Name: Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a evaluar respuestas inmunes y eficacia de vacunas en ratones usando modelos in vivo. Este protocolo permite medir carga bacteriana y reacciones del huésped para desarrollo de vacunas.

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Este trabajo fue financiado por los fondos de 1R01AI125560-01 y puesta en marcha de la Universidad Estatal de Ohio.

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<li>Raeven, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+signatures+underlying+superior+immunity+against+Bordetella+pertussis+upon+pulmonary+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination.</a> Mucosal Immunology. 11 (3), 1009(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo completo que se describe aquí para estudiar la inmunidad inducida por la vacuna a la infección por B. pertussis también permitirá la evaluación de las respuestas del anfitrión a una variedad de otros patógenos. El protocolo describe métodos para entregar vacunas, determinar el siguiente de eficacia de vacuna desafío patógeno y disección paralela de la función inmune. En la adaptación del protocolo para el estudio de otros patógenos, varios parámetros tendría que modificarse. Éstos incluyen, pero no ...

Las vacunas representan uno de los mayores logros de salud pública del siglo XX, sin embargo, todavía no entendemos los mecanismos por el cual las vacunas exitosas estimulan inmunidad protectora. La identificación de firmas moleculares (ej., marcadores de activación de la célula, expansión de subtipos celulares y los patrones de expresión génica) inducida después de la vacunación proporciona una gran cantidad de información para predecir y generar una eficaz respuesta inmune. La complejidad de las respuestas del huésped-patógeno no puede replicarse adecuadamente usando in vitro de la célula cultura sistemas1. En vivo vacuna modelos están diseñados para evaluar concomitante varios tipos de células inmunitarias en el host. Esto proporciona una ventaja al caracterizar el procesamiento de antígeno de vacuna y presentación, secreción de citocinas diferencial y expansión de células inmunes. El protocolo descrito aquí proporciona un método detallado para determinar la eficacia de la vacuna a través de la evaluación de la respuesta inmune local y sistémica y la cuantificación de la carga del patógeno en los tejidos de interés. El ejemplo proporcionado aquí pruebas de la eficacia de una vacuna experimental para el patógeno Bordetella pertussis (B. pertussis).
B. pertussis es una bacteria gram negativa que es el agente etiológico de la enfermedad respiratoria tos ferina (pertusis)2,3. Contacto cercano con personas infectadas (sintomáticas o asintomáticas) conduce a la transmisión, la colonización y la enfermedad. A pesar de vacuna global significativa cobertura4, la tos ferina es considerada una resurgimiento de la enfermedad en muchas naciones del mundo y es una causa importante de muertes infantiles prevenibles5,6,7, 8. en el año 2015, B. pertussis y la tos ferina se incluyeron en el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) emergentes lista de patógenos/enfermedades infecciosas, haciendo hincapié en la necesidad de desarrollo de una vacuna mejor que confiere inmunidad protectora de larga duración.
Actualmente, un área activa de investigación para controlar la reaparición de la tos ferina es desarrollo de una vacuna de tos ferina acelular de última generación (aPV) con una combinación óptima de nuevos adyuvantes y antígenos para imitar la respuesta inmune provocada por los celulares tos ferina vacuna (wPV)9. Utilizando el protocolo descrito, recientemente informó que la modificación de un actual aprobado por la FDA aPV por la adición de un nuevo adyuvante, factor de colonización de Bordetella A (BcfA), dio lugar a la reducción más eficiente de la carga bacteriana de B. pertussis de los pulmones de ratón de10,11. Esta protección fue acompañada por el sesgo de una respuesta inmunitaria en Th1/Th2 con alum-inducida a la más protectora de perfil inmune Th1/Th1710. Este protocolo es detallada y completa, lo que permite al investigador a obtener la máxima información a través de una evaluación concomitante de acogida y respuesta inmunitaria a una variedad de patógenos.
El protocolo descrito aquí sigue el calendario de vacuna representativas, que se muestra en la figura 1, para asegurar la óptima anfitrión inmunorespuestas.

<table><tbody><tr><td>Cámara de inducción 2L</td><td>Vet Equip</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>Vet</td><td>One V1 501017</td><td>cualquier marca es apropiada</td></tr><tr><td>Bordet Gengou Agar Base</td><td>BD bioscience</td><td>248200</td><td></td></tr><tr><td>Caseína</td><td>Sigma</td><td>C-7078</td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Casamino</td><td>VWR</td><td>J851-500G</td><td>Colador Scholte (SS) Componentes de los medios</td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td><td>Productos de investigación Int</td><td>G36020-500</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Productos de investigación Int</td><td>P50200-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Fisher</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher</td><td>C75-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína HCl</td><td>Fisher</td><td>BP376-100</td><td>SS suplementos de medios</td></tr><tr><td>Sulfato ferroso heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>F-7002</td><td></td></tr><tr><td>Niacina</td><td>Productos de investigación Int</td><td>N20080-100</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión</td><td>Productos de investigación Int</td><td>G22010-25</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Productos de investigación Int</td><td>A50040-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442-500mL</td><td>&nbsp; cualquier fuente de EE. UU.,</td></tr><tr><td>gentamicina</td> no inactivada por calor <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoetanol</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>15mL molinillo de pañuelos Wheaton</td><td></td><td>357544</td><td>cualquier marca similar es apropiada</td></tr><tr><td>Homogeneizador de mano inalámbrico</td><td>Kontes/Sigma&nbsp;</td><td>Z359971-1EA cualquier</td><td>marca similar es apropiada</td></tr><tr><td>Instrumentos: tijeras, tijeras curvas, pinzas, pinzas finas, separadores</td><td></td><td></td><td>triangulares cualquier marca es apropiada</td></tr><tr><td>Jeringas de 3 ml</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>339651</tr><tr><td>tubos de microfuga de 1,5 ml Denville</td><td></td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>filtros de celdas de 70um</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>22363548</tr><tr><td>placas de 60 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 1 ml 28G1/2</td><td>Fisher Scientific/Excel Int.</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-21</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-173-77</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit</td><td>Invitrogen / eBioscience</td><td>50-172-09</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Las vacunas son una 20 maravilla médica de sigloXX . Han reducido considerablemente la morbilidad y la mortalidad causada por enfermedades infecciosas y contribuyó a un notable aumento esperanza de vida alrededor del mundo. Sin embargo, determinar la eficacia de la vacuna sigue siendo un desafío. Emergentes de la evidencia sugieren que la actual vacuna acelular (aPV) para Bordetella pertussis (B. pertussis) induce inmunidad subóptima. Por lo tanto, un reto es diseñar una vacuna de nueva generación que induce inmunidad protectora sin los efectos secundarios adversos de una vacuna de células enteras (wPV). Aquí se describe un protocolo que se utilizó para probar la eficacia de un coadyuvante prometedor, la novela que sesga las respuestas inmunes a un fenotipo Th1/Th17 protección y promueve una mejor separación de un desafío B. pertussis en el tracto respiratorio murine. Este artículo describe el protocolo para la inmunización del ratón, inoculación bacteriana, tejidos y análisis de la respuesta inmune. Usando este método, dentro de nuestro modelo, hemos aclarado con éxito mecanismos cruciales provocados por una vacuna de tos ferina acelular prometedor, de última generación. Este método puede ser aplicado a cualquier modelo de enfermedad infecciosa para determinar la eficacia de la vacuna.

El modelo descrito muestra un método para evaluar la eficacia de la vacuna y las respuestas inmunitarias durante interacciones huésped-patógeno. La figura 1 muestra el calendario de vacuna representante para inmunizar e infectar ratones y tejidos para el análisis de la cosecha. Figura 2 se muestra la configuración del sistema de anestesia empleado para inducir a ratones, permitiendo a los investigadores ofrecer vacunas y el inocu...

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

El protocolo permite evaluar las respuestas del huésped a una variedad de patógenos y formulaciones de vacunas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación de la carga bacteriana y las respuestas inmunitarias in vivo, utilizando un modelo animal manejable. Demostrando este procedimiento está Kacy Yount, una estudiante graduada de mi laboratorio.Para la inmunización, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anestesado de seis a doce semanas de edad, y cargue una jeringa de insulina de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 28,5 con un mililitro de 0,1 mililitros de la vacuna de interés. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de 45 grados, con el bisel hacia arriba, inserte la aguja aproximadamente cinco milímetros en el deltoides del ratón e inyecte la vacuna. Mantenga la aguja insertada en el músculo durante cinco a diez segundos, luego gire la jeringa 180 grados, de modo que el bisel esté mirando hacia abajo para crear un sello, y para evitar la fuga de la vacuna, antes de retraer lentamente la aguja del lugar de inyección.A continuación, vuelva el ratón a su jaula, con monitoreo, hasta la recuperación completa. Unas dos semanas después de aumentar, infectar ratones inmunizados. Sujete un ratón anestesiado por el escrúpulo del tórax dorsal, detrás de los omóplatos y el cuello, y coloque el ratón erguido para acceder a la nariz.Usando una punta de pipeta de 200 microlitros, aplique lentamente de 20 a 25 microlitros del inóculo bacteriano de interés a cada nare del animal, sosteniendo el ratón hasta que se haya inhalado todo el inóculo. A continuación, entregue un volumen igual de PBS estéril a un grupo de ratones como control negativo. En el punto final experimental apropiado, coloque un lado ventral del ratón infectado hacia arriba en una placa de disección y asegure las extremidades.Humedezca el cuerpo con 70%etanol, y use fórceps para sujetar la piel debajo del abdomen en el centro de la pelvis. Usando tijeras afiladas, haz un corte vertical hasta la mandíbula, y disecciona la piel de la pared peritoneal. Mueva la piel a los lados de la carcasa para crear un campo sin obstáculos para la recolección de órganos estériles, y agarre el peritoneo intacto debajo de la caja torácica, en o cerca del hígado.Corte el peritoneo hacia la caja torácica para exponer el tracto digestivo inferior, y mueva el colon a la izquierda para revelar el bazo. Usando fórceps curvos, agarre el bazo y disecciona el tejido conectivo con tijeras. A continuación, coloque el bazo en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 3 mililitros de RPMI y un 5% de suero bovino fetal sobre hielo.Utilice fórceps para estabilizar la caja torácica en el proceso de xyfoide y abra el diafragma. Los pulmones deben desinflarse y caer hacia la columna vertebral. Abra la caja torácica en los lados para extraer la mama, y corte las arterias y venas pulmonares para aislar y eliminar el lóbulo superior del pulmón derecho.Fijar el lóbulo en un tubo cónico de 15 mililitros de formalina tamponada 10% neutral a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, y aislar los lóbulos restantes de los pulmones derecho e izquierdo. A continuación, coloque los lóbulos en un tubo cónico de 15 mililitros, que contiene dos mililitros de 1% de caseína en PBS sobre hielo. Usa un pipetman de un mililitro con punta para recoger la sangre que llena la cavidad torácica, y transfiere la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado sobre hielo.Retire las glándulas parótidas, sublinguales y submaxilares y ganglios linfáticos que cubren la tráquea, y abra y retire las membranas protectoras que rodean la tráquea. Usando fórceps finos y tijeras, separe cuidadosamente la tráquea del esófago, y cualquier otro tejido conectivo desde la parte superior de las clavículas hasta la parte inferior de la mandíbula. Use fórceps para sostener la tráquea y corte la tráquea en la parte superior de la clavícula.Tire hacia abajo de la tráquea para maximizar la elasticidad, y corte la tráquea en la parte inferior de la mandíbula, justo por encima de la laringe, aislando alrededor de un centímetro de tejido. A continuación, coloque el órgano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado, que contenga 0,3 mililitros de 1% de caseína en PBS sobre hielo. Ahora gire el ratón para un acceso claro a la nariz, y rocíe la cabeza con 70%etanol.Agarre manualmente el animal directamente detrás del cráneo, y use tijeras para cortar la carne suave del hocico, comenzando desde la parte inferior de la nariz y moviéndose hacia arriba. Retire el pelaje, la piel y los bigotes de alrededor de la nariz, e inserte las puntas de un par de tijeras curvas en las narinas con las curvas apuntando hacia abajo. Abre el conducto nasal hacia los ojos, creando una formación similar a la V.A continuación, utilice fórceps finos para recoger el tabique nasal y el tejido blando dentro de la formación, y coloque el tejido en un tubo de microcentrífuga preetiquetado de 1,5 mililitros que contenga 0,3 mililitros de 1% de caseína en PBS, sobre hielo. Para procesar el tejido pulmonar, transfiera todo el contenido del tubo de muestra pulmonar a un homogeneizador estéril de Dounce de 15 mililitros, y use un pestillo para homogeneizar el tejido. Disociar la muestra hasta que no queden grandes partículas de tejido, y devolver la suspensión homogeneizada al tubo original de 15 mililitros.Retire una alícuota de 0,3 mililitros para encoger unidades formadoras de colonias, y recoja el resto del homogeneizar por centrifugación. Aliquot 0,5 mililitros de sobrenadante en tubos de microcentrífuga preetiquetados para su almacenamiento a 20 grados Celsius hasta el análisis de expresión de citoquinas por Eliza. A continuación, diluir en serie 0,1 mililitros alícuotas de la suspensión pulmonar homogeneizada de reserva de set en 0,9 mililitros de PBS estériles por dilución, y utilizar un esparcidor de triángulo estéril para la placa de 0,1 mililitros de cada dilución elegida empíricamente en placas preetiquetados 10%Bordet-Gengou más estreptomicina.Aquí, se muestran mediciones y cálculos representativos de densidad óptica 600 para lograr una suspensión bacteriana de una densidad óptica, para preparar un inóculo bacteriano diluido cien veces más para ser entregado a ratones. Después de siete días de estimulación del antígeno vacunal, las células del bazo inmunizadas del grupo de la vacuna combinada producen interferón gamma, y IL17, mientras que regulan significativamente IL5, promoviendo un ayudante T, un ayudante T 17 polarización de la respuesta inmune durante una infección por tos ferina B. La enumeración de la unidad formadora de colonias de bacterias recuperadas de problemas respiratorios de un ratón infectado por tos ferina B se puede utilizar para evaluar los efectos protectores de la vacuna de interés.Trabajar tan rápido y lo más eficientemente posible con el fin de evitar la necrosis tisular, y almacenar el tejido aislado en el hielo para preservar la viabilidad de las bacterias recuperadas. La citometría de flujo ELISpot y el aislamiento de ADN y ARN se pueden realizar para evaluar las células inmunitarias, la producción de analitos y para permitir análisis epigenéticos y transcriptómicos. Cuando se trabaja con agentes infecciosos como La tos ferina de Bordetella, es importante recordar usar el EPP adecuado y trabajar en un gabinete de bioseguridad certificado para evitar la transmisión de patógenos.Este protocolo detalla la enumeración de la CFU desde el tracto respiratorio, específicamente la faringe nasal. Para abordar preguntas en la vacuna y los campos de enfermedades infecciosas sobre cómo atacar la colonización bacteriana en la nariz.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, describimos un protocolo para probar la eficacia de una vacuna acelular contra la tos ferina contra la infección por Bordetella pertussis en ratones. Después de la vacunación, los ratones se sometieron a la infección y su homogeneizado de tejido se cultivó para analizar las colonias bacterianas como una lectura de la inmunidad protectora inducida por la vacuna.

Evaluación de la inmunidad inducida por vacunas contra la infección bacteriana en un modelo de ratón

La respuesta inmune del huésped a la infección por patógenos es un proceso estrechamente regulado. Utilizando un modelo de exposición de pulmón lipopolisacárido en los ratones, es posible llevar a cabo las evaluaciones de alta resolución de los complejos mecanismos asociados con la patogénesis de la enfermedad.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

Los modelos animales han demostrado ser herramientas muy valiosas en la definición de mecanismos de acogida y de patógenos específicos que contribuyen al desarrollo de la inflamación crónica. Aquí se describe un modelo de ratón de infección oral con el patógeno humano Porphyromonas gingivalis y metodologías detalle para evaluar la progresión de la inflamación en sitios locales y sistémicos.

Un modelo de ratón para Patógenos inducida inflamación crónica en los sitios locales y sistémicos

En este trabajo detallamos la metodología seguida para comparar la eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar inducida por la inmunización intranasal y subcutánea con BCG en un modelo de ratón. Nuestros resultados muestran los beneficios de la vacunación pulmonar y sugieren un papel de la respuesta mediada por IL17 en la protección inducida por la vacuna.

La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

Este protocolo describe cómo inocular ratones C57BL / 6J con la cepa EGD de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) y para medir el interferón-γ (IFN-γ) las respuestas de las células asesinas naturales (NK), células T asesinas naturales (NKT), y adaptativa linfocitos T después de la infección. Este protocolo también describe cómo llevar a cabo estudios de supervivencia en ratones después de la infección con una dosis DL50 modificada del patógeno.

La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Se describe un enfoque para la detección en tiempo real de la respuesta inmune innata a heridas cutáneas y la infección de Staphylococcus aureus de los ratones. Por que comparan LysM-EGFP ratones (que poseen fluorescentes neutrófilos) con un LysM-EGFP mestizas cepa de ratón inmunodeficiente, avanzar en nuestra comprensión de la infección y el desarrollo de enfoques para combatir la infección.

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.

Evaluación de las células auxiliares foliculares T y la respuesta del centro germinal durante la infección por el virus de la gripe A en ratones

Aquí, presentamos un método efectivo y eficiente para las inyecciones de venas de la cola de roedores utilizando un dispositivo de calentamiento / restricción de diseño único. Al agilizar el inicio de los procesos de vasodilatación y restricción, este protocolo permite inyecciones intravenosas precisas y oportunas de grandes grupos de animales con una angustia mínima.

Un dispositivo contemporáneo de calentamiento / restricción para inyecciones eficientes de venas de la cola en un modelo de sepsis fúngica murina

El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

Aprende a evaluar respuestas inmunes y eficacia de vacunas en ratones usando modelos in vivo. Este protocolo permite medir carga bacteriana y reacciones del huésped para desarrollo de vacunas.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

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