Name: Colletotrichum fioriniae Desarrollo en agua y extractos florales basadas en cloroformo arándano y arándano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprende a evaluar la dinámica temporal de Colletotrichum fioriniae usando bioensayos con extractos florales de arándanos y arándanos rojos. Este método permite monitorear el desarrollo del patógeno en tiempo real.

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Agradecemos el Guillermo S. Haines, Sr. arándano investigación fondo y arándanos de Nueva Jersey y arándano Research Council, Inc. soporte. También agradecemos a Jennifer Vaiciunas (orientación y florales preparaciones), Christine Constantelos (cultura fungicida y florales preparaciones), David Jones (florales preparaciones y extracciones), Langley Oudemans (florales preparaciones, filmación/fotografía), Jesse Lynch (florales preparaciones), Roxanne Tumnalis (soporte general) y numerosos estudiantes/pasantes.

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<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
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<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
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<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
<li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li>
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<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
<li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community%3A+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los bioensayos de detección de la respuesta de C. fioriniae extractos florales (FEs) fueron desarrollados para la fruta de arándano y arándano patosistemas putrefacción pero pueden ser fácilmente adaptados para otros cultivos hortícolas. El protocolo detallado arriba ha sido valioso en la adquisición de muchos conjuntos de datos importantes incluyendo, sin limitarse a: efectos de la FE en varios aislados de numerosos patógenos, curso del tiempo la información relacionada con etapas de crecimiento del hongo en presencia de varias FEs, comparación de técnicas de extracción, los extractos de inspección de los productos químicos individuales en fioriniae C. crecimiento y diferenciación, evaluación del órgano de la flor individual, efectos de temperatura en C. fioriniae en presencia de FE, efectos de extracción de cera dependiente de fenología y efectos de lluvia floral. Mediante el uso de estas técnicas, los datos generados también ha proporcionado una comprensión mucho más clara de vida fioriniae C. etapas y aclara parcialmente por el período de floración es tan importante para el control de fruta muchos patógenos de la descomposición.
Inicialmente, todas las flores fueron procesadas idénticamente a la activa-FE, pero el proceso de extracción se ha movido hacia el uso de flores todo. Disección floral fue lenta y tuvo muy poco efecto en la bioactividad de la FEs resultante. Sin embargo, los órganos florales individuales pueden y han sido evaluados mediante este protocolo, pero el gran cuidado debe ser tomado no totalmente macerar los tejidos florales (suplemento 1 de la película, con las precauciones detalladas en el paso 2.3), como esto puede resultar en liberados compuestos de hongos tóxicos/estático en la FE que podría distorsionar la evaluación microscópica. Menos extracciones invasoras como paso -FE (adicional 2 de la película) y rw-FE ahora son más favorables debido a su facilidad de adquisición. Además, estas técnicas de extracción requieren sólo vacío filtración para adquirir señales químicas florales biológicamente activos.
Las flores utilizadas en todas las extracciones fueron típicamente refrigeradas para 0-3 días antes de la preparación del extracto. Gestión del tiempo del volumen de negocios de la FE (colección de campo a través del almacenamiento de información de extractos) es un reto del presente Protocolo. Esto fue exacerbado por las numerosas muestras de múltiples fuentes y fechas. Flores congeladas no han sido evaluadas en cualquier medida real, descongelados flores aparecen deteriorados y decolorados. Sin embargo, la FEs a base de agua han sido preparados, repetida congelación y descongelación no ha demostrado ningún efecto en la bioactividad de la FE, tan de largo como la FE son rápidamente congelar nuevamente después de la preparación de la prueba biológica (viable FE 3 año de edad).
Extracción de cloroformo permite la investigación de las respuestas de patógeno a ceras superficiales fruta floral tridimensional en un plano bidimensional a través evaporación ch-FE en cubreobjetos de vidrio. Sin embargo, es poco probable que las estructuras cristalinas reales de ceras depositadas la ch-FE son idénticas a la superficie de la cual fueron recogidos. Deben aplicarse técnicas significadas suplementarias si hongos ante las estructuras de cera específicas en vivo es el foco principal de investigación. Extractos de cloroformo necesitan más mantenimiento de almacenamiento de información de las extracciones de agua. Además de mantener la FE ch extractos en la oscuridad, el cultivo celular PTFE alineado tubo tapas y parafilm sellado abrigo deban revisarse regularmente para pérdidas por evaporación y reemplazado si es necesario.
El concepto de control de escorrentía de lluvia floral se basa en la idea de avanzar en herramientas de monitoreo de la enfermedad específica. Los dispositivos de captación de agua de lluvia pueden ser adaptados a muchas otras arquitecturas de planta, siempre y cuando el dispositivo de la colección captura agua de lluvia que se ha ejecutado de flores. Este enfoque proporciona información sobre si la estimulación floral está presente en el campo en cualquier momento y puede controlarse durante toda la temporada. Alternativamente, se pueden implementar dispositivos de recolección en varias ubicaciones de pabellón para determinar hasta qué punto señales florales han sido lavados durante cualquier dado humectante-evento. En el futuro experimentos, rw-FE dictará Cuándo deben comenzar a fungicidas y cuándo puede terminar con seguridad. Además, mediante el control de extracciones de cera dependiente de fenología (Protocolo, artículo 9), la importancia del período de floración a la biología del patógeno se ha convertido en aún más evidente. Esa sección fue incluida también para demostrar la flexibilidad de estos bioensayos, proporcionando métodos que permiten la comparación lado a lado de ceras superficiales anfitrión temporal separadas. Los datos generados utilizando las técnicas de extracción floral y pruebas biológicas representan indicadores tangibles de estímulo patógeno, clases químicas específicas importantes para la biología del patógeno y objetivos para futuras estrategias.

Fioriniae Colletotrichum causa una putrefacción de la fruta de arándano de Highbush (Vaccinium corymbosum L.) y el arándano rojo americano (V. macrocarpon Aiton) grandes1,2. Este patógeno fue recientemente delineado de C. acutatum especies complejas de3,4,5,6 y es un agente causal de la antracnosis de arándano y un miembro de la putrefacción de la fruta de arándano complejo, además de causar numerosas otras plantas enfermedades en todo el mundo7. C. fioriniae tiene una latente, hemibiotrophic estilo de vida8, con las infecciones que ocurren durante el desarrollo de la floración y el síntoma no ser aparente hasta que la fruta está en etapas finales de maduración9. En arándanos y arándanos, putrefacción de la fruta sólo adecuadamente se controla con fungicidas durante el periodo de floración. El patógeno sobrevive al invierno en arándano latente botón floral escalas10 y sporulates durante la floración. Conidios se mueven a lo largo de la cabina a través de salpicaduras de lluvia dispersión11,12 y acumulación de inóculo se ha correlacionado fuertemente en el período de floración13. Respuesta de especies de Colletotrichum a flores de host no es exclusiva de Vaccinium, flores son importantes componentes de la fruta de cítricos post floración drop (PFD)14 así como antracnosis fresa15, en ambos casos causando el patógeno a esporular. Todos estos casos destacan la necesidad de métodos efectivos para evaluar la dinámica temporal de señales químicas florales fioriniae C. y otros patógenos que infectan durante la floración. La información proporcionada por los métodos descritos aquí se está volviendo cada vez más valioso.
Este protocolo detalla métodos de obtención del extracto floral (FE) y guía la evaluación de respuestas C. fioriniae fe via vidrio cubreobjetos pruebas biológicas15,16. Las técnicas de extracción de flores se dividen en dos tipos principales; extracciones de agua (activo-FE, pasivo (pass -FE) y campo base de agua de lluvia (rw-FE)) y basado en cloroformo (ch-FE)17 extracciones. Las extracciones de agua permiten la inspección de agua movilizada floral señales químicas. Estas señales movilizados son probablemente importantes componentes de la corte de la infección, ya que FE aumenta grandemente la velocidad de infección16, además de proporcionar la humedad necesaria para que la infección que se produzca. Además, representan un estado más natural como estimulación floral puede ser lavada en el pabellón durante eventos de humedecimiento como previamente observados en arándanos y otros sistemas de cultivo14,16. Extracciones florales basada en cloroformo (ch-FE) también proporcionan información valiosa referente a la respuesta del patógeno a la superficie de host ceras17,18, elucidar las primeras etapas de crecimiento de conidios una vez depositados sobre susceptible órganos de host (es decir, flores, los ovarios y fruta). Respuesta del patógeno a cambios estacionales en la superficie ceras de host también puede controlarse usando este protocolo. Por consiguiente, las pruebas biológicas se adaptan a trabajar con FE basados en agua o cloroformo basado en FE para mitigar las diferencias inherentes entre estos dos materiales.
Los datos generados por los bioensayos revelaron que las extracciones de agua estimulan mayores niveles de conidiation secundario que extracciones de cloroformo donde existe una respuesta definitiva appressorial, por lo tanto implicando múltiples compuestos presente en la FE. Curiosamente, ambas de estas respuestas de crecimiento se observaron cuando usando agua de lluvia que se había quedado fuera de flores de arándano y arándano, indicando múltiples compuestos estimulantes puede ser lavada de la superficie de las flores. Por lo tanto, seguimiento para el estímulo floral se proporciona información sobre la probabilidad de éxito del patógeno en un sistema agrícola.
El objetivo final de este protocolo es proporcionar una metodología para generar información biológica base en hongos fitopatógenos en respuesta a señales químicas florales, así como iniciar metodologías que pueden utilizar esta información floral para ayudar a procesos de la gestión y toma de decisiones de la enfermedad específica.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m tamaño de poro, acetato filtro esterilizante</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>Aclaración de extracto floral de arándano (FE)&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 y micro; l pipeta con puntas</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo, cualquier marca dentro del rango será adecuada</td></tr><tr><td>40-200 y micro; l pipeta con puntas</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo, cualquier marca dentro del rango será adecuada</td></tr><tr><td>5-40 y micro; l pipeta con puntas</td> <td>-</td><td>-</td><td>Equipo, cualquier marca dentro del rango será adecuada</td></tr><tr><td>Pistola de pulverización de aire taza de pulverización de pintura desechable con adaptador de conexión &nbsp;</td><td>Carga portuaria</td><td>97098</td><td>Arándanos Agua de lluvia (rw-)Colección FE</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Amsco</td><td>3011</td><td>Equipo, preparación</td></tr><tr><td>de medios Estera de malla de barra (lámina de malla plástica)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>Colección pasiva (pasada)-FE</td></tr><tr><td>Temporizador de sobremesa</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-47</td><td>Equipo, preparación de FE</td></tr><tr><td>Manguera de presión/vacío negra</td><td>VWR</td><td>62994-795 Componente de filtro de</td><td>vacío</td></tr><tr><td>Embudo Buchner</td><td>Coors USA</td><td>60240</td><td>Componente de filtro de vacío, acepta discos de papel de filtro de 55 mm</td></tr><tr><td>Quemador Bunsen&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Carbonato de calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td> Centrífuga <td>de componentes de medios</td></tr><tr><td></td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>RC 5B Plus</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>Equipo, colección rw-FE</td></tr><tr><td>Estopilla (grado 50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS240</td><td>Equipo, preparación de FE</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>Químico, triclorometano: grado de ensayo, &ge; 99% puro, para biología molecular, sin peróxido</td></tr><tr><td>Agar de harina de maíz (CMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp; Medios de premezcla, almacenamiento aislado en inclinaciones</td></tr><tr><td>Tinte azul algodón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>Tinte azul algodón y lactofenol</td></tr><tr><td>Agar Difco VWR</td><td></td><td>90004-032</td><td>Componente de medios</td></tr><tr><td>Taladro</td><td>prensa Delta-Equipment</td><td></td><td>, colección rw-FE</td></tr><tr><td>EASYpure LF Agua ultrapura</td><td>Barnstead</td><td>D738</td><td>Equipo, fuente de agua desionizada</td></tr><tr><td>Etanol (95%)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de filtro químico (500 ml)</td><td>Pyrex</td><td>No. 5340</td><td>Componente de filtro de vacío</td></tr><tr><td>Campana de gases</td><td></td> <td>Hamilton-Equipo</td><td>,</td></tr><tr><td>uso de cloroformo Embudo (7 X 7 cm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>Colección de arándanos rw-FE, preparación FE</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio genérico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-101</td><td>Conductancia del bioensayo</td></tr><tr><td>Botella rociadora de bomba de plástico genérica</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>pass-FE colección, capacidad de al menos 250 ml</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de células de vidrio</td><td>-</td><td>-Almacenamiento</td> <td>de ch-FE</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>Conductancia del bioensayo</td></tr><tr><td>Células de vidrio de Van Tieghem (tubos de vidrio cortados a mano)</td><td>- </td><td>-</td><td>Bioensayo de cloroformo (ch)-FE, (8 mm OD 6 mm ID)</td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio (1-100 y micro; l)</td> <td>Hamilton Co. Inc.</td><td>#710</td><td>ch-FE Bioensayo</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lactofenol algodón azul tinción</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Ácido láctico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>Lactofenol tinción azul algodón</td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>Equipo, entorno de trabajo estéril</td></tr><tr><td>Sonda metálica (genérico)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td> Microscopio de <td>almacenamiento y preparación de mezclas para tratamiento acuoso</td></tr><tr><td>, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>Equipo</td></tr><tr><td>Mortero (cerámica)</td><td>Coors USA</td><td>60313</td><td>Componente del filtro de vacío</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td>Colección de flores</td></tr><tr><td>Discos de papel (toallas de papel cortadas)</td><td>Conceptos básicos de oficina</td><td>KCC01510</td><td>control de la humedad en bioensayo</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Película de parafina plástica&nbsp;</td></tr><tr><td>Mortero (cerámica)</td><td>Coors USA</td><td>60314</td><td>Componente del filtro de vacío</td></tr><tr><td>Cristales de fenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A92-100</td><td>Mancha de lactofenol azul algodón</td></tr><tr><td>Bolsas de plástico (~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td><td>Equipo, refrigeración de flores</td></tr><tr><td>Placas de plástico para cultivo celular (9 cm de diámetro)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>(placa de Petri), tapas</td></tr><tr><td>revestidas de politetrafluoroetileno (PTFE) de conductancia de bioensayo&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td><td>Almacenamiento de vasos de</td></tr><tr><td>precipitados ch-FE Pyrex (100 ml)</td><td>Pyrex</td><td>Nº 1000</td><td>Preparación de ch-FE</td></tr><tr><td>Bandeja de pan Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>pass-FE colección</td></tr><tr><td>Pyrex cilindro graduado</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo, preparación de FE</td></tr><tr><td>Recipiente de plástico sellado (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Conductancia del bioensayo</td></tr><tr><td>Tijeras de disección de punta afilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Equipo, para cortar gasa y discos de papel</td></tr><tr><td>Colador de malla de acero inoxidable</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>Preparación de ch-FE</td></tr><tr><td>Broca escalonada (step-bit)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, colección rw-FE</td></tr><tr><td>Bucle estéril (combi-loop)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602;</td><td>Preparación del cultivo</td></tr><tr><td>Cable telefónico (cables internos)</td> <td>-</td> <td>Colección Blueberry rw-FE</td><td></td></tr> <tr><td>Cesta de tubo de ensayo &nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>Sustitución fácilmente disponible para la cesta de malla de plástico [fresa]&nbsp;</td></tr><tr><td>Jugo V8</td><td>Campbell's Soup</td> <td>Company-Componente</td> <td>de medios fúngicos</td></tr><tr><td>Cestas de malla de plástico vintage [fresa] Colección</td> <td>de donación-pass-FE, puede sustituir a la cesta de tubos de ensayo (470137-792)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie (Vortex)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812 Preparación de</td><td>suspensión de esporas</td></tr><tr><td>Whatman Nº 1 Cualitativo Círculos de 55 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Componente de filtro de vacío</td></tr><tr><td>Bridas de plástico blanco (100 mm)</td><td>Uline</td><td>S-566W</td><td>Colección Cranberry rw-FE</td></tr></tbody></table>

colletotrichum fioriniae desarrollo en agua y extractos florales basadas en cloroformo arándano y arándano

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Para controlar con precisión la fenología de la época de floración y la dinámica temporal de señales químicas florales fruta hongos patógenos de la descomposición, métodos de extracción floral y cubreobjetos bioensayos fueron desarrollados utilizando fioriniae Colletotrichum. En arándanos y arándanos, este patógeno es óptimamente controlada mediante la aplicación de fungicidas durante la floración debido al Juego de flores de papel en las etapas iniciales de la infección. El protocolo detallado aquí describe cómo florales extractos (FE) fueron obtenidas usando agua, cloroformo y métodos de campo basados en el agua de lluvia para su uso posterior en las correspondientes pruebas biológicas de cubreobjetos de vidrio. Cada FE sirve para proporcionar un conjunto diferente de datos: respuesta de C. fioriniae a movilizado químico floral de señales en el agua (a base de agua), respuesta del patógeno a flor y fruta superficie ceras (cloroformo-basado) y seguimiento basado en el campo de recoger agua de lluvia floral, en vitro observaciones hacia un entorno agrícolo. Ampliamente se describe la FE como ya sea base agua o cloroformo-, con una prueba biológica apropiado descrito para compensar las diferencias inherentes entre estos dos materiales. Agua de lluvia que tenía escurr con flores fue colectado en dispositivos únicos para cada cultivo, aludiendo a la flexibilidad y la aplicación de este enfoque para otros sistemas de cultivo. Los bioensayos son rápido, barato, simple y ofrecen la posibilidad de generar información spatiotemporal y site-specific sobre la presencia de compuestos florales estimulantes de diversas fuentes. Esta información en última instancia mejor informará estrategias de manejo de la enfermedad, como FE disminuye el tiempo necesario para que la infección que se produzca, así proporcionando la penetración en cambio los riesgos de infección del patógeno durante la temporada de crecimiento.

Los resultados presentados aquí son unos ejemplos de los muchos ensayos que pueden realizarse utilizando esta metodología. Figura 1 es una guía ilustrada para el bioensayo de la FE a base de agua y se complementa con la figura 2 que sigue a la prueba de FE basada en cloroformo. La figura 3 muestra a una guía visual a lo que puede esperarse en la evaluación microscópica de C. fioriniae en 24 h, en ambos bioensayos basados en agua y cloroformo (en comparación con controles SDW). Figura 4 detalles de un estudio de tiempo-curso de 24 h con fioriniae C. en presencia de la variedad de arándano 'Stevens' ch-FE y da la referencia visual a un resultado de la importación de esta investigación: FE disminuida el tiempo necesario para formar las estructuras de infección Comparado con el SDW. Figura 5 es un ejemplo de datos obtenidos de un bioensayo de cubreobjetos con escurrimiento de lluvia floral arándano (CB "Flor" rw-FE). La figura 6 representa otro importante resultado: ovario floral ch-FE fue mucho más estimulante que fruta ch-FE, indicando la importancia de la floración en el ciclo de vida de C. fioriniae. Las fotografías adicionales y películas proporcionan importantes visuales de las flores utilizadas en las extracciones y lluvia floral colección dispositivos o despliegue, además de películas que visualizar el (extracción de activos - y pasivos- procesos basados en agua).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figura 1 : Visión general de la base de agua floral extracto prueba biológica (FE). Este ensayo fue utilizado para los extractos florales a base de agua con flores de arándano y arándano: activo -floral extractos (activo-FE), pasivo -floral extractos (pasar-FE) y escurrimiento de agua de lluvia floral (rw-FE). La - FE porción generalmente constituye el factor de la variable experimental. Por el contrario la - FE parte puede permanecer constante y puede evaluarse post-inoculación de puntos/horas de tiempo. Preferencia se han realizado en 4 análisis de campo con 200 aumentos. Abreviaturas: Agua desionizada estéril, SDW; Área por campo de visión, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figura 2 : Visión general de cloroformo floral extracto prueba biológica (ch-FE). Este ensayo se utilizó para el arándano y arándano (flores, los ovarios y fruta). Sólo un tipo de mezcla acuosa de tratamiento fue utilizado en este ensayo, la suspensión de esporas de 1 parte en 2 partes SDW (para mantener la concentración conidial constante debido a la evaporación de ch-FE). Este ensayo puede utilizarse para comparar varios ch-FE (ceras de diferentes superficies de la planta), o múltiples tiempo puntos/horas post inoculación utilizando un solo ch-FE. Abreviaturas: Agua desionizada estéril, SDW; Células van Tieghem [cristal], VanT. celda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figura 3 : Comparación visual de Colletotrichum fioriniae en presencia de FE basada en agua y FE ch. En este arándano de ensayo 'Bluecrop' (activo-FE, base de agua) (aislar hongos: BB #10) y arándano 'Stevens' basada en cloroformo (ch-FE) (aislar hongos: CB-PMAP182) extractos florales fueron comparados a los controles SDW. Un aumento dramático en la secundaria conidiation (anillos) y la formación de apresorio (flecha) se observó al comparar los conidios en presencia de SDW (control) (A) a activo-FE (B) a la inoculación posterior 24 h. Sin embargo, conidiation secundario no era tan evidente al comparar el cloroformo bioensayo SDW control (C) ch-FE (D); por el contrario, C. fioriniae crecimiento desplazado hacia la formación de appressorial. Es una respuesta común para cada tipo de extracción, basada en agua y cloroformo-base, independientemente del host/especies descritas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figura 4 : Tiempo-curso de estudios (24 h) con Colletotrichum fioriniae en presencia de FE ch. En este ensayo, un control SDW (A-d) y arándano 'Stevens' ch-FE (E-F) fueron inspeccionados visualmente en 0, 6, 12 y post-inoculación de 24 h (un ejemplo de puntos de tiempo variable en lugar de comparar múltiples FE). Formación de apresorio (flecha) comenzó a las 6 h en el ch-FE y aumentado constantemente a lo largo de puntos de tiempo posteriores. Este resultado se escapa un factor importante de la biología del patógeno durante el periodo de floración: flores de reducen el tiempo necesario para formar las estructuras de infección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figura 5 : Representación gráfica de los datos recogidos en un bioensayo con rw-FE. Correr agua de lluvia fuera de flores de arándano (CB "Flor" rw-FE) y aguas pluviales Virgen que no habían tocado cualquier tejidos de la planta de arándano rojo ("Tierra" rw-FE) de un solo evento de humedecimiento, además de un estándar activa, basada en agua floral Extracto de arándano (CB activo -FE) (control positivo) y SDW (control negativo) fueron sometidos a una prueba biológica cubreobjetos a base de agua y evaluados para el crecimiento de C. fioriniae . CB "Flor" rw-FE tenía el mismo nivel de formación conidiation y apresorio secundaria como el estándar CB activo-FE en inoculación después de 24 h, lo que indica que los dispositivos de captación fueron eficaces en la captura de flores estimulantes durante un evento de humedecimiento. Conidias total se compone de primaria (depositado), conidios y conidios secundarios recién formados. Letras indican diferencias significativas a p &lt; 0.05 según por lo menos una diferencia Fischer significativa prueba (LSD); mayúsculas, total de conidios; minúsculas, apresorios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figura 6 : Arándano fenología en ch-FE prueba, inspección visual. Manejo de la enfermedad para fruta descomposición hongos a menudo consiste en aplicaciones de fungicida de tiempo de la floración. Aquí, extractos cloroformo basado en arándano (ch-FE) de múltiples etapas de crecimiento de arándano ('Stevens') visualmente evaluaron el efecto de superficie ceras en C. fioriniae en inoculación después de 24 h. Los ovarios recogido en junio (A), frutos inmaduros que se recogen en julio y agosto (B, C), fruta recogida en octubre (D), y un control SDW (E) fueron examinados para la formación de appressorial (flecha). Ovario ch-FE tuvo la mayor magnitud de appressorial formación, indicando que esta fenología de la planta (floración) es muy importante que el ciclo de vida de C. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Suplementario Figura 1: inflorescencia de Blueberry. Se colectaron flores de arándano para las extracciones durante plena floración (abril-mayo en New Jersey, USA) (se muestra 'Bluecrop'). Tenga en cuenta la superposición de corolas/ovarios de flores adyacentes y la arquitectura general de la inflorescencia en comparación con suplementario Figura 2 (arándano vertical). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Suplementario Figura 2: arándano rojo vertical. Se colectaron flores de arándano para extracciones durante plena floración (junio-julio en New Jersey, USA) (se muestra a 'Stevens'). Tenga en cuenta las etapas de flor variada en una sola inflorescencia arándano (vertical) y la forma de gancho, gotita de agua manteniendo la forma de la corola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Suplementario Figura 3: distribución de agua de lluvia arándano (flor). Completa el dispositivo de recolección de agua de lluvia floral arándano, colocado directamente bajo un conjunto de inflorescencias. Nota el alambre recubierto de plástico usado para orientar verticalmente el dispositivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Suplementario figura 4: implementación de agua de lluvia de arándano (stem). Blueberry completo lluvia floral dispositivo de la colección, a medio camino abajo del tallo entre una inflorescencia y la corona del casquillo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Suplementario Figura 5: distribución de agua de lluvia de arándano (corona). Completa el dispositivo de recolección de agua de lluvia floral arándano, colocado en la base del arbusto (corona). Los cables revestidos plástico Nota pueden quitarse si no es necesario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Suplementario Figura 6: implementación de agua de lluvia de arándano (tierra). Completa el dispositivo de recolección de aguas pluviales Virgen, colocado junto a arbustos de arándanos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Suplementario Figura 7: implementación de lluvia arándano (primer plano). Completa dispositivo de recogida de arándanos lluvia floral, con dos barras verticales bajo los lazos del alambre cruzado perfectamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Suplementario Figura 8: implementación de arándano lluvia. Múltiples terminado dispositivos arándano lluvia floral en un pantano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Suplementario 1 película: extractos florales activados, a base de agua (activo -FE). Soporte de vídeo adicional siguiendo los pasos 2.3-2.5.1. Se utilizaron flores de arándano 'Bluecrop'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Adicional 2 de la película: pasiva, extractos florales a base de agua (pasar-FE). Soporte de vídeo adicionales siguientes pasos 3.3-3.4. Se utilizaron flores de arándano 'Bluecrop'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Complementaria 3 película: implementación de dispositivos de captación de lluvia floral arándano. Soporte de vídeo complementaria siguiente paso 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>

Aquí, se describen pruebas biológicas diseñadas para controlar el desarrollo de un hongo patógeno Colletotrichum fioriniae, en presencia de extractos florales arándano o cranberry en cubreobjetos de vidrio. Agua, cloroformo y agua de lluvia de campo - basan floral extracción se detallan técnicas así como información sobre cómo puede aplicarse esta información.

Colletotrichum fioriniae Desarrollo en agua y extractos florales basadas en cloroformo arándano y arándano

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Este protocolo proporciona un sistema económico y adaptable para evaluar la dinámica temporal de las señales fluoroquímicas en colletotrichum fiorniae y otros patógenos vegetales que infectan la floración a término. Los nuevos dispositivos de recolección de agua de lluvia en suelo permiten al usuario monitorear estimulantes naturales y condiciones que afectan el desarrollo de patógenos de una manera casi específica del sitio en tiempo real. Comience este procedimiento con una cultura de Colletotrichum fiorniae de un huésped infectado naturalmente como se describe en el protocolo de texto.Cuando las colonias comienzan a esporular, raya la conidia sobre otro agar V 8 Juice que contiene un plato de cultivo celular para producir un cultivo esporulante de alta densidad. Después de siete días de crecimiento, utilice un bucle estéril estándar para reunir una pequeña cantidad de conidia de la cultura de alta densidad tocando ligeramente el bucle a la masa conidial. Revuelva esto en un tubo centrífuga de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de agua estéril desionizada.Vórtice esta muestra durante 10 segundos. Con una pipeta estándar, sumerja hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar aún más la muestra. A continuación, coloque una gota de la muestra vórtice en el hemocitociómetro y calcule las concentraciones de esporas.Ajuste la concentración a 0,1 millones de conidia por mililitro de agua destilada estéril con un volumen final de cinco mililitros. Esto se conoce como la suspensión de esporas y sólo se hace inmediatamente antes de su uso en cualquiera de los bioensayos. Para realizar la extracción floral a base de cloroformo, limpie todos los componentes con 95% de etanol dos veces.A continuación, limpie los componentes dos veces con cloroformo para evitar la contaminación de cada extracción. No limpie las tapas forradas de PTFE con cloroformo, ya que las dañará. Después de la limpieza, deje los componentes a un lado para que se sequen al revés.Combine una parte de flores procesadas en nueve partes de cloroformo en un vaso de precipitados añadiendo flores y luego cloroformo. Revuelva suavemente durante 30 segundos y colar a través de una pantalla de acero inoxidable en el segundo vaso de precipitados. Vierta el extracto a base de cloroformo del segundo vaso de precipitados en el tubo de cultivo de vidrio y coloque la tapa de PTFE.Envuelva la tapa con parafilm para evitar la evaporación. Almacene el extracto floral a base de cloroformo resultante en la oscuridad para reducir la degradación de la luz a cuatro grados centígrados hasta su uso experimental. Repita las extracciones con varias muestras para proporcionar réplicas.Para crear un dispositivo de recolección para cada ubicación seleccionada, utilice una broca conectada a una prensa de perforación para perforar un agujero en la parte inferior de una taza de pulverización. A continuación, corte una línea recta desde la parte superior del agujero hasta la boca de la taza de pulverización. Ahora taladre cuatro agujeros equidistantes lo suficientemente grandes como para enhebrar el alambre recubierto de plástico en la boca de la taza de pulverización.Coloque un extremo de los cables recubiertos de plástico dejando un extremo libre. Taladre un agujero lo suficientemente grande como para enhebrar el spray de pintura o el adaptador de taza en una tapa de tapa centrífuga de 50 mililitros. Selle las roscas del adaptador con parafilm para evitar fugas.Fije esto tanto a la tapa de la centrífuga como a la parte roscada de la taza del pulverizador. A continuación, conecte el tubo de centrífuga de 50 milímetros acoplado. Cree cuatro dispositivos de recopilación por ubicación de muestreo.Implemente dispositivos en ubicaciones seleccionadas flexionando las tazas de pulverizador para que quepan en los tallos. Oriente el lado cortado de la taza del pulverizador hacia arriba utilizando los cables recubiertos de plástico unidos a otros tallos. Esto asegura que el agua que pasa sobre las flores es capturada.Para recoger el agua de lluvia de las flores de arándano, primero punción térmica ocho agujeros equidistantes alrededor de la boca del embudo usando una sonda de metal. Inserte lazos de giro en cuatro de los agujeros. Fije los otros extremos a la ubicación opuesta de ese agujero formando un patrón de cruce ordenado.Envuelva el embudo con parafilm y reserve. Taladre un agujero lo suficientemente grande como para insertar el vástago de conversión hacia abajo en una tapa centrífuga de 50 mililitros con una broca de paso. Inserte el embudo preparado en la tapa de la centrífuga.Después de la lluvia o el riego por encima, retire y reemplace la porción inferior del tubo de centrífuga. Los tubos de recolección de agua de lluvia deben cambiarse rápidamente después de los eventos de humectación, ya que son propensos a la degradación de contaminantes naturales movilizados en la escorrentía, como bacterias y otros hongos. Coloque dos capas de discos de papel dentro de platos de cultivo y remoje con dos mililitros de agua destilada estéril.A continuación, mezcle volúmenes iguales de agua destilada estéril y extracto floral a base de agua en tubos de microcentrífuga de dos mililitros. A continuación, añada un volumen igual de la suspensión de esporas a los tubos de microcentrífuga de dos mililitros preparados. La preparación resultante se conoce como una mezcla de tratamiento acuoso.Para el control, omita la porción de extracto floral y sustitúyalo con agua destilada estéril para mantener las concentraciones conidiales consistentes. Ahora coloque los cubreobjetos de vidrio pre-limpiados en la parte superior de las toallas de papel empapadas dentro del plato de cultivo celular. Coloque una gota de 40 microlitros de mezcla de tratamiento acuoso en el centro de un cubreobjetos.Repita esto para los tratamientos deseados, incluido el control. A continuación, cierre el plato de cultivo celular. Una vez que todos los tratamientos y réplicas han sido dispensados, coloque todos los platos de cultivo celular replicados en un recipiente de plástico sellado e incubar a 25 grados centígrados en la oscuridad.En puntos de tiempo predeterminados, añada 10 microlitros de un fijador a las gotas para detener el crecimiento y semi-preservar el soporte. Una vez que se ha añadido un fijador, invierta cuidadosamente los cubreobjetos colocando cada uno de ellos el lado de las gotas hacia abajo en un portaobjetos de microscopio de vidrio para facilitar el examen microscópico. Cuando todos los cubreobjetos estén en los portaobjetos del microscopio de vidrio, déjelos asentarse y secarlos parcialmente en la campana de flujo durante 20 minutos.Cuente todas las conidiias presentes en el cubreobjetos incluyendo conidia primaria, conidia germinada y conidia secundaria recién formada, así como appressoria. Trabaje a 400 veces la ampliación o 200 veces su totalizando un área de 3.808 milímetros cuadrados. En una campana de flujo laminar, agregue dos volúmenes iguales de agua destilada estéril y un volumen de suspensión de esporas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.Deje a un lado esta mezcla de tratamiento acuoso para bioensayos de extractos florales a base de cloroformo. En una campana de humo, coloque una célula Van T en un cubreobjetos de vidrio dentro del plato de cultivo celular de plástico preparado. Dispensar 33 microlitros de extracto floral a base de cloroformo deseado en el centro de la célula y dejar secar.No toque las paredes de la celda. Para el tratamiento de control, añadir cloroformo virgen. Una vez que el extracto floral a base de cloroformo se haya secado, dispensar 99 microlitros de la mezcla de tratamiento acuoso preparada con una pipeta estándar en el centro de la célula Van T.A continuación, cierre todos los platos de cultivo celular e incubar. En puntos de tiempo predeterminados, agregue 15 microlitros de un fijador a la célula Van T y déjelo reposar durante al menos cinco minutos para garantizar una tinción adecuada de hongos. Después de ese tiempo, retire cuidadosamente la célula Van T.Realice los pasos de inversión y adquisición de datos de cobertura como antes. Tras la evaluación microscópica de C.fiorniae a las 24 horas después de la inoculación, la comparación de conidia en presencia de agua destilada estéril frente a extracto floral a base de agua revela un aumento dramático en la conidiación secundaria y la formación de appressorium. Sin embargo, la conidiación secundaria no fue tan evidente al comparar el control de agua destilada estéril de bioensayo cloroformo con extractos a base de cloroformo.Más bien, el crecimiento de C.fiorniae se desplazó hacia la formación appressorial. En este ensayo, un control de agua destilada estéril y extracciones florales a base de cloroformo de arándanos fueron inspeccionadas visualmente en cero, seis, 12 y 24 horas después de la inoculación. La formación de appressorium comenzó a las seis horas en el extracto floral a base de cloroformo y aumentó constantemente a lo largo de los puntos de tiempo posteriores.Este resultado apoya el hallazgo de que las flores reducen el tiempo necesario para formar estructuras de infección. El manejo de enfermedades para los hongos que se pudren en la fruta a menudo implica aplicaciones de fungicidas en tiempo de floración. Aquí, extractos a base de cloroformo de arándanos de múltiples etapas de crecimiento de arándano fueron evaluados visualmente para las ceras de superficie efectivas en C.fiorniae en 24 horas después de la inoculación.Los ovarios recogidos en junio, los frutos inmaduros recogidos en julio, y en agosto, la fruta cosechada recolectada en octubre, y un control de agua destilada estéril fueron inspeccionados para la formación de appressorial. Los extractos a base de cloroformo ovárico tenían la mayor magnitud de formación appressorial, lo que indica la importancia de la floración en el ciclo de vida de C.fiorniae. El patógeno es el componente más importante de este protocolo.Los hongos deben trasladarse a medios frescos de forma rutinaria para mantener la consistencia entre los ensayos. Cualquier trabajo con cloroformo debe realizarse en una campana de humo por razones de seguridad. Esto incluye la preparación de materiales y cristalería, procedimientos de extracción y conductancia del bioensayo a base de cloroformo.Se pueden utilizar combinaciones de puntos de tiempo, patógenos, colecciones florales de agua de lluvia o extracciones de huéspedes para evaluar varias interacciones huésped-patógeno. Los dispositivos de recolección de agua de lluvia y los bioensayos asociados permitirán a otros trabajar con estimulantes anfitriones movilizados durante eventos de lluvia en numerosos sistemas de caminos.

colletotrichum-fioriniae-development-water-chloroform-based-blueberry

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