Name: Trasplante de islotes intra-Omental utilizando relleno de islote de matriz h-Omental (hOMING) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende la técnica hOMING para trasplante de islotes en ratas, implantando mezclas de células e hidrogel en el omento para mejorar la vascularización y el control glucémico en modelos preclínicos de diabetes.

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Este trabajo fue financiado por Région Alsacia, BioArtMAtrix-Pôle Alsacia Biovalley-CQDM; 53-14/C1. Los autores agradecemos al equipo de Pr. Bruant-Rodier de Hôpitaux Universitaires de Estrasburgo para ayudar a desarrollar esta técnica innovadora.

Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas de los institutos nacionales de salud, con el número de autorización: AL/60/67/02/13.
1. receptor preparación
<ol><li>
Químicamente inducir diabetes en ratas destinatarias.
	<ol>
<li>Inyecte 75 mg/kg de streptozotocin (STZ, en estéril tampón de citrato de 0,1 M, pH 4) por vía intraperitoneal a ratas10. Nota: Para los estudios de trasplante, se utilizaron 6 ratas de cepa semana Lewis, 150-190 g de peso.</li>
		<li>Comprobar el estado de diabetes por mediciones de glucosa de sangre diarias durante los primeros cuatro días. Inyectar insulina de acción prolongada 6 U/día por vía subcutánea cuando las ratas presentan glicemia superior a 2 g/L para prevenir las complicaciones de la diabetes y pérdida de peso, hasta la implantación de pellets de insulina.</li>
		<li>Incluyen las ratas en la cohorte cuando son dos medidas de glucosa en la sangre de la vena cola &gt; 4-5 g/L para 2 días consecutivos y el nivel de péptido C es &lt; 200 pM. Medir la glucemia con un glucómetro y C peptidemia por un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA).</li>
		<li>Implante de pellets de insulina bajo la piel (véase 1.2). Nota: Terapia crónica de insulina permite la mejor regulación de la glucemia y evita complicaciones de la diabetes (que exacerban el estrés oxidativo en el sitio de trasplante)11. Además, la terapia conserva el estado diabético junto con una curva de crecimiento normal (sin pérdida de peso habitual observada en un animal diabético). Esto puede resultar en una almohadilla de grasa omental más grande, que es ideal para llevar a cabo el trasplante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Implantación de gránulos de insulina
	<ol>
<li>Anestesiar la rata anestesia de gas (3% de isoflurano en 500 mL/min O2) y la rata en la posición propensa.</li>
		<li>Verificar estado de anestesia comprobando la ausencia de reflejo (pata pellizcos). Limpie el cuello con povidona yodada y afeite la zona con una cuchilla de afeitar. Volver a aplicar povidona yodada y dejar reposar 3 minutos.</li>
		<li>1.5 lugar insulina pellets (3 unidades (U) / rata de 200 g) en una solución de yodo povidona diluido 1:5 para esterilizar las pelotillas. Perforar la piel del cuello mediante un trocar 16 G e inserte la pelotilla la guía amueblado y estilete. Recuperar la guía y el estilete y coser un punto único. Utilizar povidona yodada para limpiar la puntada. Nota: No manejo del dolor post quirúrgico fue necesario ya que la intervención era comparable a una inyección subcutánea (SC).</li>
		<li>Deje que la rata recuperar de la anestesia y asegurarse de que las ratas tienen acceso a los alimentos para evitar hipoglucemia.</li>
		<li>Medir la eficiencia de pellets mediante la medición de disminución de la glucemia después de la implantación.</li>
		<li>Comprobar la eficacia de pellet mediante el control de nivel de glucemia cada semana durante 1 mes.</li>
		<li>Incluyen a las ratas en la cohorte cuando una medida del nivel de cola vena sangre C péptido se mantiene debajo de 200 pM 1 mes después de la implantación de pellets de insulina. Nota: Comprobación de niveles de péptido C es obligatorio evaluar los animales en condiciones basales antes del trasplante y para confirmar su estado diabético. Regeneración de péptido C bajo siempre se presenta durante el seguimiento. El más bajo C-peptidemia es indicativo de la regeneración más bajo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Indicador de rumbo: islote de matriz Intra-omental relleno
<ol><li>
Preparación de la mezcla del islote-matriz.
	<ol>
<li>Preparar el portador islote viscoso en campana de flujo laminar. Disolver el polvo de alginato en PBS estéril a una concentración de 1.5%. Esterilizar la preparación por paso a través de un filtro de 0,22 μm. Preparar 400 μL por destinatario. Nota: Puede utilizarse cualquier tipo de hidrogel con una viscosidad adecuada para la inyección a través de una aguja de 21 G.</li>
		<li>Aislar islotes pancreáticos de ratas Lewis saludables (200-250 g) como se describió anteriormente12.</li>
		<li>Contar número de islotes en equivalentes de islote (IEQ) (uno IEQ se considera equivalente a un islote pancreático con un diámetro de 150 μm)13.</li>
		<li>En campana de flujo laminar, preparar alícuotas de 7660-islote equivalente (IEQ) en un tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Lavar alícuotas de islotes con 500 μl de medio CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) de suero fetal bovino.</li>
		<li>Islotes de pellets por centrifugación (a 2 min a 500 x g y 4 ° C). Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Agregar 150 μL de portador de alginato hidrogel sobre los islotes, mezclar cuidadosamente mediante pipeteo arriba y abajo y coloque la mezcla en hielo.</li>
		<li>Preparar una aguja atraumática de 21 G y una jeringa de 1 mL sin volumen muerto, cargando 150 μL de alginato vacío en la jeringa.</li>
		<li>Llene la jeringa con la mezcla de islotes y alginato (150 μL, volumen total 300 μL). Mantenga la jeringa en el hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimiento quirúrgico
	<ol>
<li>Esterilizar instrumentos quirúrgicos mediante esterilización en frío (2% Steranios 20 min).</li>
		<li>Anestesiar la rata usando anestesia isoflurano y colocar la rata en la posición propensa.</li>
		<li>Afeitar la zona del cuello con una cuchilla de afeitar y esterilizar la zona con povidona yodada. El yodo déjelo durante 3 minutos.</li>
		<li>Hacer una incisión con un bisturí y retire las pastillas de 1.5 insulina con unas pinzas. Cierre la piel con uno o dos puntos de punto único. No quite la rata de la anestesia. Nota: Después de 1 mes, el sedimento puede ser friable como algunos tejido fibrótico puede envolver como pelotillas; Utilice tijeras para diseccionarla correctamente.</li>
		<li>Colocar la rata en la posición supina. Afeitarse y esterilizar (con yodo de povidona) el área peritoneal. El yodo déjelo durante 3 minutos.</li>
		<li>Crear una laparotomía 1,5 cm justo debajo del esternón con un bisturí. Coloque una gasa húmeda estéril alrededor del área Incisa.</li>
		<li>Identificar el epiplón que es la almohadilla de grasa localizada junto al estómago. Utilice pinzas coger el epiplón, tire suavemente de la cavidad peritoneal, y difunda en la gasa. Nota: El tejido omental se extiende desde el bazo hasta el duodeno y se fija en su punto medio hasta el estómago. El epiplón normal de ratas con diabetes reciben tratamiento con insulina es aproximadamente de 2 cm² cuando se difunda en la gasa.</li>
		<li>Hidratar el tejido omental con 2 mL de solución salina estéril con 37 ° C. Utilice pinzas curvas pequeñas para manipular el tejido y penetrar el borde omental con la aguja entre las capas omentales. Inserte la aguja completamente.</li>
		<li>Iniciar la inyección de la preparación del islote lentamente y cuidadosamente mueva la aguja hacia atrás para inyectar los islotes en varios lugares (como líneas). Antes de retirar la aguja, asegúrese de que el hidrogel ha dejado de salir la aguja para evitar la pérdida de los islotes dispersos.</li>
		<li>Repetir esta manipulación para inyectar todo el contenido de la jeringa utilizando puntos de entrada diferentes para distribuir los islotes en el tejido omental. Nota: En ratas, generalmente se necesitan cuatro o cinco inyecciones.</li>
		<li>Compruebe que los islotes no están agrupados en la jeringa en el extremo de las inyecciones. Nota: Si algunos islotes son todavía visibles, es posible retirar la aguja de la jeringa, llene la jeringa directamente con 100 μl de hidrogel vacío y volver a conectar la aguja. Una segunda ronda de inyección se puede hacer para eliminar los islotes restantes.</li>
		<li>Volver a utilizar solución salina estéril para hidratar el tejido omental y la pared de la laparotomía. Utilice pinzas para reemplazar cuidadosamente epiplón en la cavidad abdominal.</li>
		<li>Inyectar 2 mL de solución salina estéril pre calentada en la cavidad abdominal para rehidratar la rata.</li>
		<li>Cerca de la pared muscular usando una sutura de hilo continuo. Luego coser la capa cutánea con único punto (punto por punto).</li>
		<li>Inyectar por vía subcutánea meloxicam (1,5 mg/kg) como analgésico durante 5 días una vez al día.</li>
		<li>Colocar la rata en una jaula en una almohadilla de calefacción hasta la recuperación de la anestesia. Repita el procedimiento para todas las ratas destinatarias.</li>
		<li>Medir la glucosa en la sangre después de trasplante de cada día. Si la glucemia es &gt; 2 g/L, inyectar 6 U de insulina de acción prolongada por vía subcutánea una vez al día.</li>
		<li>Evaluar la función del injerto por glucemia y c peptidemia monitoreo sobre 1 o 2 meses. Nota: En casos de trasplantes exitosos, glicemia debe estabilizarse dentro de 2-5 días después del trasplante, y las ratas pueden sacar insulina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. explantación de prótesis omental
Nota: Este procedimiento permitirá la confirmación de función del injerto buena. Después de la recuperación de un injerto funcional, las ratas deben retornar a un estado diabético. Este paso se realiza después de 1 o 2 meses de seguimiento metabólico.
<ol><li>Anestesiar la rata con anestesia de gas y colóquelo en la posición supina.</li>
	<li>Afeite la zona peritoneal y esterilizar con povidona yodada durante 3 minutos.</li>
	<li>Crear una laparotomía de 1,5 cm debajo de esternón con un bisturí. Coloque una gasa húmeda estéril alrededor del área Incisa.</li>
	<li>Identificar el epiplón, que está al lado del estómago. Utilice pinzas para extenderlo cuidadosamente sobre la gasa.</li>
	<li>Utilice tijeras para suprimir el epiplón. Partir de la parte que se adhiere sobre la cola del páncreas (al lado del bazo). Si se presenta sangrado, use una gasa estéril seca para detenerlo.</li>
	<li>Continuar la supresión a lo largo de la parte unida al estómago y recuperar el epiplón. Nota: En este lugar, las arterias gastroepiploica (figura 1) pueden causar una gran cantidad de sangrado si se cortan accidentalmente. Incisiones de la arteria son inevitables para recuperar el injerto, pero sangrado puede gestionarse utilizando pinzas y gasas. Si ocurre un corte accidental, comprimir firmemente con una gasa seca y mantener la compresión de al menos 1 minuto. El sangrado debe detenerse. Si no, use clips o un bisturí eléctrico para cauterizar los vasos.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg"> Figura 1: distribución de la arteria Omental. Para la explantación de injerto de epiplón, el área crítica compuesta por arterias gastroepiploica está representado en azul. Durante la resección de esta parte del tejido omental, debe pagarse a la sección de la arteria gastroepiploica derecha. Compresión, ligadura o cauterización puede utilizarse para limitar el sangrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="7"><li>Compruebe si el sangrado persiste. Si no, inyecte 2 mL de solución salina precalentada, cerca de la rata y proceso según se describió anteriormente.  Animales explanted volver a un estado diabético. Insulina inyectable (6 U/SC/día) es obligatoria para asegurar el bienestar de los animales.</li>
	<li>Eutanasia la rata 10 a 12 días después de la explantación usando una sobredosis de pentobarbital (182,2 mg/kg).</li>
</ol>4. histológico análisis: Hematoxilina y eosina
<ol><li>Fijar los Omentos obtenidos usando 4% paraformaldehido (PFA) y embeber en parafina.</li>
	<li>Corte secciones de 4 μm de espesor y tinción de hematoxilina y eosina para evaluación morfológica del trasplante se aplican.</li>
</ol>5. estadístico análisis
<ol><li>Determinar la significación estadística mediante software de análisis estadístico y análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas con la prueba de diferencia de significado honesta de Tukey como prueba post-hoc. Representan los valores de p como: *p &lt; 0.05; p &lt; 0.01; p &lt; 0.001.</li>
</ol>

<ol><li>Bakhshandeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3B+strategies%2C+tissues%2C+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+genetic+engineering+reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials.</a> Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo se pueden destacar algunos pasos críticos. En primer lugar, la persona realiza la cirugía y la manipulación de los tejidos debe ser delicada con el tejido adiposo, ya que es frágil. Aplastar o dañar el epiplón debe ser evitado. Epiplón, como un tejido defensivo, se enriquece en los macrófagos y otros leucocitos. Estas células inmunes pueden ser activadas por manipulación excesiva y podrían afectar negativamente el injerto. En segundo lugar, injerto (islote-hidrogel mezcla) de carga también es fundamental. La persona que realiza el procedimiento debe evitar volúmenes muertos y toda la mezcla de hidrogel-islote debe cargar en el dispositivo de inyección. Inmediatamente después de este paso, otro punto crítico es la inyección de sí mismo. La inyección debe realizarse lentamente, con cuidado y con delicadeza. La jeringa debe expulsarse por el hidrogel vacío cargado inicialmente para recuperar cualquier resto islotes. En tercer lugar, la sutura debe realizarse con cuidado y en dos pasos. El plan muscular debe ser suturado en primer lugar, teniendo cuidado de no para suturar el epiplón con el músculo, y la piel debe ser suturada por separado. Con respecto al procedimiento de explantación para el injerto omental, debe tenerse especial atención en el momento cuando las arterias cerca del estómago (arterias gastroepiploica) son incisos. Es importante prestar atención a cualquier hemorragias que se producen y detenerlos antes de suturar el animal, como cualquier persistente sangrado lleva a muerte animal dentro de varios días.
Solución de problemas puede ser necesario en relación con el medio para llevar islotes; la elección de hidrogel es hasta el experimentador, como el hidrogel es inyectable. El uso de diferentes materiales puede resultar en variable del injerto función (con o sin suplementación, por ejemplo). El método descrito aquí ha demostrado su eficacia para co trasplante inertes con un ratio de islote de IEQ 7660/kg.
El presente método puede verse limitado por el tamaño omental y propiedades del hidrogel. Para utilizar un modelo de roedor diabético, tratamiento con insulina es obligatoria antes de la implantación de islotes pancreáticos para proporcionar suficiente área de injerto. Roedores diabéticos pierden mucho peso y masa grasa debido a la diabetes inducida por STZ. Teniendo en cuenta el peso pequeño de los animales inscritos en este estudio, no es posible injertar en una zona más pequeña aún.
Conservación de glicemia adecuada gestión (antes del trasplante utilizando pastillas y después de eso utilizando insulina de acción prolongada) es obligatorio. Aquí, hemos optado por conservar la pelotilla de insulina hasta el día del trasplante por varias razones. En primer lugar, el mantenimiento de un control glucémico adecuado reduce considerablemente el estrés oxidativo inducido por la diabetes en los órganos receptores, que puede ser deletérea para el islote injerto11 y permite la continuación de la terapia intensiva de insulina y receptor preparación en la clínica12. En segundo lugar, hemos querido limitar el número máximo de procedimientos de anestesia para las ratas. En cuanto a la aplicación de la terapia de insulina durante el seguimiento metabólico con insulina de acción prolongada, el esquema utilizado evita complicaciones masivas debido a glucotoxicity (que puede destruir los injertos) y para conservar un valor de glucemia "real".
Para supervisar la eficacia del injerto, glicemia no es un parámetro relevante en los primeros días si las ratas están recibiendo tratamiento con insulina con pellets. Por esta razón comprobar el nivel de péptido C varias veces previo al trasplante es obligatorio. Estos tiempos son en el inicio del estudio, para seleccionar los animales después de la inyección de STZ y luego justo antes del trasplante, para asegurarse de que las ratas siendo diabéticas y que la regeneración es mínima.
Propiedades del hidrogel también son importantes. Hidrogel líquido goteará fuera tejido omental e hidrogel altamente viscoso no inyectable. Inyectabilidad y viscosidad de hidrogel debe probarse antes de utilizarlo, pero parece esencial también probar el material directamente por la evaluación de islote u otra supervivencia de células in vitro. Aquí, como islotes son muy sensibles a la hipoxia y el uso de un portador muy viscoso puede afectar la difusión de oxígeno.
En cuanto a la importancia del método descrito aquí con respecto a los métodos existentes, esta técnica de trasplante de tejido intra tiene beneficios en términos de reproducibilidad. También es no traumática para el tejido y, por su ubicación extra vascular, evita los riesgos de sangrado y trombosis. También, cuando se considera el trasplante del islote, instantánea reacción inflamatoria mediada por la sangre es evitar14. Además, autoguiado hacia el blanco permite trasplantar islotes en un órgano no vital, a diferencia del trasplante en el hígado, lo que representa un riesgo en términos de función hepática15.
Para producir un rendimiento óptimo, un hidrogel tiene que ser adaptado a las células que va a llevar. Uso de factores de crecimiento o proteínas específicas puede tener un efecto positivo sobre las células trasplantadas16,17.
Para concluir, esta técnica puede utilizarse para la validación in vivo de un hidrogel en diversos tipos celulares, especialmente cuando es necesario un entorno metabólico activo, en cuanto a islotes. Además, esta técnica quirúrgica es aplicable a múltiples aplicaciones y puede ser en el futuro, rápidamente transferible a los humanos, como se puede realizar fácilmente mediante laparoscopia.

La terapia celular es un tema candente, como pretende curar enfermedades basadas en la medicina regenerativa. Terapias con células madre ayuda de material biológico se han estudiado cada vez más en los últimos años, sobre todo porque a menudo la implantación de la célula requiere un portador para la transferencia de las células de la placa de cultivo para el destinatario. Andamios biomateriales son portadores de células potencialmente valioso que cumplen varias funciones1. Una compañía competente debe proteger las células contra estrés mecánico y proporcionar condiciones favorables de crecimiento, como factores de crecimiento esenciales, excreción de desechos metabólica, el intercambio de sustancias nutrientes y oxígeno2.
Entre los diferentes tipos de biomateriales utilizados en terapia celular, los hidrogeles tienen muchas ventajas. Son biocompatible, biodegradable, fácil de manejar y facilitar la difusión de oxígeno3. Además, la tecnología actual permite el uso de hidrogeles para ayudar a las células sobrevivir y engraft con, por ejemplo, la suplementación con factores de crecimiento o proteínas de matriz extracelular4.
Portadores de hidrogel que contiene las células madre pueden ser inyectados como tratamientos, p. ej., hueso regeneración de enfermedad5 y sistema nervioso6. Es necesaria la implantación de las células metabólicamente activas. Mientras que in vitro validación del enfoque es posible, herramientas y técnicas para la validación en vivo siguen siendo ser refinado.
Trasplante de la célula y del hidrogel puede fácilmente llevarse a cabo por la inyección subcutánea cuando se realizan las pruebas de biocompatibilidad. Sin embargo, cuando las células injertadas se significan para regular factores sistémicos por su acción metabólica, esta localización subcutánea no es óptima, esencialmente en términos de drenaje venoso7. Por lo tanto, no hay ninguna corriente las herramientas de forma rápida, segura y eficaz evaluar los efectos beneficiosos de un hidrogel. El ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos, que exige que sea liberado de las hormonas en el torrente sanguíneo de la prótesis en respuesta a los niveles de glucosa en sangre, hemos desarrollado un nuevo método para la implantación de la célula/hidrogel en vivo.
El primer paso fue identificar un sitio del aceptador del trasplante, que puede aceptar un hidrogel con las células. El epiplón ofrece un gran espacio para la implantación, es muy plástico, y su vascularización densa combinada con el ajuste intraperitoneal es interesante para el estudio de las células con alta actividad metabólica8. A continuación necesitamos establecer una técnica quirúrgica que permite a la transferencia de las células y el hidrogel en el epiplón. Inspirado en el lipofilling utilizado en cirugía plástica9, desarrollamos el islote de matriz h-Omental (hOMING) enfoque de relleno. Islotes encajados hidrogel se inyectan en el tejido omental. La técnica también pretende proporcionar máxima engraftment utilizando múltiples deposiciones de la mezcla de células y el hidrogel en el tejido omental, donde la gran cantidad de vasos sanguíneos también mejora la oxigenación del injerto.
En el presente estudio, describimos una técnica sencilla e innovadora para la implantación de islotes entre hojas omentales, dentro del tejido de grasa más cercana a los vasos sanguíneos. Consiste en cirugía micro-invasiva, que podría ser terminada bajo laparoscopia, con la inyección de islotes dentro de un hidrogel en el tejido adiposo. Esta técnica es fácilmente aplicable a todas las combinaciones de hidrogel y de la célula que deben probarse en un en un ambiente metabólico funcional.

<table><tbody><tr><td>Alginato (PRONOVA UP LMV)Novamatrix</td><td></td> <td>4200206</td><td>Portador de hidrogel</td></tr><tr><td>Aguja atraumática (roma)</td><td>B.Braun</td><td></td> 9180109 <td></td></tr><tr><td>CMRL sin FBS</td><td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>Péptido C Kit ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>Sutura quirúrgica</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de insulina</td><td>Linshin</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Centravet</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>Lantus (Insulin-Glargin)</td><td>Sanofi Adventis</td><td>Lantus SoloStar</td><td>Insulina de acción prolongada</td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>MET019</td><td>Medicamento antiinflamatorio</td></tr><tr><td>NaCl (para solución salina al 0,9%)</td><td>Sigma</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 26 G</td><td>TERUMO</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>Linde</td><td>2010152</td><td>Para uso de isoflurano</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal</td><td>Para eutanasia</td></tr><tr><td>Steranios 2%</td><td>Anios</td><td>11764046</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozotocina</td><td>Santa-Cruz</td><td>SC-200719A Jeringa</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Trocar & estilete (linshin)</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>Para la inserción de pellets</td></tr></tbody></table>

trasplante de islotes intra-omental utilizando relleno de islote de matriz h-omental (homing)

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Medicina regenerativa basada en terapia celular representa una nueva esperanza para curar la enfermedad. Obstáculos actuales incluyen validación correcta en vivo de la eficacia de la terapia. Para la transferencia al cuerpo receptor, las células a menudo necesitan combinarse con biomateriales, especialmente los hidrogeles. Sin embargo, validación de la eficacia de tal injerto requiere el ambiente adecuado, el hidrogel derecha y el sitio derecho destinatario. El epiplón puede ser un sitio tan. Basado en el ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos, desarrollamos la técnica (llenado de matriz islote h-Omental) autoguiados hacia el blanco, que consiste en la inyección del injerto dentro del tejido, entre las capas omentales, para mejorar la supervivencia e implantación de islotes pancreáticos. Para lograr esto, islotes tienen que incluirse en un hidrogel con una viscosidad que permite su inyección con una aguja atraumática. Las jeringas están cargadas de una combinación de hidrogel e islotes. Se realizan varias inyecciones en el tejido omental en puntos de entrada diferentes, y la deposición de la mezcla de islote/hidrogel se hace a lo largo de una línea. Hemos probado la viabilidad de este enfoque innovador con perlas de dextrano. Los granos bien se extienden por todo el tejido omental, en proximidad cercana a los vasos sanguíneos. Para probar la eficacia del injerto, trasplantados islotes en ratas diabéticas y realizar un seguimiento metabólico más de dos meses. Los islotes trasplantados exhiben una alta tasa de re vascularización alrededor y dentro de islotes y revertir la diabetes. La recalada técnica podría ser aplicable a otros tipos de terapia de hidrogel o celular, de células con alta actividad metabólica.

El método de hOMING permite evitar la implantación intravascular y el confinamiento de islotes en un órgano. Un tiempo máximo de 8-10 minutos se requiere para el procedimiento de implantación de islote todo, incluyendo la anestesia, que una línea de tiempo comparable al clásico trasplante del hígado.
Para estudiar la forma islotes están distribuidos en el tejido omental, granos de dextran fueron trasplantados usando el método de hOMING (figura 2). Un día después de la implantación, las ratas fueron sacrificadas, y los tejidos omentales recuperaron para análisis histológico. Hematoxilina y eosina revelaron una distribución uniforme de los granos a lo largo del tejido (figura 2abajo a la derecha). Muy a menudo, los granos fueron cerca de los vasos sanguíneos y bien implantados en el tejido adiposo. Inmediatamente después de la implantación, se produce una reacción inflamatoria alrededor de los granos, dando por resultado cambio de tejido para anidar en los islotes en el tejido.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg"> Figura 2: Descripción de la recalada técnica grano distribución y a través del tejido omental un día después de la implantación. (A) ilustración de la técnica autoguiados hacia el blanco. Después de la exposición del órgano (A, izquierda), la mezcla de islote hidrogel (reemplazada aquí por granos de color azul dextrano para mejor visualización) fue cuidadosamente inyectada en el tejido con una aguja atraumática (un, centro). Implantado en el tejido son visible (A derecha). (B) hematoxilina y eosina de epiplón explantados 1 día después de la inyección de grano. Los granos se encuentran en el tejido con una distribución uniforme. Barra de escala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para validar esta técnica, se realizaron estudios isogénicas con las ratas de Lewis (n = 8). Las ratas diabéticas que recibieron trasplantes de islotes pancreáticos (equivalente a islote 7660, IEQ) por kg de peso corporal rata con autoguiado hacia el blanco fueron monitoreadas para glucemia y C peptidemia durante dos meses. Glucemia fue controlado por la implantación de la pelotilla de la insulina (como que la primera gota de glucemia que se observa en la Figura 3A). Función del injerto fue reflejada por glicemia de aproximadamente 2 g/L y C peptidemia &gt; 500 pM. Antes del trasplante, las ratas eran diabéticas (glucemia &gt; 5 g/L y C peptidemia &lt; 200 pM). Después de trasplante y recuperación de la pelotilla de insulina, normalización y mantenimiento de la glucemia se observó sólo 3 días post trasplante autoguiado hacia el blanco y se mantuvo hasta recuperación de injerto (p &lt; 0.05 en comparación con el pre-trasplante niveles). Después de la explantación omental, glicemia se levantó otra vez al nivel de antes del trasplante, atestiguando la funcionalidad de los islotes que fueron trasplantados por autoguiado hacia el blanco (Figura 3A). El patrón C peptidemia era exactamente lo contrario, con baja a niveles indetectables antes del injerto, seguido por un aumento y mantenimiento de este aumento en el nivel en el curso del estudio (p &lt; 0,05) y después de la explantación omental, un disminuir para pre-trasplante de niveles (figura 3B). El análisis del epiplón explanted por histología reveló islotes altamente re-vascularizados, probablemente como consecuencia de su proximidad a los vasos sanguíneos (figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg"> Figura 3: dos meses de seguimiento metabólico de ratas recibiendo evaluación autoguiado hacia el blanco y el injerto. Glucemia (A) medición y evaluación (B) C-peptide después de autoguiado hacia el blanco utilizando alginato como un portador de islote (Tx: trasplante y recuperación de la pelotilla de insulina; Explantación: Explantación del epiplón). Los injertos son funcionales, como se muestra por el mantenimiento de normoglycemia después de la recuperación de la pelotilla de insulina y aumentan peptidemia C después de la implantación de islotes pancreáticos. Las áreas sombreadas grises representan los valores mínimos y máximos registrados en cada momento. (C) hematoxilina y eosina de una sección omental después del trasplante de islotes pancreáticos mediante el método de hOMING. Islotes están bien integrados en el tejido dos meses después de la implantación sin ningún tejido fibrótico circundante. Los buques han crecido alrededor y dentro de islotes, como indican las flechas y así restauración completamente la función del islote. Morfología de los islotes parece también bien conservada. Barras de escala = 50 μm. (n = 8) (*p &lt; 0.05; ** p &lt; 0.01; *** p &lt; 0.001 determinado mediante análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas con la prueba de diferencia de significado honesta de Tukey como prueba post-hoc). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para la validación in vivo de terapia celular basada en hidrogel, ilustrada por el ejemplo del trasplante de islotes pancreáticos. Islote de matriz h-Omental (hOMING) implantación de relleno permite la implantación de una mezcla de células-hidrogel entre las capas omentales, cerca de los vasos sanguíneos, para maximizar el engraftment en un ambiente metabólico adecuado.

Trasplante de islotes intra-Omental utilizando relleno de islote de matriz h-Omental (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de la terapia celular, como, ¿se puede optimizar el trasplante de islotes mediante la técnica quirúrgica hOMING? Las principales ventajas de esta técnica son que es simple, rápida y sintonizable, y la validación de biomateriales también es muy rápida. La demostración visual de la colocación de la aguja es fundamental para garantizar una inyección adecuada de injerto dentro del omento, ya que una aguja colocada incorrectamente puede provocar fugas de islotes.Para inducir la diabetes, inyectar 75 miligramos por kilogramo de estreptozotocina intraperitonealmente en cada seis semanas de edad, 150 a 190 gramos Lewis rata receptora, y comprobar el estado de la diabetes por medición diaria de glucosa en sangre durante los primeros cuatro días después de la inyección. Cuando las ratas presentan una glucemia de más de dos gramos por litro, inyectar por vía subcutánea seis unidades de insulina de acción prolongada por día para prevenir las complicaciones de la diabetes y la pérdida de peso. Incluir ratas en la cohorte experimental cuando dos medidas del nivel de glucosa en sangre de la vena de cola son superiores a cuatro a cinco gramos por litro durante dos días consecutivos, con un nivel de péptido C bajo 200 picomolar.Para la implantación de pellets, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo en el animal receptor diabético anestesiado y limpie el cuello con yodo povidona. Afeitar el área de implantación y limpiar la piel expuesta con yodo povidona adicional. Después de tres minutos, esteriliza un pellets de insulina 1/2 en una solución de yodo de una a cinco povidona y usa un trocar calibre 16 para perforar la piel expuesta del cuello.A continuación, utilice la guía y la estilización para insertar los pellets y suturar la abertura con un solo punto. Limpie la puntada con más yodo de povidona y permita que la rata se recupere en una jaula con monitoreo y alimentos para evitar la hipoglucemia. Para medir la eficiencia de los pellets, medir la disminución de la glucemia cada semana durante un mes después de la implantación, incluyendo ratas en la cohorte experimental cuando se mantiene una medida del nivel de péptido C de la vena de cola bajo 200 picomolar a un mes después de la implantación de pellets de insulina.Para el llenado de islotes de matriz intra-omental, cuente el número de islotes aislados de ratas donantes sanas en equivalentes de islotes, y prepare un equivalente de 7.660 islotes por kilogramo de receptor en tubos individuales de 1,5 mililitros. Lavar cada alícuota con 500 microlitros de medio CMRL sin suero bovino fetal y resuspender los pellets de islotes en 150 microlitros de portador de hidrogel de alginato recién preparado por tubo con una mezcla cuidadosa antes de colocar los tubos sobre hielo. A continuación, cargue jeringas de un mililitro equipadas con una aguja atraumática del calibre 21 con 150 microlitros de alginato vacío sin volumen muerto, seguido de 150 microlitros de alginato más islotes.Coloque las jeringas sobre hielo y prepare el cuello del primer animal receptor como se acaba de demostrar. Usa un bisturí para hacer una incisión sobre la herida vieja y usa fórceps para eliminar los gránulos. Cierre la puntada con uno o dos puntos de puntada individuales y coloque la rata en la posición supina.Esterilice el área peritoneal y afeite. Usa un bisturí para crear una laparotomía de un centímetro y medio justo debajo del esternón. Coloque la gasa esterilizada húmeda alrededor de la incisión e identifique la almohadilla de grasa omental situada junto al estómago.Use fórceps para extraer suavemente la almohadilla de grasa de la cavidad peritoneal, extendiéndola sobre la gasa. Hidratar bien el tejido omental con dos mililitros de solución salina estéril precalentada de 37 grados Celsius, y, sosteniendo el tejido con pequeños fórceps curvos en una mano, penetrar el borde omental entre las capas omentales con la aguja de una jeringa cargada de islotes con la otra. Al insertar la aguja, asegúrese de que esté rodeada por una capa delgada de tejido omental antes de comenzar la inyección.Inserte la aguja por completo y comience lentamente a inyectar la preparación del islote mientras retrae la aguja para permitir que los islotes inyectados se propaguen por todo el tejido. Durante la inyección, retraiga la aguja hasta el borde de los tejidos, deteniendo la inyección cuando la aguja esté casi fuera. A continuación, espere cinco segundos antes de iniciar una nueva inyección en la siguiente ubicación.E inyectar otras tres a cuatro alícuotas como se ha demostrado. Cuando se haya dispensado todo el hidrogel, retire la aguja cuidadosamente para evitar la pérdida de los islotes inyectados, comprobando que los islotes no están agrupados en la jeringa al final de la inyección. Cuando se hayan entregado todos los islotes, hidrata el omento y la pared de la laparotomía antes de devolver cuidadosamente el tejido omental a la cavidad abdominal.Inyectar dos mililitros de solución salina estéril precalentó en la cavidad abdominal para rehidratar la rata. A continuación, cierre la pared muscular con una sutura de hilo continua y coser la capa cutánea con un solo punto de puntada. Después de uno a dos meses de seguimiento metabólico, abra la incisión quirúrgica de cada receptor como se ha demostrado, y utilice fórceps para esparcir cuidadosamente la omenta sobre trozos de gasa empapados en solución salina dispuestas junto a las incisiones.A partir de la región adherente a la cola pancreática, utilice tijeras para extirpar el tejido omental e inyecte dos mililitros de solución salina precalentada antes de cerrar cada animal como se ha demostrado. Arreglar el omenta recuperado en 4%paraformaldehído antes de incrustar en parafina. Luego, adquirir secciones de cuatro micrómetros de espesor de los tejidos en un microtoma y aplicar hematoxilina y tinción de eosina para la evaluación morfológica de los trasplantes.Las perlas de dextrán trasplantadas utilizando el método hOMING como se demostró se observaron con frecuencia cerca de los vasos sanguíneos y se implantaron bien dentro del tejido graso. En este estudio isogénico representativo, la glucemia se controló primero mediante la implantación de un pellets de insulina 1/2 como se demostró y luego por islotes implantados como lo demuestra una glucemia de aproximadamente dos gramos por litro y una C-peptidemia superior a 500 picomolar en los animales receptores. Además, el análisis histológico de la omenta explantada reveló islotes altamente revascularizados, probablemente como resultado de su proximidad a los vasos sanguíneos.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la terapia celular exploraran el microambiente celular bioingeniero en modelos preclínicos.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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