En Vitro modelo de diferenciación de células de memoria humana Normal B a células plasmáticas duradero

Las células plasmáticas son células raras con 30 etapas de diferenciación que tienen lugar en lugares anatómicos que deterioran la caracterización biológica completa, particularmente en humanos. Nuestro modelo de diferenciación de células plasmáticas B2 in vitro reproduce la diferenciación celular secuencial y la maduración que ocurre en los diferentes órganos in vivo. Este modelo in vitro recapitula los cambios transcripcionales coordinados y el fenotipo de las diferentes etapas de las células plasmáticas B2 que se pueden detectar in vivo.

También construimos herramientas bioinformáticas de acceso abierto para analizar la información más prominente a partir de datos de exploración relacionados con la diferenciación de células plasmáticas. Demostrando el procedimiento estará Hugues de Boussac, un postdoctorado de mi laboratorio. Para empezar, obtener células sanguíneas periféricas de voluntarios sanos para la purificación de la célula B de la memoria.

Diluir 7,5 mililitros de sangre con 24,5 mililitros de RPMI 1640 medio. A continuación, añada 12,5 mililitros de gradiente de densidad de temperatura ambiente a un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Superponga suavemente el gradiente de densidad con los 32 mililitros de sangre diluida, asegurándose de minimizar la mezcla de las dos fases.

Centrifugar durante 20 minutos a 500 veces la gravedad con el freno apagado. Recoger las células mononucleares de sangre periférica de la interfaz de plasma diluido y gradiente de densidad. Transfiera las células a un tubo estéril de 50 mililitros y llene el tubo hasta 45 mililitros con la solución de sal equilibrada de Hank.

Centrifugar a 500 veces la gravedad durante cinco minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y conserve el pellet. A continuación, añadir 45 mililitros de RPMI 1640 medio, complementado con 10%FCS.

Centrifugar a 500 veces la gravedad durante cinco minutos. Retire con cuidado el sobrenadante y conserve el pellet. Añadir 30 mililitros de PBS, complementados con 2%FCS.

Utilice perlas magnéticas anti-CD para eliminar las células CD2 positivas agregando cuatro cuentas para una célula de destino. Incubar a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Usando un imán para la aplicación de separación de celdas, separe las celdas unidas al cordón de las celdas sin enlazar.

Recoger las células no unidas e incubarlas con anticuerpos anti-CD19 APC y anti-CD27 PE durante quince minutos a cuatro grados Celsius. Lavar las células dos veces en PBS que contiene 10%suero de cabra. A continuación, utilice el clasificador de celdas para purificar las células B de memoria a una pureza del 95%.

Después de esto, agregue el ligando soluble CD40 y el anticuerpo monoclonal anti-polihistidina para la activación de la célula de memoria B. Placa las células de memoria purificada B en placas de cultivo de seis pozos durante cuatro días con interleucina-2, interleucina-10 e interleucina-15. Para el perfilado de expresión génica, utilice un clasificador de células para purificar los preplasmablasts CD20 negativos CD38 en el cuarto día.

En el cuarto día, cuente las células y placúelas en placas de cultivo de 12 pozos a una densidad celular de 250.000 células por mililitro añadiendo dos mililitros de suspensión celular en cada pozo. Para inducir la diferenciación, retire los oligonucleótidos cpG y el ligando soluble CD40 y agregue un nuevo medio de cultivo que contenga un nuevo cóctel de citoquinas que incluya interleucina-2, interleucina-6, interleucina-10 e interleucina-15. Cultiva las células durante tres días a 37 grados centígrados.

Para el perfilado de expresión génica, utilice un clasificador celular para purificar los plasmablastos CD38 positivos, CD20 negativos en el día siete. En el día siete, cuente las células. Placar las células en placas de cultivo de 12 pozos a una densidad celular de 500.000 células por pozo, mediante la adición de dos mililitros de suspensión celular a cada pozo.

Diferenciar los plasmablastos en células plasmáticas tempranas utilizando un medio de cultivo fresco que contiene interleucina-6, interleucina-15 e interferón-alfa durante tres días a 37 grados Celsius. Para el perfilado de expresión génica, utilice un clasificador celular para purificar las células plasmáticas tempranas CD20-negativas, CD38-positivas y POSITIVAS CD138 en el día 10. En primer lugar, el cultivo de células estromales durante cinco días con medio de cultivo.

Utilice un filtro de 0,2 microlitrotro para filtrar el sobrenadante de cultivo celular estromal para obtener el medio condicionado por células estromales y congelar hasta que esté listo para usar. A continuación, cultivo de las primeras células plasmáticas en placas de cultivo de 12 pozos, utilizando el medio celular estromal previamente obtenido con interleucina-6 y APRIL a una densidad celular de 500.000 células por pozo, mediante la adición de dos mililitros de suspensión celular a cada pozo. Incubar a 37 grados centígrados, renovando el medio condicionado de células estromales cada semana.

Luego, mida la secreción de inmunoglobulina a partir de células plasmáticas ordenadas por citometría de flujo. Cultivo de las células plasmáticas a una densidad de un millón de células por mililitro durante 24 horas y cosechar el sobrenadante de cultivo. Con un kit ELISA, mida la inmunoglobulina G y la inmunoglobulina A.First, inicie la herramienta web web de bioinformática de acceso abierto GenomicScape.

En el menú Examinar datos, seleccione el conjunto de datos denominado Células B humanas a celdas de plasma. La visualización del perfil de expresión génica de un gen único o una lista de genes está disponible mediante la herramienta Informe de expresión/coexpresión de las Herramientas de análisis. A continuación, seleccione Herramientas de análisis webSAM para cargar la herramienta SAM.

Elija el dataset de células B humanas a células plasmáticas y seleccione el grupo de muestras para comparar. Utilice los diferentes filtros disponibles para aplicar las opciones de filtrado de interés. Para comparar perfiles de expresión génica con la herramienta SAM, modifique las opciones de filtrado, incluido el cambio de pliegue, el número de permutaciones, la tasa de detección falsa y el tipo de comparación.

El software calculará el análisis y proporcionará genes expresados diferencialmente entre los grupos seleccionados. En este estudio, se investigan los cambios de expresión de los factores epigenéticos en la diferenciación normal de células plasmáticas. Utilizando el análisis SAM multi clase, Se observa que 71 genes se expresan significativamente diferencialmente entre las células B de la memoria, los preplasmablasts, los plasmablastos, las células plasmáticas tempranas y las células plasmáticas de la médula ósea con una tasa de descubrimiento falsa de menos del 5%La etapa celular de la memoria B se caracteriza por la sobreexpresión de 23 genes de jugadores epigenéticos, incluyendo el 39,13% de sus acetiltransferasas, 30,43% de sus , 21,74%de las demetilasas de histona, 4,35% de las proteínas de unión a metilo y 4,35% de las deacetilasas de histona.

14 genes de jugadores epigenéticos se sobreexpresan significativamente en la etapa de preplasmablast, incluyendo el 50% de las metiltransferasas histonasas, el 14,28% de las metiltransferasas de ADN, el 21,43% de las deacetilasas de histona, el 7,14% de las desmetilasas de histona y el 17,14% de su acetiltransferasas. Tras este procedimiento, se podrían realizar varios análisis para identificar y comprender las modificaciones en la estructura y arquitectura de la cromatina durante estas diferenciaciones de células plasmáticas B2. Este modelo de diferenciación in vitro permitirá generar suficientes células para completar este análisis molecular para revelar tanto las vías implicadas en todo este modelado como su impacto transcripcional posterior durante la diferenciación de células plasmáticas B2.

Este conocimiento derivado de esta investigación podría informar e instruir sobre estrategias diagnósticas y terapéuticas para trastornos de células plasmáticas, como en el caso del mieloma múltiple, un cáncer sin cura definitiva, para el cual se necesita un mejor pronóstico y mejores estrategias terapéuticas. Caracterizar y comprender los cambios estructurales y arquitectónicos de remodelación epigenética que afectan a la cromatina durante la diferenciación de células plasmáticas B2 será de particular interés. Esto podría hacerse utilizando la secuenciación de genes, ERRBS, secuenciación ATAC, secuenciación de IC y ARN.

Se pudo observar una heterogeneidad moderada en el porcentaje de células B activadas, preplasmablasts, plasmablastos y células plasmáticas, dependiendo de la sangre sana del donante, utilizada para la purificación de células B de memoria.