Trasplante de islotes intra-Omental utilizando relleno de islote de matriz h-Omental (hOMING)

Aquí, presentamos un protocolo para la validación in vivo de terapia celular basada en hidrogel, ilustrada por el ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos. Islote de matriz h-Omental (hOMING) implantación de relleno permite la implantación de una mezcla de células-hidrogel entre las capas omentales, cerca de los vasos sanguíneos, para maximizar el engraftment en un ambiente metabólico adecuado.

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de la terapia celular, como, ¿se puede optimizar el trasplante de islotes mediante la técnica quirúrgica hOMING? Las principales ventajas de esta técnica son que es simple, rápida y sintonizable, y la validación de biomateriales también es muy rápida. La demostración visual de la colocación de la aguja es fundamental para garantizar una inyección adecuada de injerto dentro del omento, ya que una aguja colocada incorrectamente puede provocar fugas de islotes.

Para inducir la diabetes, inyectar 75 miligramos por kilogramo de estreptozotocina intraperitonealmente en cada seis semanas de edad, 150 a 190 gramos Lewis rata receptora, y comprobar el estado de la diabetes por medición diaria de glucosa en sangre durante los primeros cuatro días después de la inyección. Cuando las ratas presentan una glucemia de más de dos gramos por litro, inyectar por vía subcutánea seis unidades de insulina de acción prolongada por día para prevenir las complicaciones de la diabetes y la pérdida de peso. Incluir ratas en la cohorte experimental cuando dos medidas del nivel de glucosa en sangre de la vena de cola son superiores a cuatro a cinco gramos por litro durante dos días consecutivos, con un nivel de péptido C bajo 200 picomolar.

Para la implantación de pellets, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo en el animal receptor diabético anestesiado y limpie el cuello con yodo povidona. Afeitar el área de implantación y limpiar la piel expuesta con yodo povidona adicional. Después de tres minutos, esteriliza un pellets de insulina 1/2 en una solución de yodo de una a cinco povidona y usa un trocar calibre 16 para perforar la piel expuesta del cuello.

A continuación, utilice la guía y la estilización para insertar los pellets y suturar la abertura con un solo punto. Limpie la puntada con más yodo de povidona y permita que la rata se recupere en una jaula con monitoreo y alimentos para evitar la hipoglucemia. Para medir la eficiencia de los pellets, medir la disminución de la glucemia cada semana durante un mes después de la implantación, incluyendo ratas en la cohorte experimental cuando se mantiene una medida del nivel de péptido C de la vena de cola bajo 200 picomolar a un mes después de la implantación de pellets de insulina.

Para el llenado de islotes de matriz intra-omental, cuente el número de islotes aislados de ratas donantes sanas en equivalentes de islotes, y prepare un equivalente de 7.660 islotes por kilogramo de receptor en tubos individuales de 1,5 mililitros. Lavar cada alícuota con 500 microlitros de medio CMRL sin suero bovino fetal y resuspender los pellets de islotes en 150 microlitros de portador de hidrogel de alginato recién preparado por tubo con una mezcla cuidadosa antes de colocar los tubos sobre hielo. A continuación, cargue jeringas de un mililitro equipadas con una aguja atraumática del calibre 21 con 150 microlitros de alginato vacío sin volumen muerto, seguido de 150 microlitros de alginato más islotes.

Coloque las jeringas sobre hielo y prepare el cuello del primer animal receptor como se acaba de demostrar. Usa un bisturí para hacer una incisión sobre la herida vieja y usa fórceps para eliminar los gránulos. Cierre la puntada con uno o dos puntos de puntada individuales y coloque la rata en la posición supina.

Esterilice el área peritoneal y afeite. Usa un bisturí para crear una laparotomía de un centímetro y medio justo debajo del esternón. Coloque la gasa esterilizada húmeda alrededor de la incisión e identifique la almohadilla de grasa omental situada junto al estómago.

Use fórceps para extraer suavemente la almohadilla de grasa de la cavidad peritoneal, extendiéndola sobre la gasa. Hidratar bien el tejido omental con dos mililitros de solución salina estéril precalentada de 37 grados Celsius, y, sosteniendo el tejido con pequeños fórceps curvos en una mano, penetrar el borde omental entre las capas omentales con la aguja de una jeringa cargada de islotes con la otra. Al insertar la aguja, asegúrese de que esté rodeada por una capa delgada de tejido omental antes de comenzar la inyección.

Inserte la aguja por completo y comience lentamente a inyectar la preparación del islote mientras retrae la aguja para permitir que los islotes inyectados se propaguen por todo el tejido. Durante la inyección, retraiga la aguja hasta el borde de los tejidos, deteniendo la inyección cuando la aguja esté casi fuera. A continuación, espere cinco segundos antes de iniciar una nueva inyección en la siguiente ubicación.

E inyectar otras tres a cuatro alícuotas como se ha demostrado. Cuando se haya dispensado todo el hidrogel, retire la aguja cuidadosamente para evitar la pérdida de los islotes inyectados, comprobando que los islotes no están agrupados en la jeringa al final de la inyección. Cuando se hayan entregado todos los islotes, hidrata el omento y la pared de la laparotomía antes de devolver cuidadosamente el tejido omental a la cavidad abdominal.

Inyectar dos mililitros de solución salina estéril precalentó en la cavidad abdominal para rehidratar la rata. A continuación, cierre la pared muscular con una sutura de hilo continua y coser la capa cutánea con un solo punto de puntada. Después de uno a dos meses de seguimiento metabólico, abra la incisión quirúrgica de cada receptor como se ha demostrado, y utilice fórceps para esparcir cuidadosamente la omenta sobre trozos de gasa empapados en solución salina dispuestas junto a las incisiones.

A partir de la región adherente a la cola pancreática, utilice tijeras para extirpar el tejido omental e inyecte dos mililitros de solución salina precalentada antes de cerrar cada animal como se ha demostrado. Arreglar el omenta recuperado en 4%paraformaldehído antes de incrustar en parafina. Luego, adquirir secciones de cuatro micrómetros de espesor de los tejidos en un microtoma y aplicar hematoxilina y tinción de eosina para la evaluación morfológica de los trasplantes.

Las perlas de dextrán trasplantadas utilizando el método hOMING como se demostró se observaron con frecuencia cerca de los vasos sanguíneos y se implantaron bien dentro del tejido graso. En este estudio isogénico representativo, la glucemia se controló primero mediante la implantación de un pellets de insulina 1/2 como se demostró y luego por islotes implantados como lo demuestra una glucemia de aproximadamente dos gramos por litro y una C-peptidemia superior a 500 picomolar en los animales receptores. Además, el análisis histológico de la omenta explantada reveló islotes altamente revascularizados, probablemente como resultado de su proximidad a los vasos sanguíneos.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la terapia celular exploraran el microambiente celular bioingeniero en modelos preclínicos.