Name: Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprende a utilizar el sistema PIVEC para exposiciones portátiles de aerosoles en cultivos celulares de interfase aire-líquido. Este método permite evaluar respuestas celulares, estrés oxidativo y citotoxicidad en ubicaciones de muestreo inaccesibles.

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Los autores desean agradecer a Boris Solomonov y la tienda de máquina de innovación de Virginia Commonwealth para ayuda con el prototipado rápido el dispositivo. Los autores también desean agradecer a Cristian Romero-Fuentes del grupo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov y el Virginia Commonwealth nanomateriales caracterización instalaciones centrales para su ayuda con la caracterización de partículas. Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque a Dr. Lewinski por la Facultad de ingeniería en Virginia Commonwealth University.

Los operadores deben usar equipo de protección personal (bata, guantes, gafas) cuando realice los pasos 1, 2, 3, 5 y 6.
1. preparación de materiales
<ol><li>
Preparar materiales para sistema de montaje y exposición para asegurar repetibilidad.
	<ol>
<li>Asegúrese de que uso nuevo o etanol al 70% limpia ¼" diámetro interno conductora tubería y ¼" diámetro exterior conectores para el conjunto del sistema.</li>
		<li>Almacén materiales de prueba incluyendo filtros, componentes PIVEC, pinzas y polvos de partículas en un entorno bien controlado, con respecto a la temperatura y la humedad, durante al menos 24 h antes del experimento. Nota: La temperatura debe estar cerca de temperatura ambiente, aproximadamente 20 ° C, con humedad relativa inferior al 35%. Esto es muy importante para lograr la repetibilidad entre experimentos.</li>
		<li>Preparar contadores de partículas usando isopropanol para limpiar las piezas y permite el calentamiento del sistema según las recomendaciones del fabricante, incluyendo el medidor de partículas de exploración movilidad (SMPS) y sizer de partículas óptico (OPS) para la medición.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generación de Aerosol seco
Nota: Los operadores deben realizar generación de aerosol en una campana de humos.
<ol><li>
Montar un sistema para generar aerosoles secos Nota: La suspensión de partículas en el gas o líquido debe ser apropiada para la cultura de célula y aplicación modelada. El siguiente método se puede realizar utilizando un aerosol de base líquida. El diseño del sistema de aerosol seco es de Tiwari et al. 37 un esquema del sistema de dispersión seca se muestra en la figura 1.<ol>
<li>Conectar la válvula de bola en cada extremo de la tubería de 4" 1/8 de tamaño de rosca, esto servirá como la tolva de la partícula. Conecte 2" 1/8 tamaño de tubería a una válvula.</li>
		<li>Pesar de nanopartículas de cobre, en este estudio la concentración en masa para cada tamaño de partícula se mantuvo constante al determinar la eficiencia de deposición. Utilice aproximadamente 7,5 mg de 40 nm cobre nanopartículas, 7 mg de 100 nm cobre nanopartículas y 13 mg de nanopartículas de cobre nm 800 por exposición. Colocar nanopartículas de cobre en la tolva de la partícula a través del extremo abierto. Nota: La cantidad de nanopartículas de cobre pesadas será la masa base concentración administrada.</li>
		<li>Coloque 3" ½" tubo de diámetro exterior (OD) alrededor de la tubería de 2" y el lugar un HEPA Filtro interior de este tubo corto que la dirección del flujo es a través de la válvula de bola.</li>
		<li>Conecte el generador de vacío a otra válvula de bola con rosca. Conecte el generador de vacío al tanque de aire colocando un tubo 5/16" OD en la conexión de la cerradura del empuje. Use ¼" OD de tubería para conectar la salida del generador de vacío para el montaje experimental mediante la colocación de la tubería sobre la salida del generador de vacío.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uso del sistema de aerosol seco para generar aerosol seco
	<ol>
<li>Abrir el tanque de aire girando la válvula principal y permitir el flujo de aire al sistema. Abra la válvula en el regulador de flujo en el tanque de aire y establecer de forma que el flujo a través del sistema es equivalente a la configuración deseada de la bomba de vacío.</li>
		<li>La válvula de bola más cercana al filtro HEPA y abra la válvula de bola más cercana al generador de vacío. Mantener estas abierto para aproximadamente 3 s para permitir que las partículas se tiró en la corriente de aire.</li>
		<li>Cierre la válvula de bola más cercana para generador de vacío y luego cierre la válvula de bola más cercana al filtro HEPA. Permitir que el aire desde el tanque de flujo para la duración del experimento según sea necesario.</li>
		<li>Cerrar las válvulas principal y regulador en el tanque de aire para detener el flujo. Limpia las válvulas de bola y generador de vacío con etanol al 70%. Tubos de metal de autoclave para la esterilización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. deposición eficiencia medición PIVEC
Nota: Los operadores deben realizar exposiciones de aerosol en una campana de humos.
<ol><li>Medir la deposición por recoger los aerosoles de nanopartículas de cobre generado en el paso 2.2 de un filtro previamente tarado. Utilizar la dosis depositada, con la masa recogida en el filtro y la dosis administrada, con la cantidad de partículas de cobre pesadas, para determinar la eficiencia de deposición.<ol>
<li>Mantener filtros fibra vidrio 1,00 μm de poro bajo condiciones de baja humedad, descritos en 1.1.2, durante al menos 24 h antes de las medidas pre-exposición. Pesar un filtro sin usar tres veces y registrar los pesos de los filtros. Introduzca el lugar del filtro sin usar en un cultivo celular.</li>
		<li>Elegir el celular adecuado cultura insertar adaptador (bueno 6 o bien 24) para PIVEC apoyar la inserción de la cultura de célula con el filtro. Lugar cultivo celular Inserte adaptador en la parte superior de la base de PIVEC, puesta en lugar tal que la base de la pieza de adaptador es más ancha que la parte superior.</li>
		<li>Pinzas de uso para cultivo celular de filtro cargado Inserte dentro de pieza del adaptador. Coloque la pieza superior sobre la pieza de adaptador, colocar en su lugar que la base de la pieza superior es más ancha que la parte superior. Envuelva PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva.</li>
		<li>Conectar piezas de cassette de 37 mm en la parte superior e inferior de PIVEC empujándolo a su lugar. Coloque un ¼" púas adaptadores de salida y entrada de cassette.</li>
		<li>Envuelva el calentador resistivo alrededor PIVEC tal que los cables están en la base. Cinta para asegurar.</li>
		<li>Envuelva PIVEC con 8 rondas de papel de aluminio para aislamiento. Asegure con cinta.</li>
		<li>Conectar 2" pedazo largo de 1/2" diámetro exterior tubería flexible para el adaptador en la parte superior PIVEC. Quite la tubería porosa del lugar dentro de la tubería en la parte superior PIVEC y agua estéril.</li>
		<li>PIVEC de lugar dentro de la abrazadera en el soporte de anillo y seguro. Montaje completo con bomba de vacío, contadores de partículas y configuración de aerosol. Nota: Se puede determinar la dosis depositada basados en número sólo si los contadores de partículas se colocan antes el PIVEC y después PIVEC en carreras separadas.</li>
		<li>Exponer los filtros usando paso 2.2 del protocolo y deseado de las tasas de flujo y tiempo de exposición, en este estudio que se utilizó un tiempo de exposición de 10 min a 0,5 LPM. Quitar PIVEC de la instalación. Saque el inserto de la cultura de célula y el filtro expuesto en soporte del filtro en condiciones de baja humedad durante al menos 24 h antes de las mediciones.</li>
		<li>PIVEC limpia con etanol al 70%. Esterilización con luz ultravioleta por lo menos 30 minutos antes del siguiente experimento.</li>
		<li>Pesar el filtro expuesto tres veces y registrar los pesos de los filtros. Coloque el filtro expuesto en un portafiltros etiquetados para el almacenamiento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cálculo de la dosis depositada y la eficiencia de deposición
Nota: El conocimiento de la deposición es importante para administración de aerosol y la interpretación de la respuesta celular.
<ol><li>
Calcular la deposición de medidas basadas en la masa
	<ol>
<li>Calcule la masa depositada en los filtros como la diferencia entre el peso promedio antes de la exposición y el peso promedio posterior a la exposición. Este valor es la dosis depositada en base masa para el experimento.</li>
		<li>Uso administrado masa, madmin, y masas depositaron dosis determinada en 4.1.1, mdep, para calcular la eficiencia de deposición basado en la masa, ηm, para el experimento. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq1.jpg">
</li>
		<li>Valores promedio del 4.1.1 y 4.1.2 para por lo menos 3 experimentos determinar la deposición y la eficiencia de deposición para PIVEC de tamaño de partícula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcular la deposición de medidas basadas en el número
	<ol>
<li>Asegurar que se han realizado mediciones con contadores de partículas con contadores después la PIVEC y para determinar la concentración de partículas antes de la PIVEC. Integrar la concentración de partículas en el tiempo para el contador de la partícula entonces integrar sobre el diámetro de la partícula para determinar el total de partículas medidas.</li>
		<li>Calcular el número de la partícula depositada como la diferencia entre las partículas administradas y el post-PIVEC de partículas medidas. Este valor es la dosis depositada número-basado para el experimento.</li>
		<li>Uso administrado las partículas, nadmin, basado en el número depositadas dosis, ndep, flujo volumétrico, V y el tiempo, t, para calcular la eficacia de deposición basada en número, ηn, para el experimento. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq2.jpg">
</li>
		<li>Valores promedio de 4.2.2 y 4.2.3 para por lo menos 3 experimentos determinar la deposición y la eficiencia de deposición para PIVEC de tamaño de partícula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. aerosol exposición de las células
Nota: Para la célula cultura en la interfase aire-líquido al lector se denomina blanco et al. 38 los operadores deben realizar inserción de cultura celular carga (medidas 5.1.2-5.1.4) dentro de un gabinete de bioseguridad. Los operadores deben realizar exposiciones de aerosol en una campana de humos.
<ol><li>
Células en cultivo en la interfase aire-líquido
	<ol>
<li>Levantar las células A549 frasco de cultivo mediante la adición de tripsina-EDTA 3 mL para un frasco de T75 o 1 mL para un frasco de T25 e incubar 5 min a 37 ° C. Agregar 7 mL de medio completo para un matraz T75 o 4 mL de medio completo para que un T25 frasco a frasco y enjuague frasco pared con suspensión maximizar el número de células recuperadas. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril y centrifugar las células a 800 x g durante 3 minutos.</li>
		<li>Retire el sobrenadante que contiene tripsina-EDTA y resuspender el precipitado de células en 10 mL de medio completo. Extraiga 10 μl de suspensión celular y añadir al hemocitómetro. Contar las células utilizando un hemocitómetro para determinar la concentración y el número total de células.</li>
		<li>Colocar 0,5 mL de medio completo para cada bien dentro de una placa bien 24. Lugar sin usar de la célula cultura insertos en los pozos. Cultivo de células de la semilla se inserta en el lado apical en una densidad de célula cerca de 1 x 105 células/cm2 para los tipos de células que crecen a un ritmo cerca de duplicar por día. A semilla A549 células dentro de 24 bien insertar, insertar células de semilla con una densidad de 1 x 105 células/cm2 agregando 35.000 células al cultivo celular. Nota: Las células con una tasa de crecimiento más lenta pueden ser sembradas a una densidad creciente de la célula.</li>
		<li>Añadir media completa en el lado apical de la célula cultura inserto para alcanzar el volumen final (para 24 volumen final del pozo de la placa es 0.25 mL).</li>
		<li>Cultura para 7 días en condiciones sumergidas, reemplazando a los medios de comunicación cada 1-2 días. Después de 7 días, retire la media apical y la cultura para al menos 1 día en condiciones de ALI, reemplazar sólo los medios de comunicación basolateral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montar PIVEC
	<ol>
<li>Permitir que las células alcancen la interfaz aire-líquido durante al menos 24 h antes de la exposición.</li>
		<li>Elegir celda apropiada cultura Inserte adaptador para PIVEC apoyar la inserción de la cultura de célula con el filtro. Cultivo de células de lugar Inserte adaptador encima PIVEC base, puesta en lugar tal que la base de la pieza de adaptador es más ancha que la parte superior. Añadir 4 mL de medio de cultivo celular para el bien de la base de la PIVEC.</li>
		<li>Pinzas de uso para el cultivo celular insertar dentro pieza adaptador colocado en el paso 5.2.3. Coloque la pieza superior sobre la pieza de adaptador, colocar en su lugar que la base de la pieza superior es más ancha que la parte superior. Cuidadosamente Envuelva PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva.</li>
		<li>Conectar piezas de cassette de 37 mm en la parte superior e inferior de PIVEC, empujándolo a su lugar. Coloque un ¼" púas adaptadores de salida y entrada de cassette.</li>
		<li>Envuelva el calentador resistivo alrededor PIVEC tal que los cables están en la base. Cinta para asegurar.</li>
		<li>Envuelva PIVEC con 8 rondas de papel de aluminio para aislamiento. Asegure con cinta.</li>
		<li>Conectarse el adaptador en la parte superior PIVEC a pedazo corto de tubería flexible de 1/2" de diámetro exterior. Quite la tubería porosa del lugar dentro de la tubería en la parte superior PIVEC y agua estéril.</li>
		<li>PIVEC de lugar dentro de la abrazadera en el soporte de anillo y seguro. Completar la instalación con la bomba de vacío y el ajuste de aerosol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Exponer las células a ALI con el PIVEC
	<ol>
<li>Eficiencia de deposición determinada en el paso 2 del uso para calcular la masa de las partículas a ser aerosolized. Pesar la masa adecuada y añadir al sistema de aerosol siguiente paso 2 dentro de la campana.</li>
		<li>Exponer las células siguiendo el paso 2.2, en este estudio de criterios de valoración biológicos las células fueron expuestas a aproximadamente 3,5 mg de nanopartículas de cobre con un caudal de 0,5 LPM y una duración de exposición de 10 minutos estudios de Control realizados utiliza aire humidificado para determinar la influencia del aire solamente. Quitar PIVEC de la instalación. Saque el inserto de la cultura de célula, colocar en la placa de la pozo estéril y vuelva a la incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2, 90% HR).</li>
		<li>Medios de comunicación de PIVEC de aspirar. Si realizar experimentos adicionales, Fondo de enjuague de PIVEC con fosfato tamponada con solución a continuación, repita el paso 5.1 y 5.2.</li>
		<li>PIVEC limpia con etanol al 70% cuando haya terminado. Esterilización con luz ultravioleta por lo menos 30 minutos antes del siguiente experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimientos de ensayo biológico Nota: Ensayos realizados en este estudio fueron la generación de estrés oxidativo mediante el ensayo de DCFH-DA y la citotoxicidad a través de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).<ol>
<li>Disolver 24,4 mg de DCFH-DA en 50 mL de metanol a 1 mM DCFH-DA solución. Esta solución puede conservarse a-20 ° C hasta 4 meses. Diluir 1 mM solución DCFH-DA mediante la mezcla de 0,1 mL de 1 mM DCFH-DA solución con 9,9 mL HBSS para realizar 10 mL de 10 μm DCFH-DA.</li>
		<li>Quite la célula medios de cultivo y lavado celular cultura inserto con aproximadamente 1 mL de PBS. Añadir 0,5 mL de 10 μm DCFH-DA solución a cada pocillo, sustitución de insertos cuando haya terminado. Cubra la placa con papel de aluminio para evitar la fotoactivación de colorante y volver a incubadora de 37° C durante 1 hora.</li>
		<li>Eliminar las células de la incubadora y aspirar la solución de trabajo DCFH-DA de los pozos. Añadir 0.5 mL HBSS a pozos y reemplazar la célula cultura insertos.</li>
		<li>La placa de la pozo de carga en placa lector y medida basal de la fluorescencia usando longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm. Retire la placa placa lector y carga insertar en PIVEC para exposición.</li>
		<li>Exponer a las células para la duración de la exposición deseada. Quitar relleno del PIVEC y regresar a la placa de la pozo. Quitar 50 μl del líquido basolateral del placa de la pozo y en la placa bien blanco 96. Medir la fluorescencia de DCF usando longitudes de onda de excitación/emisión de 485/530 nm cada 30 min posterior a la exposición durante 2 h.</li>
		<li>Que basolateral líquido alcancen la temperatura ambiente durante 20-30 minutos añadir 50 μl de solución de ensayo LDH mezcla siguiente protocolo del fabricante, a basolateral el fluido de la placa de la pozo y dejar reaccionar durante 10 minutos añadir 25 μl de solución de parada a. Leer la fluorescencia de resorufin producto, utilizando longitudes de onda de excitación/emisión de 560/590 nm.</li>
		<li>Extraer el líquido adicional basolateral y repita paso 5.4.6 en 4 h y 24 h post-exposición.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 métodos estadísticos
<ol><li>Análisis de los datos de ensayo biológico<ol>
<li>Informe producción de ROS como el aumento de la intensidad de fluorescencia de células tratadas con respecto a las mediciones de línea base. Informe de actividad LDH como el aumento de la intensidad de fluorescencia de células tratadas con respecto a las células no tratadas.</li>
		<li>Realizar solo factor ANOVA para determinar diferencias estadísticas entre los conjuntos de datos. En su caso, realizar estudiante t-pruebas en un valor de significación de 0.05. Informe datos como la media ± desviación estándar de al menos tres mediciones de la exposición.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

La afiliación de los autores es como se muestra en la portada. Los autores son apoyados financieramente por Virginia Commonwealth University, donde el trabajo fue terminado en Richmond, Virginia. Los autores tienen la responsabilidad de la escritura y el contenido de este documento. Los autores declaran que no hay ningún intereses en competencia.

Cartuchos del filtro proporcionan un método simple y económico de la recogida de aerosoles en la zona de respiración; sin embargo, muestras de aerosol extraídas de los filtros representan la entera del aerosol (es decir, gases volátiles y partículas) y por lo tanto limitar la evaluación de efectos biológicos relacionados. Utilizando el diseño inicial del cartucho de filtro de 37 mm, el PIVEC está diseñado para mantener la portabilidad y mímico en vivo la deposición de partículas de la inhalación. El PIVEC es sig...

Muestreo personal de vitro técnicas podría proporcionar información completa sobre los efectos biológicos de los aerosoles en el lugar de trabajo. 1 exposición a contaminantes en el aire incluye exposición a producto químico sí mismo, a las muestras de aire recogidas en condiciones sumergidas, donde el gas se introduce a la suspensión de células, exposición intermitente utilizando un dispositivo como un balancín, o en la exposiciones en la interfase aire-líquido (ALI). 2 muchas de estas técnicas se realizan con células cultivadas en suspensión o en la recogida de muestras antes de la exposición, cada una de ellas puede afectar el estudio toxicológico debido a posibles cambios en el aerosol. 3 para evitar estos cambios, el laboratorio puede ser traído al campo, utilizando varios en vitro ALI exposición los sistemas de cultivo que se utilizan en la literatura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 sin embargo, pocos están comercialmente disponibles. 8 , 9 , 12 estos sistemas suelen ser voluminosos, especialmente cuando se incluye instrumentos para regular la temperatura y la humedad del ambiente celular y el flujo del aerosol de la muestra. Usando el PIVEC, exposiciones de aerosol pueden realizarse fuera de un entorno de laboratorio tradicional o dentro de la zona de respiración mientras que mímico las condiciones de la inhalación.
La determinación de la deposición de aerosoles en vitro es importante a la investigación de efectos sobre la salud debido a la inhalación. La zona de respiración, el área dentro de los 30 cm de la boca y la nariz,14 es crucial para la comprensión de la exposición a las nanopartículas y para vincular a los efectos biológicos en los pulmones. 2 a menudo, la deposición en las células se define como una eficiencia de deposición, las partículas deposita en y tomado por las células que se dividen las partículas administrada al sistema6,15 o en una base total de la misma cantidad. 4 , 16 los métodos actuales para la medición de aerosoles en la zona de respiración son filtro base, capturando las partículas durante un período de muestreo dado y con los filtros para llevar a cabo más pruebas. 17 monitoreo personal requiere un pequeño sistema que viene con el compromiso de pocas muestras.
Hay muchos métodos para determinar los efectos de la exposición a un aerosol. El modelo ALI permite el aerosol ser administrado directamente a las células a través del aire como en un escenario de exposición real, sin embargo, es más rentable y menos tiempo intensivo que en vivo los estudios mientras que mímico las barreras de aire líquido como los ojos, piel y pulmones. Las células del pulmón en el ALI tienen la capacidad para generar una capa de polarizado,18,19 que produce características fisiológicas que se parecen al en vivo pulmón epitelio, incluyendo la producción de moco y surfactante en específico líneas de célula bronquial o alveolar, cilia bate,19 ensambladuras apretadas,19,20 y cell polarización. 18 cambios como estos pueden afectar la respuesta celular en los estudios de toxicidad. 21 además, ALI en vitro modelo resultados son a menudo más sensibles que las células expuestas mediante suspensión modelos22 y capaz modelo aguda en vivo inhalación Toxicidad. 23 , 24 por tanto, un sistema de exposición de ALI que es capaz de realizar mediciones dentro de la zona de respiración es un siguiente paso natural.
Al exponer las células a aerosol directamente a la fuente de emisión, se produce la investigación de los efectos de todos los gases, compuestos semi volátiles y partículas en la mezcla. Cuando la mezcla se recoge en un filtro, no se capturan los gases y compuestos volátiles y la mezcla entera no puede ser investigada. Además, la reconstitución de partículas en un polvo o una suspensión líquida puede conducir a la agregación o interacciones partícula-líquido, como la disolución, en suspensión líquida. 25 , 26 cuando se agregan partículas de aerosol al líquido, hay un mayor potencial para la formación de27 25,de corona de proteína,28 o interacción con los compuestos en el líquido, que puede afectar a la deposición, aglomeración y influir en la respuesta biológica. 29 , 30
Exposición en la ALI se basa en tres perfiles principales aerosol nube dirimentes, paralelo de flujo y flujo perpendicular. Nube de adaptación, utilizado por el aire líquido interfaz celular exposición (ALICE),4 es un sistema por lotes donde depositan las partículas gravitacionales y difusionales colocar como el aerosol es tratado como una unidad. Flujo paralelo, utilizado por el Aerosol electrostático en vitro exposición sistema (aleros)5 y Multicultura exposición cámara (MEC) II,6 permite la deposición mediante la adición de movimiento browniano a través del perfil de flujo. Flujo perpendicular, usado por un microsprayer,7 Nano cámara de Aerosol para la toxicidad In Vitro (NACIVT),11 y comercial ALI sistemas8,9,10,12, añade la impactación de partículas dentro de la región de deposición. Muchos de estos sistemas de exposición son grandes y voluminosos, que requieren sistemas de exceso para aerosol previamente acondicionado, bombas de flujo, o incluso la calefacción cámaras de incubación de las células. Este gran tamaño disminuye la portabilidad del sistema. En lugar de muestreo directamente a la fuente de emisión, estos sistemas tienen a menudo las muestras que el laboratorio o modelo aerosoles generados para el análisis. La complejidad de los aerosoles emitidos se puede perder en la traducción del campo al laboratorio. El PIVEC es más pequeño que los sistemas actuales, con una superficie externa de aproximadamente 460 cm2 y pesa sólo 60 gramos, con control de humedad y térmico incorporado en el sistema que permite a un dispositivo portátil. La disminución del tamaño y peso permiten que el sistema de ser usado o tomado a la fuente de exposición, permitiendo el muestreo directo.
El gran tamaño de los actuales sistemas de exposición también disminuye la capacidad para realizar el muestreo para investigar gradientes espaciales en las concentraciones. Esta resolución es clave para determinar los efectos toxicológicos de potencial ambiental y riesgos laborales como escape vehicular partículas materia o lugar de trabajo actividades donde se produce la aerosolización. Inmediatamente la emisión, allí se convierte en una variación espacial en la concentración de partículas. Esto crece con el tiempo las partículas se dispersan en la atmósfera y estos efectos pueden cambiar en base a las condiciones ambientales, como temperatura, presión, viento y sol. Las partículas pueden comenzar a la edad, así como una vez emitidos31,32 se oxida y las tasas de dispersión están afectadas por la topografía; concentraciones más altas se encuentran en cañones y túneles, donde efectos de dispersión se ralentizó, y concentraciones más bajas pueden encontrarse donde hay una gran área de dispersión. 33 estos cambios en las tasas de dispersión pueden tener efectos significativos sobre la salud humana y pueden verse al comparar el número de adultos asmáticos viven en urbanos y en entornos rurales. 34 mientras que los sistemas de exposición muchos proporcionan múltiples muestras a la vez, múltiples sistemas son necesarios con una abundancia de grandes equipos para realizar la resolución espacial.
Al llevar el laboratorio al campo, el momento del análisis puede reducirse mediante el uso de la célula entera como un sensor. Siguiendo criterios de valoración y los mecanismos biológicos conocidos puede ayudar en la determinación de la composición del aerosol y el tamaño. Debido a los métodos de remoción lenta, incluyendo depuración mucociliar, fagocitosis y desplazamiento, estas partículas son a menudo interactuando con las células para unos días a la semanas3 generadoras de estrés oxidativo, inflamación y hasta la muerte celular. Estos criterios de valoración biológicos pueden ser los puntos de partida para rutas de resultados adversos para la enfermedad cardiovascular o enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, Wiemenn et al realizó una serie de ensayos en vitro para comparar con los valores de la literatura para a corto plazo en vivo inhalación Toxicidad. 35 Respuesta in vivo fue predicho con dos de los cuatro resultados positivos de ensayos de citotoxicidad por liberación de lactato deshidrogenasa, el estrés oxidativo de glutatión reducción y peróxido de hidrógeno formación y liberación y potencial de la inflamación el gene alfa del factor de necrosis tumoral. De combinar diez óxidos metálicos probados, seis prueban como activo (óxido de titanio, óxido de zinc y óxido de cerio diferentes cuatro) mediante exposiciones in vitro con confirmación en vivo. 
Para estudiar los efectos de los aerosoles en un ámbito laboral, nuestro laboratorio desarrollado PIVEC para exposiciones en el campo. Además, el PIVEC puede usarse para que muestreo personal para vigilar e investigar la exposición por inhalación como el filtro de 37 mm cassette36 o sistemas múltiples pueden utilizarse para lograr la resolución espacial dentro de un área determinada. En este protocolo, se discute la caracterización y el uso de la PIVEC. Después de la exposición, los efectos biológicos se observan a través de ensayos de citotoxicidad.

<table><tbody><tr><td>Calibrador de partículas de movilidad de escaneo (SMPS)</td><td>TSI, Inc.</td><td>3910</td><td>NanoSMPS</td></tr><tr><td>Calibrador óptico de partículas (OPS)</td><td>TSI, Inc.</td>Tubo de acero inoxidable <td>3330</td><td></td></tr><tr><td>, 4" de largo</td><td>McMaster-Carr</td><td>4830K116</td><td>de pared estándar 304/304L, roscado en ambos extremos, tubo de 1/8 de tubo</td></tr><tr><td>Válvula de bola de latón con manija de palanca</td><td>McMaster-Carr</td><td>4112T12</td><td>Compacto de alta presión, 1/8 NPT Tubo</td></tr> de acero hembra, <tr><td>2" de largo</td><td>McMaster-Carr</td><td>7753K121</td><td>Pared estándar, roscada en un extremo, tamaño de tubo 1/8</td></tr><tr><td>HEPA filtro</td><td>GE Healthcare</td><td>09-744-12</td><td>HEPA-Cap Cápsula de filtración de aire desechable Generador</td></tr><tr>de<td>vacío</td><td>PISCO USA</td><td>VCH10-018C</td><td></td></tr><tr><td>PIVEC</td><td>VCU</td><td></td><td>Para el diseño, póngase en contacto con los autores</td></tr><tr><td>Calentador</td><td></td><td></td><td></td>resistivo</tr> de <tr><td>1/4" conectores de púas Zefon</td><td>International, Inc.</td><td></td><td></td>459743</tr><tr><td>Tubos porosos</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>BB2062-1814A</td><td>Hidrofílico 10 mmm poros</td></tr><tr><td>Banco de energía</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de batería Inserto de cultivo celular</td><td>Fisherbrand</td><td>353095</td><td>Inserto de placa de 24 pocillos</td></tr><tr><td>Pinza de filtro</td><td>Fisherbrand</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>ThermoScientific</td><td>13-711-27</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de fibra de vidrio</td><td>SKC</td><td>225-7</td><td>Tipo sin aglutinante Filtro AE 37 MM 1.00 mmm poro</td></tr><tr><td>Ultra Micro Balance A</td><td>& D</td><td>BM-22</td><td>Alojado en cámara ambiental</td></tr><tr><td>Casete de filtro de 37 mm</td><td>SKC</td><td>225-3250</td><td>Casete de filtro en blanco, 37 mm, estireno transparente</td></tr><tr><td>Bomba de vacío de flujo variable</td><td>SKC</td><td>220-5000TC</td><td>AirChek TOUCH, 5 a 5000 mL/min</td></tr><tr><td>Partículas de cobre</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1090</td><td>40 nm</td></tr><tr><td>Partículas de cobre</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1088</td> Partículas de cobre de <td>100 nm</td></tr><tr><td></td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1117M</td><td>800 nm</td></tr></tbody></table>

un nuevo portátil in vitro exposición cassette para el muestreo de aerosoles

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Este Protocolo introduce un nuevo en vitro exposición sistema, capaz de ser usado, incluyendo su caracterización y funcionamiento. Sistemas de interfaz de aire líquido (ALI) en vitro exposición suelen ser grandes y voluminosos, dificultando el transporte al campo y la operación en la fuente de emisión o dentro de la zona de respiración. A través de la miniaturización de estos sistemas, el laboratorio puede ser traído al campo, acelerar el tiempo de procesamiento y proporciona un método de exposición más apropiado que no altere el aerosol antes de ponerse en contacto con las células. El Portable In vitro exposición Cassette (PIVEC) adapta un casete de filtro de 37 mm para permitir en vitro toxicidad pruebas fuera de un entorno de laboratorio tradicional. El PIVEC fue caracterizado mediante tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar eficacia de deposición basada en gravimétrico y análisis número de concentración de partículas. Se realizaron experimentos de citotoxicidad inicial con células pulmonares expuestas para determinar la capacidad del sistema para depositar las partículas mientras que mantiene la viabilidad celular. El PIVEC proporciona una eficiencia de deposición similar o mayor al comparar a los dispositivos de flujo perpendicular disponible en vitro exposición. A pesar de la baja demanda, el tamaño pequeño le da algunas ventajas a la actual en vitro ALI sistemas de exposición. Estos incluyen la capacidad de ser usado para control de personal, movilidad del laboratorio a la fuente de emisión y la opción de configuración múltiples sistemas de resolución espacial manteniendo un usuario más bajo costo. El PIVEC es un sistema capaz de recoger los aerosoles en el campo y dentro de la zona de respiración en una interfaz de aire, en vitro modelo.

Toxicología ocupacional en vitro implica mantener la viabilidad celular mientras realiza la exposición de aerosoles. El sistema PIVEC se muestra en la figura 2, incluyendo la temperatura y control de humedad y la PIVEC desgastada. La temperatura se mantuvo utilizando un calentador resistivo pilas y aerosol humidificado con mayor humectación natural a través de un tubo poroso, húmedo. En un aerosol controlado ajuste dentro de un laboratorio, el PIVEC ...

Aquí, presentamos un protocolo para realizar exposiciones de aerosol celular portable y medir la respuesta celular. El método utiliza las células, cultivadas en la interfase aire-líquido, imitando en vivo fisiología. Respuesta celular a aerosoles de nanopartículas de cobre se observó como el estrés oxidativo a través de la generación de especies reactivas de oxígeno y la citotoxicidad como liberación de lactato deshidrogenasa.

Un nuevo portátil In Vitro exposición Cassette para el muestreo de aerosoles

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Este protocolo es significativo, ya que el PIVEC permite la exposición directa de un cultivo celular a aerosoles del mundo real. El sistema puede ser advertido para tomar muestras del mismo aire que una persona respira, lo que permite un nuevo tipo de monitoreo de la calidad del aire. La principal ventaja de esta técnica es la facilidad de capturar aerosoles en células pulmonares cultivadas en lugares inaccesibles para los sistemas de sobremesa, como en la fuente de admisión o dentro de la zona de respiración.Lynn Secondo, una recién graduada de mi laboratorio, y Nathaniel Wygal, un estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para este experimento, almacenó los materiales de prueba y el entorno controlado durante 24 horas antes de la prueba. Para montar el sistema de dispersión en seco, conecte la válvula de bola a un extremo de la tubería roscada de cuatro pulgadas de largo y tamaño 1/8.Esto sirve como la tolva de partículas. A través del extremo abierto de la tolva de partículas, poner en la cantidad deseada de nanopartículas de cobre. A continuación, cierre la tolva de partículas con otra válvula de bola.Conecte el tubo de dos pulgadas de largo, tamaño 1/8 a la válvula. Coloque un tubo exterior de tres pulgadas de largo y media pulgada alrededor del tubo de dos pulgadas. Inserte un filtro HEPA dentro del tubo corto, asegurando que la dirección del flujo sea a través de la válvula de bola.Con el roscado, conecte el generador de vacío a la otra válvula de bola. A continuación, conecte el generador de vacío al tanque de aire. Coloque tubos de diámetro exterior de 1/4 de pulgada sobre la salida del generador de vacío para conectarlo a la configuración experimental.Gire la válvula principal y las válvulas reguladoras del tanque de aire para ajustar el flujo deseado. Abra la válvula de bola, más cercana al filtro HEPA y luego abra la válvula de bola más cercana al generador de vacío. Manténgalos abiertos durante la caracterización o exposición antes de cerrarlos.Primero la válvula de bola más cercana al generador de vacío, y luego la válvula de bola más cercana al filtro HEPA. Cierre las válvulas principales y reguladoras del tanque de aire para detener el flujo. Para limpiar, utilice 70% de etanol para lavar las válvulas de bola y el generador de vacío.Ponga tubos metálicos en el autoclave para la esterilización. Después de cultivar las células en la interfaz del líquido del aire, permita que las células se equilibren durante 24 horas. Para montar, tome la base PIVEC con el pozo hacia arriba y conecte el adaptador de plaquita de cultivo celular en la parte superior.Añadir cuatro mililitros de medios de cultivo celular al pozo de la base del PIVEC utilizando una micropipeta. Utilice pinzas para colocar el inserto de referencia cultural de celda dentro del adaptador. Con la parte estrecha de la pieza superior PIVEC hacia arriba, conéctese al adaptador.Envuelva cuidadosamente PIVEC con una sola capa de cinta adhesiva. Empuje para conectar piezas de cassette de 37 milímetros en la parte superior e inferior de PIVEC. Coloque adaptadores de púas de 1/4 de pulgada en la entrada y salida del cassette.Envuelva el calentador resistivo alrededor de PIVEC con los cables en la base. Cinta para asegurar. Envuelva PIVEC con ocho rondas de papel de aluminio para aislamiento y asegúrelo con cinta adhesiva.Conecte el tubo de diámetro exterior de 1/2 pulgada al adaptador en la parte superior de PIVEC. Retire el tubo poroso del agua estéril y colóquelo dentro del tubo en la parte superior de PIVEC. Sistema de transferencia a la campana de humo y sujetar el PIVEC en el soporte del anillo y asegurar.Conecte PIVEC al sistema de aerosol conectando el tubo de 1/4 de pulgada de diámetro a la salida del generador de aerosoles al tubo poroso. Conecte la salida del PIVEC a un tubo de 1 x 4 pulgadas de diámetro que esté conectado a un filtro HEPA y a una bomba de vacío mediante un conector Y. Encienda las válvulas y ajuste el caudal de la bomba a 0,5 litros por minuto.Exponga las células a nanopartículas de cobre durante diez minutos antes de cerrar las válvulas y apagar la bomba. Retire PIVEC del sistema de aerosoles. Saque el inserto de cultivo celular con pinzas y colóquelo en la placa de pozo estéril para comenzar los ensayos biológicos deseados.Puntos de tiempo de exposición propuestos, vuelva a colocar el inserto en la incubadora de dióxido de carbono. Aspirar medios de PIVEC con un cuentagotas. Utilice 70%etanol para lavar PIVEC y esterilizarlo con luz ultravioleta durante al menos 30 minutos antes del siguiente experimento.El PIVEC se caracterizó utilizando tres tamaños de nanopartículas de cobre para determinar la eficiencia de la deposición. El aumento de la deposición se observa en general para el diseño de 24 pozos, luego el diseño de seis pozos. Disminuye ligeramente para 100 nanómetros en comparación con 40 nanometros y 800 nanometros de partículas de cobre.La concentración del número de partículas de aerosoles de nanopartículas de cobre se determinó mediante un dimensionador de partículas de movilidad de escaneo basado en filtros, así como mediciones de tamaño de partícula óptica. El análisis posterior a la exposición se puede acelerar determinando la relación de dosis entre el filtro de 37 milímetros y el inserto de cultivo celular. La comparación muestra una fuerte correlación para partículas de cobre de 800 nanómetros con un valor p inferior a 0,05.En comparación con los sistemas de exposición in vitro de flujo perpendicular en toda la literatura, la eficiencia de la deposición del PIVEC en el rango de los tamaños de partículas probados es comparable o aumenta con los valores notificados. Lo más importante a recordar es que aunque este protocolo demuestra el uso del PIVEC en un entorno de laboratorio, fue diseñado para medir las respuestas celulares a los aerosoles en el lugar de exposición. Al realizar pruebas in situ, es importante caracterizar la eficiencia de la deposición del aerosol de prueba.La eficiencia de la deposición determina la dosis depositada de partículas a las que están expuestas las células. Se pueden realizar ensayos biológicos adicionales para investigar más puntos finales de respuesta celular debido a la exposición. El PIVEC se ha utilizado para evaluar la respuesta celular debido a aerosoles generados durante los procesos de impresión 3D, como el chorro de aglutinante de metal, y la fabricación de filamentos fusionados.El uso de nanopartículas, particularmente en forma de aerosol, puede ser peligroso y cualquier exposición debe realizarse en una campana de humos. El trabajo celular debe realizarse en un gabinete de biosemase.

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Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

Este video muestra la generación de aerosoles de drogas y la administración dirigida de estos aerosoles solo por nariz a ratones utilizando una unidad de inhalación equipada con un generador de aerosoles. El ratón se sujeta en un sistema de retención solo para la nariz y se conecta a la unidad de inhalación, que administra el medicamento directamente en la cavidad nasal del ratón. Posteriormente, el fármaco pasa a través de la tráquea y entra en los pulmones.

Una técnica para generar y administrar aerosoles de medicamentos directamente a los pulmones de los ratones

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Whole-Body nanopartículas exposición por inhalación de aerosoles

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VacuSIP, un método mejorado para InEx<em&gt; In Situ</em&gt; Medición de las partículas y compuestos disueltos procesada por Alimentadores Active Suspension

Determinación de la diversidad fúngica dentro de un entorno es un método utilizado en los estudios de salud ocupacional para identificar riesgos para la salud. Este protocolo describe la extracción de ADN de muestras de aire ocupacional para la amplificación y secuenciación de regiones ITS hongos. Este método detecta muchas especies de hongos que pueden ser pasada por alto por los métodos de evaluación tradicionales.

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Un anión intercambio método basado en la resina, adaptado para muestreo de bioaerosol basado en el choque de los virus se demuestra el líquido. Cuando se combina con detección molecular aguas abajo, el método permite la detección fácil y sensible de virus de bioaerosoles.

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Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.

Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad

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