Este protocolo muestra cómo crear una configuración de cultura neuronal compartimentado sobre sustrato integrado MEAs, cómo las neuronas en esta configuración de la cultura y cómo con éxito registrar, analizar e interpretar los resultados de dichos experimentos. A continuación, os mostramos cómo la configuración establecida simplifica la comprensión de la comunicación neuronal y axonal señal propagación. Estas plataformas de allanan el camino para nuevos modelos en vitro con topografías ingeniería y controlable de la red neuronal. Pueden ser utilizados en el contexto de culturas neuronales homogéneas o con configuraciones de la cultura donde, por ejemplo, comunicación entre las neuronas sensoriales y otros tipos de células es monitoreada y evaluada. Esta configuración proporciona condiciones muy interesantes para estudiar, por ejemplo, neurodesarrollo, circuitos neuronales, información de codificación, métodos de neurodegeneración y Neurorregeneración.

Utilizando el protocolo descrito aquí, neuronas corticales de rata de E-18 sembradas en µEF son capaces de desarrollar y mantenerse saludable en estas condiciones de cultivo para más de un mes. Tan pronto como 3 a 5 días en cultivo, las neuronas corticales crecen sus axones a través de micro-ranuras hacia el compartimiento axonal de µEF (figura 1). Después de 15 días en la cultura, las neuronas corticales cultivadas en µEF se esperan exhibir niveles constante...

Este protocolo pretende demostrar cómo combinar arreglos de microelectrodos en vitro con dispositivos microfluídicos para estudiar la transmisión del potencial de acción en cultivos neuronales. Análisis de los datos, es decir, la detección y caracterización de propagar potenciales de acción, es realizada con un nuevo avanzado, pero fácil de usar y libremente disponible, herramienta computacional.

Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo combinar el uso de micro fluidos con matrices de micro electrodes para generar la plataforma adecuada para el estudio de la comunicación neuronal y la propagación de la señal axonal. Hola, soy Paulo Aguiar y soy el PI del Laboratorio de Neuro ingeniería y Neurociencia Computacional del INEB, acostumbrado a codificar para ingeniería biomédica en la Universidad de Oporto, Portugal. Comprender la transmisión de información en los circuitos neurológicos sigue siendo uno de los mayores desafíos en neurociencia.Hoy, voy a mostrarles cómo podemos combinar matrices de microaccionados individuales con micro fluidos y herramientas de software desarrolladas aquí en nuestro laboratorio, para detectar y caracterizar potenciales de acción de propagación. Utilizamos esta configuración en una variedad de estudios, a saber, la codificación neuronal y la decodificación, y en las comunicaciones entre las neuronas sensoriales y otros tipos de células. Creemos que la demostración visual de este protocolo es crucial.Dado que el conjunto de matrices de micro fluidos y micro electrodes es esa dificultad en la gestión, y difícil de reproducir con solo reproducir protocolos. Para el mercado, las ventas de culto en esta plataforma no son sencillas, como las AFA convencionales, y requiere una atención especial a las celdas sentadas, e imanes de cultivo. Esta configuración nos permite estudiar varias propiedades relacionadas con la comunicación, como la velocidad de propagación y la dirección, en un entorno bien controlado.Aunque el procedimiento de grabación es simple, el análisis de datos requiere conocimiento y el uso de las herramientas computacionales adecuadas. El día antes de la sesión de la célula, comience preparando los dispositivos micro fluidos, limpiando con cinta adhesiva. Presione suavemente la cinta contra el dispositivo para llegar a todas las áreas del micro fluido.El plasma de aire limpia el MEA durante tres minutos para limpiar la superficie y hacerla más hidrófila. Dentro de una campana de flujo laminar, sumerja los micro fluidos en un 70 por ciento de etanol. Deje que se sequen al aire.Coloque cada MEA en un plato de petri y esterilice 15 minutos de exposición a la luz UV. A continuación, vaya a la zona central de MEA con 500 microlitros de solución PEI. Incubar durante al menos una hora.Dentro de una campana de flujo laminar, aspirar la solución de recubrimiento PEI de la superficie MEA. A continuación, lave los MEA cuatro veces con un mililitro de agua estéril. Con la ayuda de un microscopio estéril, colocado dentro de la campana de flujo laminar.Centrar el chip MEA, y añadir un mililitro de agua estéril a la zona central del MEA. A continuación, coloque el dispositivo micro fluido en la parte superior de la superficie MEA y alinee cuidadosamente la microgrooves micro cuadrícula activa del MEA. Aspirar el exceso de agua, e incubar durante la noche a 37 grados, para permitir un apego completo.Al día siguiente, cargue los pozos con laminin e incubar de nuevo. Después de recoger los susseds embrionarios, proceder a la disección de corteza prefrontal. Comienza exponiendo cuidadosamente el cerebro, usando un par de fórceps.Luego, retira suavemente el cerebro de su cavidad. Cúbralo con H-HBSS frío. Cuando esté presente, retire y deseche las bombillas olfativas.Finalmente, disecciona la corteza prefrontal. Asegurar la eliminación completa de los meninges. Repita este procedimiento para ambos hemisferios.Para el número de cerebros necesarios para su estudio. Dentro de una campana de flujo laminar, recoger los fragmentos de corteza previamente diseccionados en un total de cinco mililitros de H-HBSS. Luego, transfiera estos fragmentos a un tubo crónico estéril de 15 mililitros.Pipetear y tener 2,3 mililitros de solución de trippsina recién preparada en el tubo que contiene los fragmentos de corteza. Mezclar la suspensión e incubar a 37 grados durante 15 minutos. Agitar cada cinco minutos.A continuación, deseche el sobrenadante que contiene la tripina, agregue H-HBSS que contenga FBS, para desactivar la tripina restante. Agitar suavemente. Deja que los fragmentos de la corteza se asienten y deseche el sobrenadante.Lavar dos veces con H-HBSS, para quitar el FBS, y desechar el sobrenadante de nuevo. Añadir medio basal neural suplementado, y disociar mecánicamente los tejidos por pipetear lentamente arriba y abajo. Deseche el tejido restante filtrando la suspensión de sal a través de un colador celular.A continuación, mezclar 20 microlitros de suspensión celular con 20 microlitros de color azul tripano. Transfiera 10 microlitros a una cámara Neubauer y cuente el número de células viables. Inmediatamente antes de estar sentado en la celda, retire la laminin de todos los pozos del micro EF. A continuación, añada el pequeño volumen de medio sobrenadante a cada pozo del compartimiento axonal.Sembra lentamente cinco microlitros de suspensión celular al compartimento somal. Incubar a 37 grados durante una hora para permitir la fijación celular al sustrato. Después de una hora, llene suavemente cada pozo con un medio caliente suplementado.Agregue volúmenes pequeños para evitar el desprendimiento de celdas. A continuación, transfiera el micro EF a una incubadora. Aquí se muestra una cultura a los cinco días in vitro.Después de una semana, los cultivos comienzan a exhibir actividad espontánea. Antes de realizar grabaciones, utilice un controlador de temperatura para comer la placa base de fuego del prea amplificado. A continuación, coloque el micro EF en el preamplificador y cierre y cierre la tapa.Para grabar, abra el software experimental multicanal. Establezca la frecuencia de muestreo en 20 kilohercios. Arrastre los cuadros de filtro y grabados y conéctelos secuencialmente para registrar datos sin procesar y filtrados.Inicie la adquisición de datos para visualizar las señales y el registro rápido. Los datos grabados se pueden explorar rápidamente mediante el analizador multicanal. Aquí, la propagación de la señal a lo largo de los microgrooves ya está clara.Para identificar y caracterizar estos eventos de propagación, abra la grabación en el micro cazador de picos. Haga clic en el botón de información del archivo para acceder a la configuración de grabación y seleccione el conjunto de microdóditos para el análisis. Establezca el umbral para propagar la detección de eventos.Y leer los datos rápidos. El software enumerará todas las secuencias detectadas. A continuación, el usuario puede evaluar la velocidad de propagación como la información, entre pares de micro electrodos, y en función de su entre distancia y correlación cruzada.La herramienta de gráficos químicos permite al usuario estimar manualmente la velocidad de propagación. Aquí se muestra un evento de propagación. Detectado a lo largo de cuatro micro electrodos dentro de un microgroove.Estos eventos se pueden representar en una gráfica de Rasser. Aquí está la actividad de propagación a lo largo de 11 microgrooves durante los primeros dos minutos de grabación. El microgroove alto y bajo de actividad son de color amarillo y rojo, respetuosamente.Observe la sincronización de la actividad a lo largo de los 11 microgrooves. La sincronización es independiente de la velocidad de actividad. Como se puede ver en las variaciones de la velocidad de disparo instantánea de las dos microgrooves.Las microgrooves también funcionan como amplificadores de señal axonal, como se muestra en la caja y la gráfica de bigotes. Le hemos mostrado cómo combinar micro fluidos con LOS MEA, y cómo cultivar neuronas en ellos. Además, cómo grabar y extraer datos significativos de esas grabaciones.Esperamos que esta demostración sea útil para su investigación, por qué puede querer estudiar la comunicación en circuitos neuronales.

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Investigación

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Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación (Video) | JoVE Journal

Microfluídica de entretela con arreglos de microelectrodos para el estudio de la comunicación Neuronal y Axonal señal propagación

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