Name: Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Aprende a evaluar la integridad de uniones estrechas en modelos celulares de la barrera hematoencefálica humana utilizando el ensayo de fluorescencia con Lucifer Yellow. Este método rápido permite calcular la permeabilidad aparente en monocapas hCMEC/D3.

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Los autores están agradecidos por el apoyo financiero del Premio Nuevo Investigador 2017 de la Asociación Americana de Farmacia, un premio Hunkele Dreaded Disease de la Universidad Duquesne y la Escuela de Fondos de Inicio de Farmacia para el laboratorio Manickam. Nos gustaría agradecer al laboratorio Leak (Universidad de Duquesne) por la asistencia de la hincha occidental y la autorización del uso de su imagen de 16 bits de Odyssey. También nos gustaría incluir una nota especial de agradecimiento para Kandarp Dave (laboratorio Manickam) para obtener ayuda con la hincha occidental.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Un papel clave del BBB es prevenir el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas entre la circulación sistémica y el cerebro para mantener la hemostasis del microambiente neural. Una de las características características del BBB es la capacidad de las células endoteliales capilares para formar uniones estrechas (TJ) que sellan eficazmente la ruta paracelular de transporte. Demostramos un ensayo deaplicación LY P como un método cuantitativo para determinar la cinética aparente de la formación de b...

La barrera hematoencefálica (BBB) es la barrera protectora que limita la afluencia de componentes plasmáticos en el tejido cerebral y consiste en células endoteliales cerebrales junto con células de apoyo como los pericitas. El papel principal de BBB es servir como barrera que sella el espacio entre la sangre periférica y elsistema nervioso central (SNC) para mantener la hemostasis del microambiente neural 1,2. Las células endoteliales capilares cerebrales sellan eficazmente la vía paracelular a través de la formación de uniones estrechas intercelulares (TJ)1. Esta barrera protectora permite que la glucosa y los nutrientes seleccionados entren en el cerebro mientras evita que la mayoría de los iones, sustancias tóxicas y drogas pasen a través de esta barrera apretada. Aparte de su función protectora, la función de barrera natural del BBB plantea un grave desafío en el desarrollo de sistemas de administración de medicamentos dirigidos al SNC.
Los modelos de cultivo celular in vitro del BBB son herramientas útiles para estudiar su biología y comprender los efectos del tratamiento farmacológico en la integridad de la barrera TJ. Utilizamos la línea celular endotelial microvascular humana (hCMEC/D3) como modelo in vitro ya que es un modelo aceptado de endotelio cerebral humano3 y recapitula muchas funciones de la BBB humana. hCMEC/D3 es una de las líneas celulares más utilizadas para modelar el BBB in vitro4,5,6,7,8,9. A pesar de sus valores comparativamente bajos de resistencia eléctrica transendotelial (TEER), una medida de la estanqueidad de las barreras, esta línea celular conserva la mayoría de las propiedades morfológicas y funcionales de las células endoteliales cerebrales, incluso como monocultivo en ausencia de células gliales cocultivadas6,7. La línea celular hCMEC/D3 expresa múltiples marcadores BBB incluyendo transportadores y receptores activos hasta aproximadamente el paso 35 sin someterse a desdiferencia a fenotipos inestables6,7,9 ,10,11. La característica más llamativa de la línea celular hCMEC/D3 como modeloBBB in vitro es su capacidad para formar TJs 5,9,11,12. Cabe señalar que aunque los modelos BBB derivados de células madre mostraron una mayor permeabilidad en muchos estudios en comparación con la línea celular hCMEC/D3 y expresan algunos marcadores BBB, todavía no han evolucionado como el modelo de células BBB más común13. Es importante destacar que los modelos BBB derivados de células madre siguen siendo caracterizados con respecto a los números máximos de pasaje que permiten a las células mantener fenotipos BBB estables14.
Tres métodos primarios se utilizan comúnmente para determinar la integridad de la barrera TJ, incluyendo la medición del TEER, la medición del coeficiente de permeabilidad aparente(aplicaciónP) de pequeñas moléculas de trazador hidrófilo como sacarosa, inulina, Lucifer Yellow, etc. e inmunomanchación de marcadores moleculares conocidos de TJs como claudin-5, ZO-1, occludin, etc.5. TEER es un método relativamente simple y cuantitativo que mide la resistenciaeléctrica a través de las monocapas celulares cultivadas en un sustrato de membrana porosa 5. Sin embargo, los valores TEER pueden verse influenciados por variables experimentales como la composición del medio de cultivo y el tipo de instrumento de medición. Una combinación probable de estos factores conduce a una amplia distribución de los valores TEER que van de 2 a 1150 cm2 en la línea celular hCMEC/D3 cultivada durante 2-21 días13. La inmunomancha es un método visual para determinar la presencia de proteínas TJ mediante el etiquetado de la proteína objetivo utilizando anticuerpos. Sin embargo, la inmunomancha implica una serie de pasos experimentales, incluyendo la necesidad de fijar/permeabilizar las células que pueden resultar en artefactos experimentales y las señales fluorescentes pueden desvanecerse con el tiempo. Los factores anteriores pueden dar lugar a errores subjetivos que afectan a la calidad de los datos.
El enfoque principal de este trabajo es presentar un ensayo de permeabilidad aparente basado en LY determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas. Aunque otros sistemas avanzados de BBB in vitro, como los sistemas de cocultivo, los sistemas microfluídicos, son imitaciones fisiológicamente más relevantes con una función de barrera significativamente mejorada15,16,17, el hCMEC/D3 configuración de transwell es un modelo simple y confiable para estimar la cinética de la formación de TJ y examinar rápidamente el efecto de diferentes formulaciones de fármacos en la función de barrera. En general, los valores de laaplicación P son consistentes para varios solutos hidrófilos en monócapas hCMEC/D3. Por ejemplo, los valores deaplicación P reportados para varios solutos de baja masa molecular (como sacarosa, manitol, LY, etc.) en diferentes modelos BBB in vitro están en el orden de 10-4 cm/min 5,18,19 , 20. En nuestra configuración experimental, las células endoteliales cerebrales se sembran en una membrana microporosa recubierta de colágeno para la unión celular y la formación de monocapa para imitar la barrera in vivo. Se espera que el LY añadido en el lado apical atraviese las uniones estrechas intercelulares y se acumule en el lado basolateral. Las mayores concentraciones de LY en el lado basolateral indican una barrera inmadura, no completamente funcional, mientras que las concentraciones más bajas reflejan el transporte restringido debido a la presencia de TJs funcionales que resultan en una barrera madura.
LY es un tinte hidrófilo con picos de excitación/emisión distintos y evita la necesidad de radioetiquetar moléculas trazadoras como sacarosa, manitol o inulina. Por lo tanto, los valores de fluorescencia de LY se pueden utilizar para calcular directamente su permeabilidad paracelular a través de las monocapas BBB. Además, en comparación con muchos tintes disponibles comercialmente utilizados en campos biomédicos que sufren de pequeños cambios Stokes como fluoresceína21, el desplazamiento Stokes de LY es de aproximadamente 108 nm con suficiente separación espectral, permitiendo así datos de fluorescencia LY como lectura robusta para determinar la permeabilidad paracelular. Usamos la hincha occidental como una técnica ortogonal para demostrar los cambios en la expresión de la proteína marcador de unión apretada, ZO-1, durante el tiempo de cultivo. La expresión ZO-1 detectada a través de la hincha occidental se utiliza para complementar los datos de laaplicación LY P y, en combinación, estos datos sugieren que los cambios observados en los valores de laaplicación LY P reflejan la formación de una monocapa con aumento gradual en expresión del marcador de unión estrecha, ZO-1.
Como se señaló anteriormente, el enfoque central de este trabajo es demostrar un ensayo LY como una técnica simple para monitorear la formación de una monocapa confluente con uniones estrechas funcionales. Sin embargo, para demostrar una utilidad adicional del ensayo desarrollado, medimos laaplicación LY P en monócapas hCMEC/D3 transfectó nanopartículas de ADN. Los ácidos nucleicos se pueden condensar en nanopartículas de polielectrolitos con un diámetro de 100-200 nm mediante interacción electrostática entre los grupos de polímeros cargados positivamente y los grupos fosfatos cargados negativamente de ácidos nucleicos22, 23. Nos referimos a estos complejos como nanopartículas de ADN (NPs de ADN) en nuestro trabajo. Si bien nuestra intención es transfectar las células y expresar la proteína deseada, debemos asegurarnos de que las propiedades de barrera de las monocapas hCMEC/D3 no se vean comprometidas. Nuestros datos sugieren que un régimen estándar de transfección del gen luciferasa de 4 h no cambia mediblemente la permeabilidad LY que demuestra la utilidad del ensayo de laaplicación LY P para determinar los cambios en la integridad de la barrera TJ.

<table><tbody><tr><td>Línea celular hCMEC/D3</td><td>Cedarlane Laboratories</td><td>102114.3C-P25</td><td>línea celular endotelial microvascular cerebral humana&nbsp;</td></tr><tr><td>gWizLuc</td><td>Aldevron&nbsp;</td><td>5000-5001</td><td>ADN plasmídico que codifica el gen de la luciferasa,</td></tr><tr><td>lucifer, amarillo, CH, sal de dilitio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>155267</td><td></td></tr><tr><td>Insertos Transwell con membranas grabadas con trazas de tereftalato de polietileno (PET)</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-207</td><td></td></tr> Fondo <tr><td>plano de 24 pocillos&nbsp;</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Placas inmunológicas negras de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>437111</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM 1X</td><td>Gibco</td><td>1951695</td><td>Spinner - medio esencial mínimo (S-MEM)</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Clonetics</td><td>CC-3156</td><td>Medio basal de células endoteliales-2 (EBM-2) &nbsp;</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato 1X</td><td>HyClone</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I&nbsp;</td><td>Discovery Labware, Inc.</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de lisis de cultivo celular 5X&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1531</td><td></td></tr><tr><td>Escarabajo Luciferina, Sal de Potasio&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E1601</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3&nbsp;</td><td>Lector de placas de fluorescencia</td>de <td>Molecular Devices</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal ZO-1 &nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-GAPDH</td><td>abcam</td><td>ab8245</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor680-conjugado AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>128817</td><td></td></tr><tr><td>12 pocillos, fondo plano</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-106</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RIPA (5X)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62524</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2503-10</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes Odyssey CLx</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>para el escaneo de membranas de Western blot</td></tr></tbody></table>

lucifer yellow - un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

La barrera hematoencefálica BBB consiste en células endoteliales que forman una barrera entre la circulación sistémica y el cerebro para evitar el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas. Las uniones estrechas (TJ) sellan eficazmente el espacio paracelular en las monocapas, lo que resulta en una barrera intacta. Este estudio describe un ensayo de fluorescencia basado en LY que sepuede utilizar para determinar su coeficiente de permeabilidad aparente (aplicación P) y a su vez se puede utilizar para determinar la cinética de la formación de monocapas confluentes y la unión estrecha resultante integridad de barrera en las monocapas hCMEC/D3. Demostramos además una utilidad adicional de este ensayo para determinar la integridad funcional de TJ en células transinfectadas. Nuestros datos del ensayo de laaplicación LY P muestran que las células hCMEC/D3 sembradas en una configuración transwell limitan efectivamente el transporte paracelular LY 7 días de cultivo. Como utilidad adicional del ensayo presentado, también demostramos que la transfección de nanopartículas de ADN no altera el transporte paracelular LY en monocapas hCMEC/D3.

En primer lugar, determinamos el efecto del tiempo de cultivo en la permeabilidad LY para determinar la cinética aparente de la formación de TJ. Los valores medios de laaplicación LY P del día 1 a 10 post de la sesión se muestran en la Figura 2a. En el día 1, laaplicación P media era de 4,25 x 10-4 cm/min y cayó ligeramente a 3,32 x 10-4 cm/min el día 2. El valor medio de laaplicación P aumentó ligerament...

Presentamos un ensayo de fluorescencia para demostrar que Lucifer Yellow (LY) es un marcador robusto para determinar la aparente permeabilidad paracelular de las monocapas celulares hCMEC/D3, un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Usamos este ensayo para determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas.

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Este protocolo es una técnica robusta para determinar la integridad funcional de las uniones estrechas intercelulares en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana. Este es un protocolo simple y bastante barato que permite calcular la permeabilidad aparente en un período de tiempo más corto en lugar de ejecutar un ensayo cinético más largo. Este método también se puede utilizar para determinar la integridad funcional de las uniones estrechas en las células endoteliales cerebrales transfectónicas con nanopartículas de ADN de polímero.Para comenzar el enchapado celular, coloque inserciones de cultivo de tejido con membranas microporosas en una placa de cultivo de 24 pozos. Añadir 400 microlitros de 0,15 miligramos por mililitro de colágeno tipo uno en cada inserción de cultivo tisular. Luego incubar durante una hora en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius, 5%.Mece suavemente la placa de 24 pozos para permitir la propagación uniforme de la solución de colágeno sobre la membrana microporosa en los insertos de cultivo de tejido. Después de una hora, retire la solución de colágeno y lave suavemente la membrana microporosa con 0,4 mililitros de tampón 1X

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Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.

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Aprende a evaluar la integridad de uniones estrechas en modelos celulares de la barrera hematoencefálica humana utilizando el ensayo de fluorescencia con Lucifer Yellow. Este método rápido permite calcular la permeabilidad aparente en monocapas hCMEC/D3.

Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

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